利用中空纤维灌注生物反应器从高密度三维细胞培养中大规模生产细胞外囊泡

摘要

本文提供了建立和使用3D灌注式中空纤维生物反应器从间充质干细胞（MSC）及其他细胞类型中生产细胞外囊泡的详细说明。本方案描述了一种在中空纤维生物反应器中通过调控细胞密度，持续高浓度生产细胞外囊泡的方法。

摘要

外泌体研究领域的进展受到传统二维细胞培养中细胞数量少以及外泌体分泌产量低的限制。中空纤维生物反应器（HFBR）中的高密度细胞培养可在三维培养条件下，于较长时间内持续地从大量细胞中高效生产分泌的生物分子和细胞外囊泡（EVs），并获得高浓度产物。本方案描述了在商业化可获取的HFBR系统中，如何在数周至数月的连续生产过程中，于维持最佳细胞量和三维灌注培养条件的同时，收集高浓度的分泌型外泌体。该系统结构紧凑、封闭、一次性使用，可符合cGMP要求，操作简便，并可置于标准CO²培养箱中运行。某些细胞类型（如间充质干细胞（MSCs）和人羊水干细胞（HAFSCs））在此类培养条件下可能出现增殖减缓，可能随时间推移影响其分化潜能和表型。代表性结果展示了在数周或更长时间连续生产过程中典型的EV产量和细胞活力。该方法可稳定获得高质量的EV产物，适用于科研及临床应用。

引言

细胞外囊泡因其在细胞间通讯及再生医学等治疗应用中的作用而日益受到关注。传统的二维细胞培养方法耗时耗力，产量有限，有时需要数百个培养瓶才能获得足够用于实验或动物研究的细胞外囊泡。^1,2. 临床转化的规模化通常采用使用微载体或其他支撑物的传统搅拌式生物反应器。这些系统本质上缺乏生理相关性，效率较低，且结果可能存在较大变异性。中空纤维生物反应器则提供了一种三维、基于灌注的培养环境，可在紧凑的空间内支持高密度的细胞培养，并具备适用于临床应用规模的潜力^3,4.

中空纤维生物反应器（HFBR）提供了一种紧凑、高密度的细胞培养系统，与传统的二维培养相比，可减少人力、时间和空间消耗，实现细胞外囊泡（EV）的连续浓缩生产⁵。 该系统可在有限空间内支持高密度细胞培养，使任何实验室均可进行大规模EV生产。HFBR可在标准CO₂培养箱中，于小体积（20–60 mL）内培养大量细胞（1×10⁹至1×10¹⁰），且无需任何专用设备。该系统可在数周甚至数月内持续收获高浓度EV，同时支持低血清或化学成分明确培养基的使用。在HFBR中，细胞被截留在毛细管外腔（ECS）的小体积空间内，与循环培养基通过具有特定截留分子量（MWCO）的半透性中空纤维膜分隔开来（图1）。葡萄糖和乳酸等小分子可自由穿过纤维膜，而抗体或细胞外囊泡等较大分子则被截留并富集于ECS中，从而便于收集。

有三个基本特征使中空纤维细胞培养区别于其他任何方法：1）高比表面积（200 cm²/mL），这使得在有限空间内可提供极大的细胞附着表面；2）培养物被分隔在纤维内腔与外腔两个独立区域，从而实现细胞生长环境与培养基流动路径的物理分离；3）连续灌流操作模式，允许营养物质持续供给并及时清除代谢废物，从而支持高密度细胞长期生长。²/mL）允许 体内样 细胞密度, 1–2 × 10⁸每毫升细胞数。2）细胞附着于多孔支撑材料上，而非非多孔的塑料培养皿。无需进行细胞传代。³纤维的截留分子量（MWCO）可进行调控。与传统的二维培养瓶相比，分泌产物在灌流装置的细胞外空间（ECS）内可被截留并浓缩10–100倍。此外，可将特定的蛋白质基质（如纤连蛋白或胶原蛋白）轻松涂覆于纤维表面，且不会影响跨纤维的流速。

HFBR 提供一种基于三维灌注的培养环境，该环境更 体内样 优于二维培养⁶ 并独特地降低了细胞对血清支持的依赖性，简化了培养基的需求。这种高密度培养环境可能支持蛋白质加工方式与二维培养相比产生差异，同时已有报道显示其可增强细胞外囊泡（EV）的生物活性^7,8,9. 中空纤维生物反应器是“组织中心型”的，旨在模拟类似组织的特性 体内 细胞生理学¹⁰. 组织中心型生物反应器的两个关键特征是：1）高细胞密度，使细胞能够自主形成特定的微环境；2）无需对细胞进行分裂或传代，从而允许细胞间相互作用以及类球体等三维结构随时间自然发育。该方法可实现传统二维培养系统难以达到的细胞密度，并有助于使用简化、无蛋白且成分明确的培养基。

任何可在培养瓶中培养的细胞类型均可在中空纤维生物反应器中进行培养。转化细胞系具有增殖能力¹¹。需要监测的关键参数是葡萄糖消耗速率。葡萄糖监测可直接反映细胞的代谢活性，有助于优化收获时机并控制细胞密度¹²。必须控制 cartridge 内的细胞量，以确保葡萄糖消耗速率不超过系