益气活血汤治疗腰椎间盘退变的网络药理学及大鼠尾椎间盘穿刺验证

摘要

本研究采用网络药理学、分子对接以及大鼠尾椎间盘穿刺模型，探讨益气活血汤对腰椎间盘退变的潜在临床前作用，重点关注AKT1、BCL2和STAT3等候选靶点，以及PI3K-AKT信号通路等机制。

摘要

本研究采用网络药理学、分子对接、分子动力学模拟及实验验证，探讨益气活血汤（YQHXD）在腰椎间盘退变（LDD）中的药理学基础及潜在分子机制。共鉴定出YQHXD的678个活性化合物相关靶点和296个潜在的LDD相关治疗靶点。通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析和拓扑学分析，筛选出多个候选靶点，包括AKT1、IL6、TNF、BCL2和STAT3。基因本体（Gene Ontology）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析表明，这些候选靶点与蛋白质结合和ATP结合等功能相关，通路富集主要涉及PI3K-AKT信号通路。分子对接预测了槲皮素、四氢原小檗碱A（Tetraneurin A）和异鼠李素等选定活性化合物与核心靶点之间的相互作用。分子动力学模拟进一步表明，最低能量复合物保持稳定。将70只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组、阳性对照组以及低、中、高剂量YQHXD组。在模型组、阳性对照组和YQHXD组建立尾椎间盘穿刺模型后，给予YQHXD或塞来昔布灌胃治疗8周，而对照组和假手术组给予生理盐水。组织病理学评估显示，YQHXD治疗可减轻该模型中的椎间盘退变程度。酶联免疫吸附测定、聚合酶链式反应和蛋白质印迹分析显示，所选靶点（包括AKT1、BCL2和STAT3）的mRNA和蛋白质表达水平发生改变。这些结果提示，YQHXD可能通过多成分、多靶点调控，涉及炎症和凋亡相关机制，在LDD中发挥临床前保护作用。本研究为YQHXD用于LDD的进一步研究提供了初步的临床前证据。

引言

腰椎间盘退变（LDD）是一种常见的与年龄相关的骨科疾病，其特征是发病较晚、治疗困难、复发率高，并可导致功能障碍。LDD涉及椎间盘（IVD）细胞外基质（ECM）分解代谢与合成代谢失衡所引起的退行性病理改变，且与下腰痛（LBP）密切相关¹。流行病学研究表明，下腰痛是临床实践中导致功能障碍的主要原因之一²。

从1990年到2017年，全球病例数从4250万例增加至6490万例³，影响了患者的日常生活，并带来了重大的社会和经济负担。因此，有效治疗腰椎间盘退变（LDD）在临床上仍具有重要意义。在临床实践中，LDD通常采用保守治疗或手术对症治疗，这些方法可缓解症状，但通常无法逆转椎间盘退变（IVDD）。保守治疗中常用的口服非甾体抗炎药也可能伴随肾脏、胃肠道和心血管系统的不良反应。

中医（Traditional Chinese Medicine, TCM）长期以来被用于疾病管理⁴。已有研究报道，中药复方及其单体成分可延缓椎间盘退变（IVDD）的进展并促进组织再生⁵。在临床实践中，中医方剂也被用作退行性骨与关节疾病保守治疗策略的一部分。苏州地区的吴氏医学流派将益气活血汤（Yi Qi Huo Xue Decoction, YQHXD）作为腰椎间盘疾病的核心处方；然而，仍需进一步的机制研究证据以明确其在腰椎间盘退变（LDD）中的潜在作用。

既往研究表明，益气活血方（YQHXD）可能通过促进细胞自噬和发挥抗衰老作用来延缓椎间盘退变（IVDD）^6,7。然而，YQHXD 影响腰椎间盘退变（LDD）的药理机制尚不明确，其作用模式的系统性分析仍缺乏。本研究采用网络药理学方法分析 YQHXD 在治疗 LDD 中的多成分、多靶点特征。通过分子对接评估化合物与靶蛋白之间的相互作用，并进一步进行分子动力学模拟。随后利用大鼠尾椎间盘穿刺模型验证上述预测结果，以探究 YQHXD 在 LDD 中的潜在作用机制⁸。如图1所示，本研究提供了临床前证据，表明 YQHXD 可能通过调控 AKT1、BCL2 和 STAT3 等基因和蛋白，影响与 PI3K-Akt 信号通路及其他疾病相关通路类别相关的 LDD 进程。

方案

所有实验均经南京中医药大学机构审查委员会批准（方案编号：202501A018），并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行。所有实验操作均遵循ARRIVE指南。

实验用药
益气活血方（YQHXD）样品溶液包含20 g黄芪（Astragalus membranaceus）根、20 g当归（Angelica sinensis）根、15 g川芎（Ligusticum chuanxiong）根茎、6 g防己（Stephania tetrandra）根、15 g木瓜（Chaenomeles speciosa）果实以及10 g白芥子（Sinapis alba）成熟种子，每剂总生药量为86 g。所有中药材均由广西中医药大学附属瑞康医院药学部依据《中华人民共和国药典》（2020年版）进行鉴定。YQHXD样品溶液采用水煎法制备：加入相当于总生药量8倍体积的无菌蒸馏水，浸泡30分钟至药材完全浸透，随后煮沸并用小火煎煮30分钟，过滤。药渣按相同方法用同体积无菌蒸馏水再次提取。两次提取的滤液合并后，采用旋转蒸发法减压浓缩至55.5 mL，得到YQHXD储备液。根据总生药重量计算，最终生药浓度为1.55 g/mL，提取率约为64.5%。实验大鼠给药剂量通过体表面积归一化法由成人临床剂量换算而来。人与大鼠之间的换算系数约为6.3，因此大鼠剂量（mg/kg）= 人剂量（mg/kg）× 6.3。高剂量组给药剂量为15.48 g/kg/天作为参考剂量，中剂量组和低剂量组分别为7.74 g/kg/天和3.87 g/kg/天。按灌胃体积10 mL/kg计算，高、中、低剂量组相应的工作浓度分别为1.548、0.774和0.387 g/mL。给药前，将储备液按各实验组目标剂量要求稀释至相应浓度。制备完成后，药液冷却，在无菌条件下分装，并于−40 °C保存备用。

网络药理学分析

活性成分靶蛋白预测
2025年11月24日，通过在TCMSP数据库中以“黄芪、当归、川芎、防己、木瓜、芥子”为关键词检索获得活性化合物。根据口服生物利用度（OB ≥ 30%）和类药性（DL ≥ 0.18）对化合物进行筛选⁹。设定这些阈值的依据如下：TCMSP数据库整合了来自PubChem、ChEMBL和ChemSpider等权威资源的化合物数据，并提供了包括口服生物利用度在内的ADME相关参数。口服生物利用度是指口服给药后进入体循环且未发生改变的药物比例，较高的OB值对于识别具有生物活性的分子至关重要。类药性是用于评估化合物成药潜力的指标，可用于预测其溶解性和稳定性。本研究采用了更为严格的OB阈值（≥30%），高于数据库推荐值（≥20%），以筛选出具有良好口服吸收特性和药代动力学特征的候选化合物。同时，采用DL指标评估化合物的类药潜力，并基于中药化合物中观察到的平均DL值设定DL ≥ 0.18作为截断标准。筛选获得的活性化合物以SMILES格式从PubChem数据库中获取，并导入SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测，物种设定为Homo sapiens。使用官方基因符号对靶蛋白进行标准化处理，仅保留预测概率大于0的靶点以提高预测可靠性。对于无预测靶点的化合物，将其排除在后续网络分析之外。在合并所有靶点后，使用电子表格软件去除重复条目，确保最终数据集中每个靶点仅出现一次。

关键靶点的收集
使用关键词“腰椎间盘退变”从 GeneCards¹⁰、OMIM¹¹ 和 TTD¹² 数据库中检索获得疾病相关基因。将收集到的基因靶点进行整合，并去除重复条目，从而获得最终的疾病相关靶点集合。

益气活血方治疗劳力性心绞痛的潜在作用靶点
采用 Venny 2.1.0 平台确定益气活血方在劳力性心绞痛中的潜在作用靶点。随后构建网络以展示活性成分与其预测靶点之间的关联。根据网络中各成分的度值筛选核心活性成分。

药物成分与疾病交集靶点的网络构建
将中药复方益气活血方（YQHXD）的活性成分、靶点蛋白及LDD相关基因导入Cytoscape软件¹³，构建药物-成分-靶点-疾病网络图。

构建蛋白质-蛋白质相互作用网络并鉴定关键核心靶点
将交集靶点提交至 STRING 平台¹⁴进行分析，设定物种为 Homo sapiens。为构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，设定相互作用评分阈值为 >0.4，隐藏无连接的节点，其余参数均采用默认设置。将所得数据导入软件，利用 NetworkAnalyzer 工具评估网络拓扑特性并计算节点度值。根据度值排序，前五位的节点被确定为关键枢纽靶点。

核心靶点的富集分析
将交集靶点上传至 DAVID 数据库¹⁵，进行基因本体（Gene Ontology, GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。物种背景设定为 Homo sapiens，富集阈值依据 DAVID 默认参数设定，包括 EASE 阈值 < 0.1 和计数阈值 ≥ 2。基因背景集基于 DAVID 提供的默认全基因组背景。采用 Benjamini-Hochberg 方法对多重检验进行校正，以控制错误发现率（false discovery rate, FDR），并据此调整 DAVID 分析结果。富集通路按 Count 值降序排列。GO 和 KEGG 富集条形图通过在线生物信息学平台生成。

分子对接
为预测玉屏风散（YQHXD）关键活性成分与肝豆状核变性（LDD）核心靶点之间的相互作用，本研究进行了分子对接分析。根据网络拓扑度值和靶点相关性排序，选取前五种关键活性化合物作为配体，相应的核心靶蛋白则作为受体。配体的 SDF 文件从 PubChem 数据库获取，靶蛋白的三维结构从蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）下载。对接分析在 CB-Dock2 平台上采用其全自动盲对接流程进行。上传蛋白结构后，平台自动去除小分子、离子和水分子等异质原子，并对缺失的原子和氢原子进行修复。采用自动盲对接模式，在该模式下，CB-Dock2 利用基于曲率的空腔检测算法识别蛋白表面潜在的结合位点，并通过集成的 AutoDock Vina 引擎进行对接计算¹⁶。对接过程中，蛋白被视为刚性结构，配体则被视为柔性结构，所有对接参数均采用平台默认设置。对接结果利用 CB-Dock2 内置工具进行三维可视化和相互作用分析¹⁷，并计算结合能以评估活性化合物与靶蛋白之间的预测结合亲和力。

分子动力学模拟
使用 GROMACS 2022.2 对目标蛋白-配体复合物进行了分子动力学模拟。蛋白力场采用 Amber14SB，溶剂体系使用 TIP3P 水模型进行描述。配体的原子电荷通过 Antechamber 中实现的 AM1-BCC 方法计算，并随后分配 GAFF2 原子类型。生成的拓扑文件通过 ACPYPE 转换为 GROMACS 兼容格式。离子参数根据 Joung-Cheatham 参数集进行设定，以与 TIP3P 水模型保持一致。初始复合物被置于截断十二面体模拟盒子中，蛋白表面与盒子边缘之间至少保持 1.2 nm 的距离。加入 TIP3P 水分子以溶剂化体系，并添加 Na⁺ 和 Cl⁻ 离子以中和体系电荷并将离子强度调节至 0.15 M。采用最陡下降法进行能量最小化，直至最大作用力低于 1,000 kJ·mol⁻¹·nm⁻¹。随后，在 298 K 和 1 bar 条件下，对体系在 NVT 系综下进行 100 ps 的平衡。平衡完成后，在 NPT 系综下以 2 fs 的时间步长运行 100 ns 的生产模拟。非键相互作用采用 Verlet 截断方案处理。静电相互作用通过粒子网格 Ewald (PME) 方法计算，范德华力和库仑相互作用的截断距离均为 1.2 nm。含氢键通过 LINCS 算法进行约束。温度由 Nosé-Hoover 恒温器控制，压力由 Parrinello-Rahman 恒压器控制，以维持体系在 298 K 和 1 bar 的条件。轨迹每 10 ps 保存一次。使用 GROMACS 内置工具、VMD 和 PyMOL 分析结构动力学和分子间相互作用。在适用情况下，结合自由能通过 gmx_MMPBSA 进行估算。

动物实验

动物饲养
70只3–8周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠通过计算机生成的随机数字被随机分配至七个实验组（每组n = 10），确保各组间基线体重无统计学显著差异。所有动物均饲养于受控环境条件下（22 ± 1 °C，相对湿度55 ± 10%，12小时光照/黑暗循环），并可自由摄食和饮水。每次更换笼具时均随机调整笼位，以尽量减少环境偏差。经过1周的适应性饲养后，模型组大鼠接受尾椎间盘穿刺以诱导退变。术前采用布比卡因局部浸润麻醉以减轻疼痛。手术期间及术后恢复阶段均对动物进行密切监测。术后观察指标包括恢复时间、自主活动恢复情况、食物和水摄入量以及体重变化。造模后1周，每组随机选取2只大鼠进行术后数字化X线摄影（DR）成像及苏木精-伊红（HE）染色。放射学分析显示尾椎间盘高度降低，HE染色显示髓核（NP）中的脊索细胞明显减少，纤维环层状结构紊乱¹⁸，证实造模成功。术后8周，通过吸入过量异氟烷实施安乐死，并采集尾部组织和血液样本。经初步验证后，每组选取符合预设质量标准的三个独立样本用于最终的组织学、ELISA、PCR和蛋白质印迹分析。组织学切片在单盲条件下进行评估，切片仅以动物编号标记。ELISA、PCR和蛋白质印迹实验中，在样本分装和标记过程中采用盲法编码，并在实验前对所有样本的检测顺序进行随机化。原始数据（包括吸光度值、C_t值和条带强度）由未参与实验分组或样本处理的统计学家解码为组别信息，随后交由统计人员进行分析。所有统计分析均由未参与实验分组或样本处理的统计学家完成。任何不良事件，包括伤口感染、裂开、出血或严重嗜睡，均立即记录并评估。轻度情况予以密切监测并加强支持性护理。若大鼠出现体重下降超过基线值20%、镇痛药无法缓解的严重疼痛、活动能力丧失、无法接触食物或水、感染、坏死、其他严重术后并发症、呼吸困难或任何危及生命的情况，则执行人道终点，通过吸入过量异氟烷实施安乐死。

实验建模
大鼠通过吸入异氟烷麻醉后取俯卧位。在X射线透视引导下定位尾部Co6/7、Co7/8和Co8/9椎间盘（IVD）。将21 G针头垂直刺入椎间盘，直至穿透至对侧皮肤，随后将针尖回撤至尾部中心位置。另一根针作为定位参考。为诱导持续性椎间盘退变，将针旋转360°，保持原位30秒后拔出。假手术组仅穿透皮肤和肌肉约2 mm深度，不损伤椎间盘。其余各组则将针插入约5 mm，深入椎间盘中心，同时避开血管。插入后，针头旋转360°并维持30秒。穿刺部位消毒、标记，并用无菌纱布保护。建模一周后，尾椎X射线成像显示椎间盘高度降低。HE染色显示髓核（NP）中的索状细胞显著减少，纤维环层状结构紊乱，证实模型建立成功。建模成功后，中药治疗组及阳性对照（PC）组根据人与大鼠体表面积比例计算相应剂量并给药。

分组与干预
本实验共使用70只3–8周龄雄性SD大鼠，随机分为七组：
① 对照组（Ctrl）：该组大鼠与实验组同时、在相同条件下随机分配，饲养于SPF级动物实验设施的独立笼具中，可自由摄取标准饲料和饮用水。
② 假手术组：大鼠通过吸入异氟烷进行麻醉。麻醉成功后，用聚维酮碘对尾部皮肤进行消毒，并将大鼠置于俯卧位。在X射线透视引导下定位Co6/7和Co7/8椎间盘（IVD）。将针头穿过皮肤和肌肉约2 mm，但不损伤椎间盘。每日一次经口灌胃给予蒸馏水（10 mL/kg），持续8周。

③ 模型组：采用吸入异氟烷对大鼠进行麻醉。麻醉成功后，使用聚维酮碘对尾部皮肤进行消毒，并将大鼠置于俯卧位。在X射线透视引导下，定位Co6/7、Co7/8和Co8/9椎间盘（IVD）。将21 G针头垂直刺入椎间盘，直至穿透至对侧皮肤，随后将针尖回撤至尾部中心位置。

使用第二根针作为位置参考。将针旋转360°并保持原位30秒，以在取出前诱导椎间盘（IVD）持续退变。术后每日通过灌胃给予蒸馏水（10 mL/kg），连续8周，并密切监测大鼠恢复情况。
④ 阳性对照组（PC组）：阳性对照组接受与模型组相同的造模操作，随后连续8周每日灌胃给予塞来昔布（20 mg/kg/天），药物溶于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）制成混悬液，灌胃体积为10 mL/kg体重。
⑤ 益气活血方低剂量组 [YQHXD(L)]：造模方法同模型组。大鼠通过灌胃给予益气活血方，剂量为3.87 g/kg/天，连续8周，灌胃体积为10 mL/kg，工作浓度为0.387 g/mL。
⑥ 益气活血方中剂量组 [YQHXD(M)]：造模方法同模型组。大鼠通过灌胃给予益气活血方，剂量为7.74 g/kg/天，连续8周，灌胃体积为10 mL/kg，工作浓度为0.774 g/mL。
⑦ 益气活血方高剂量组 [YQHXD(H)]：造模方法同模型组。大鼠通过灌胃给予益气活血方，剂量为15.48 g/kg/天，连续8周，灌胃体积为10 mL/kg，工作浓度为1.548 g/mL。

病理学改变
通过手术分离大鼠尾部椎间盘（IVD）组织，观察IVD及周围肌肉组织的变化。收集的组织被制备成病理切片，标本以纵向切片方式进行形态学观察。尾椎IVD组织经甲醛固定96小时后，使用脱钙液快速脱钙，随后通过梯度酒精脱水，并用二甲苯透明。经石蜡包埋后，制备5 µm厚的石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精水化后，进行苏木精-伊红染色。随后脱水、透明并封片，在光学显微镜下观察各组尾部IVD结构的形态学变化。接着进行Masson三色染色：切片依次用重铬酸钾溶液和苏木精各染色3分钟，酸性乙醇分化后，再用苦味酸-天狼星红（Picrosirius Red）染色10分钟。经磷钨酸处理10分钟后，用甲苯胺蓝染色5分钟。染色完成后脱水，二甲苯透明，封片并在显微镜下观察尾部IVD的组织学变化。

血清靶蛋白的ELISA检测
术后8周，采用吸入异氟烷对大鼠进行麻醉，并采集腹主动脉血液。外周血样本在室温下静置1小时，随后以1,400 × g 离心10分钟。分离血清并储存于−80 °C，待用。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测血清中AKT1、STAT3和Bcl-2的水平。实验操作严格按照试剂盒生产商提供的说明书进行。在450 nm波长处读取吸光度，并根据标准曲线确定浓度。AKT1、STAT3和BCL-2的检测范围分别为0.625–40 ng/mL、31.25–1000 pg/mL和0.16–10 ng/mL，检测灵敏度分别为0.1 ng/mL、10 pg/mL和0.1 ng/mL。所有血清样本均未经稀释直接检测，且所有检测结果均落在相应标准曲线的线性范围内。所有样本及标准品均设双复孔进行检测，并基于相等的血清体积进行归一化处理。

基因表达水平的 PCR 检测
从大鼠尾椎分离椎间盘组织，每份样品收集约 20 mg。将组织在液氮中研磨粉碎后，加入 500 µL 非酶解裂解缓冲液裂解 15 分钟。随后提取总 RNA，并用分光光度计测定其浓度和纯度。A₂₆₀/A₂₈₀ 比值在 1.8–2.0 之间的样品用于后续分析，并将 RNA 浓度调整至 500 ng/µL。按照试剂盒制造商的说明书进行逆转录反应。采用实时荧光定量 PCR（qPCR）系统检测 Akt1、Bcl-2 和 Stat3 的 mRNA 表达水平。引物序列见表 1。PCR 反应程序为：95 °C 预变性 30 秒，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 5 秒，60 °C 退火延伸 30 秒）。扩增完成后进行熔解曲线分析，以确认扩增产物的特异性。Gapdh 作为内参基因，所有样品均设三个复孔。引物扩增效率为 90%–110%。相对基因表达量采用 2^−ΔΔCt 法计算。

蛋白质表达水平的 Western 印迹分析
从各组大鼠尾部椎间盘组织中提取总蛋白。组织在添加蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液中裂解。使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，并调整至 2 µg/µL。等量蛋白（每样本 15 µg）经 10% SDS-PAGE 分离后，在湿转系统中以 300 mA 恒定电流电转 90 分钟至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在室温下用 5% 脱脂奶粉封闭 1 小时，随后在 4 °C 与一抗 AKT1（1:5,000）、STAT3（1:6,000）、Bcl-2（1:1,500）和 β-actin（1:4,000）孵育过夜。TBST 洗涤后，膜在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:5,000 稀释）孵育 1 小时。使用增强型化学发光（ECL）试剂检测蛋白条带，并在相同曝光条件下用凝胶成像系统采集图像。使用 ImageJ 软件测量条带强度，并以 β-actin 为内参进行归一化，以确定相对蛋白表达水平。每个实验独立重复三次，每个样本来自不同的动物。

统计学
结果以均值 ± 标准差（SD）表示。组间差异采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行最小显著差异（LSD）事后检验。统计学显著性定义为 P < 0.05。

结果

研究得出的结论
本研究结合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和体内实验，探讨了益气活血方（YQHXD）对抗腰椎间盘退变（LDD）的潜在保护作用。结果表明，YQHXD可能至少部分通过调控AKT1/STAT3/BCL-2信号轴发挥作用，其特征表现为STAT3表达降低，AKT1和Bcl-2表达升高。组织学和分子分析显示，在大鼠尾椎间盘穿刺模型中，YQHXD治疗与髓核完整性改善、纤维环结构修复以及细胞外基质组织优化相关。分子动力学模拟支持TNF与四神经素A之间存在稳定的预测相互作用，为潜在活性成分-靶点相互作用提供了结构依据。综上所述，这些发现提示YQHXD可能通过多成分、多靶点的调控机制延缓LDD的进展。

网络药理学与分子对接

益气活血方中的活性成分及其作用靶点
共获得31种活性成分，其中20种来自黄芪（Astragalus membranaceus），2种来自...

讨论

据报道，传统中药具有抗炎、镇痛及促进血液循环等药理作用¹⁹。既往研究表明，YQHXD的前体方小碎化核汤可能通过影响髓核（NP）的吸收及椎间盘的吸收，促进巨大椎间盘突出的重吸收²⁰；然而，其潜在的分子机制尚不明确。在本研究中，采用网络药理学方法探讨YQHXD在腰椎间盘退变（LDD）中涉及的多种化合物、靶点及信号通路之间的潜在相互作用^21,22。分析鉴定出槲皮素、四氢诺林A、(3R)-3-(2-羟基-3,4-二甲氧基苯基)色烷-7-醇、异鼠李素和Jaranol为YQHXD优先候选的活性成分。既往研究已将这些化合物或相关黄酮类物质与骨、软骨或椎间盘相关模型中的抗炎、抗氧化、自噬相关、凋亡相关及细胞外基质调控作用相关联^23,24,25,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）	未指定		用于配制灌胃用塞来昔布混悬液的溶媒。
21 G 针头	未指定		用于尾部椎间盘穿刺。
2× 通用型Blue SYBR Green qPCR预混液	武汉赛维尔生物科技有限公司	G3326	qPCR 扩增试剂
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶溶液（29:1）	Solarbio Co., Ltd.		SDS-PAGE凝胶制备溶液；在原始材料表中列为30%/29:1凝胶溶液。
3D冷冻研磨机	武汉赛维尔生物科技有限公司		用于组织匀浆/研磨。
4× SDS-PAGE 浓缩胶缓冲液（pH 6.8）	Solarbio Co., Ltd.		Western blot 凝胶制备试剂
酸性乙醇	未指定		用于组织学染色的分化。
ACPYPE	ACPYPE 项目		用于将配体拓扑文件转换为与 GROMACS 兼容的格式。
AKT1 ELISA试剂盒	杭州优品生物技术有限公司	SYP-R1928	用于检测血清 AKT1 水平；检测范围 0.625–40 ng/mL
AM1-BCC 电荷方法	前室/AMBER 工具		用于配体原子电荷计算。
Amber14SB 力场	AMBER力场		分子动力学模拟中使用的蛋白质力场
当归根	中国广西南宁市建寿药店	批号 20250503	YQHXD 植物成分；每剂 20 克
无水乙醇	天津奥普生物化学有限公司		用于组织处理/脱水。
前室	AMBER Tools		用于配体电荷计算和原子类型确定。
抗AKT1抗体	武汉三鹰有限公司		用于Western blot的一抗；稀释比例1:5,000。
抗Bcl-2抗体	武汉三鹰有限公司		用于Western blot的一抗；稀释比例为1:1,500。
抗STAT3抗体	武汉三鹰有限公司	10253-2-AP	用于Western blot的一抗；稀释比例为1:6,000。
APS试剂	碧云天生物技术有限公司		Western blot 凝胶聚合试剂
黄芪根	中国广西南宁市建寿药店	批号 20250405	YQHXD 植物成分；每剂 20 克
高压灭菌	日本山阳		灭菌设备。
AutoDock Vina 引擎	AutoDock/Vina 项目		CB-Dock2 中使用的对接引擎。
BCA蛋白检测试剂盒	Solarbio Co., Ltd.		用于在进行 Western 印迹前测定蛋白质浓度。
Bcl-2 ELISA试剂盒	武汉菲恩生物科技有限公司	PMK1545	用于测定血清 Bcl-2 水平；检测范围 0.16–10 ng/mL
布比卡因	未指定		术前使用的局部浸润麻醉剂。
CB-Dock2	CB-Dock2 网络服务器		自动化盲分子对接平台
塞来昔布	四川新斯顿制药有限公司	H20233911	阳性对照药物；按20 mg/kg/天经灌胃给药。
皱皮木瓜果实	中国广西南宁市建寿药店	批号 231001	YQHXD 植物成分；每剂 15 克
Cytoscape	Cytoscape 联盟	版本 3.9.0	用于构建和分析网络图。
DAB 显色试剂盒（20×)	北京中杉金桥生物技术有限公司		见现有材料表。
DAVID	国家癌症研究所	版本 6.8	用于基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析的注释、可视化与综合发现数据库
脱钙液	北京中杉金桥生物技术有限公司		用于尾椎间盘组织的脱钙。
脱色摇床	北京刘一生物科技有限公司		实验室摇床
DEPC 水	武汉三鹰有限公司		RNA 实验/试剂制备
数字放射成像系统	未指定		用于术后放射影像模型验证。
蒸馏水	未指定		对照溶媒灌胃及益气活血方煎剂制备
ECL 化学发光底物	Biosharp 公司		Western blot 信号检测试剂
EDTA抗原修复液（pH 8.0）	北京中杉金桥生物技术有限公司		见现有材料表。
电泳装置	未指定		用于SDS-PAGE电泳。
电泳缓冲液	Servicebio 公司		Western印迹电泳溶液
FM40制冰机	昌流科学仪器有限公司，北京		制冰机
甲醛	未指定		用于尾椎间盘组织固定的固定液。
GAFF2 原子类型	AMBER Tools		分子动力学模拟中使用的配体原子类型
凝胶成像系统	天恩科学，上海		用于捕获 Western 印迹图像。
GeneCards	魏茨曼科学研究所	版本 5.26	用于检索疾病相关靶点的人类基因数据库
gmx_MMPBSA	gmx_MMPBSA 项目		适用于MM-PBSA结合自由能估算。
GraphPad Prism	GraphPad Software	版本 8.0	作者先前发表的稿件中列出的统计/绘图软件。
研磨珠	武汉赛维尔生物科技有限公司		用于组织研磨/匀浆。
GROMACS	GROMACS 开发团队	版本 2022.2	用于分子动力学模拟。
苏木精和伊红染色试剂	未指定		用于尾部椎间盘切片的HE染色。
高速离心机	德国艾本多夫		实验室离心机
高速低温组织研磨机	中国赛维尔生物		用于低温组织研磨。
水平摇床	Chirinbell 公司		实验室摇床
HRP标记的山羊抗兔抗体	Servicebio 公司		用于Western blot的二抗；稀释比例1:5,000。
含gDNA去除剂的HyperScript III反转录超级混合液（适用于qPCR）	武汉赛维尔生物科技有限公司		现有材料表中列出的反转录试剂。
制冰机	中国，SIMAG		制冰机
ImageJ	美国国立卫生研究院		用于蛋白质印迹条带强度的定量分析。
倒置生物显微镜	日本 Olympus		用于染色切片的显微观察。
异氟烷	未指定		吸入麻醉/安乐死药剂
异丙醇试剂	中国国药集团化学试剂有限公司		RNA提取试剂
Joung-Cheatham 离子参数	不适用		分子动力学模拟中使用的离子参数集
川芎根茎	中国广西南宁市建寿药店	批号 20250301	YQHXD 植物成分；每剂 15 克。
液氮	未指定		用于RNA提取前的组织研磨。
低速离心机	德国艾本多夫		用于血清分离及其他低速离心步骤。
马松三色染色液	未指定		用于尾部椎间盘切片的Masson染色。
酶标仪（TECAN）	TECAN，瑞士		用于在450 nm处测定吸光度；已在现有材料表中列出。
酶标仪（Thermo Fisher Scientific）	赛默飞世尔科技公司，美国		现有材料表中列出的多功能酶标仪
Microsoft Excel/电子表格软件	微软		用于删除重复的目标条目并管理表格数据。
NanoDrop 2000 分光光度计	赛默飞世尔科技公司，美国		用于测定RNA浓度和纯度。
非酶解裂解缓冲液	未指定		用于RNA提取前的组织裂解。
在线人类孟德尔遗传数据库	约翰斯·霍普金斯大学医学院		在线人类孟德尔遗传数据库；用于检索与疾病相关的靶点。
在线生物信息学绘图平台	未指定		用于生成GO和KEGG条形图。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚合剂	Solarbio Co., Ltd.		Western blot 凝胶制备试剂
石蜡	未指定		组织学切片包埋介质
Akt1、Bcl-2、Stat3 和 Gapdh 的 PCR 引物	武汉赛维尔生物科技有限公司		引物序列见表1。
PDB	RCSB 蛋白质数据库		蛋白质数据库；用于获取靶蛋白的三维结构。
磷酸化/蛋白酶抑制剂	Servicebio 公司		添加至RIPA裂解缓冲液用于蛋白质提取。
磷钨酸	未指定		用于Masson染色。
苦味酸-天狼星红	未指定		用于Masson染色。
聚偏二氟乙烯膜（0.45 μm)	Servicebio 公司		用于Western印迹转膜的PVDF膜
阳性对照药物溶剂	未指定		用于塞来昔布的0.5%羧甲基纤维素钠悬浮液载体
聚维酮碘	未指定		用于手术部位的消毒。
蛋白分子量标准	赛默飞世尔科技公司，美国		用于 Western 印迹的分子量标记物
蛋白质转运装置	Bio-Rad，美国		用于 Western 印迹的湿转设备
蛋白质转印模块（湿转法）	Bio-Rad，美国		Western blot 湿转模块
PubChem	国家生物技术信息中心（NCBI）		用于获取化合物结构的SMILES/SDF文件。
纯水制备系统	上海乐丰生物技术有限公司		用于纯水制备。
PyMOL	施ödinger, LLC		用于分子动力学/对接结果的可视化与分析。
qPCR 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems QuantStudio，美国		用于定量 PCR 扩增。
RIPA 组织/细胞裂解缓冲液	Solarbio Co., Ltd.		用于总蛋白提取。
RNA溶解液	武汉赛维尔生物科技有限公司		RNA 操作试剂
旋转蒸发仪	未指定		用于在减压条件下浓缩合并的 YQHXD 滤液。
白芥子成熟种子	中国广西南宁建寿药店	批号 20240801	YQHXD 植物成分；每剂 10 克
Sprague-Dawley 大鼠	上海斯莱克实验动物有限公司	SCXK（上海）2022-0004	70只雄性大鼠，年龄为3周–8周龄，用于尾盘穿刺模型。
SPSS	IBM，美国	版本 21.0	作者先前稿件版本中列出的统计软件。
STAT3 ELISA试剂盒	杭州优品生物技术有限公司	SYP-R1555	用于检测血清 STAT3 水平；检测范围 31.25–1000 pg/mL
粉防己根	中国广西南宁建寿药店	批号 230301	YQHXD 植物成分；每剂 6 g
无菌纱布	未指定		用于模型建立后保护穿刺部位。
STRING	STRING 联盟	版本 12.0	蛋白质-蛋白质相互作用网络平台
SweScript 一步法 RT 超级混合液（适用于 qPCR）	武汉赛维尔生物科技有限公司	G3337	现有材料表中列出的逆转录试剂。
SwissTargetPrediction	SIB 瑞士生物信息学研究所		用于预测化合物的潜在靶点。
TBST缓冲液	未指定		用于 Western blotting 过程中的膜洗涤。
TCMSP	西北A大学生命科学学院生物信息学中心&F 大学	版本 2.3	传统中药系统药理学数据库；用于获取中药复方的活性成分。
TIP3P 水模型	不适用		分子动力学模拟中使用的水模型
甲苯胺蓝	未指定		用于Masson染色。
转移缓冲液	Servicebio 公司		Western印迹转膜缓冲液
TriQuick试剂	武汉赛维尔生物科技有限公司		RNA提取试剂
TRIzol试剂	未指定		文中提到的总RNA提取试剂
TTD	香港中文大学（IDRBLab）		治疗靶点数据库；用于检索与疾病相关的靶点。
Venny	BioinfoGP，CNB-CSIC	版本 2.1.0	用于鉴定玉屏风散与六味地黄丸之间的共同作用靶点。
Verlet 截断方案	GROMACS		分子动力学模拟中使用的非键相互作用方案
垂直电泳装置	Bio-Rad，美国		用于SDS-PAGE。
VMD	伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校		用于分子动力学输出结果的可视化与分析。
湿转印系统	Bio-Rad，美国		用于蛋白质印迹中的蛋白质转膜。
X射线透视系统	未指定		用于在穿刺建模过程中识别尾部椎间盘水平。
二甲苯	未指定		用于组织学中的脱蜡/透明步骤。
β-肌动蛋白一抗	武汉三鹰有限公司		用于Western blot的内参一抗；稀释比例1:4,000。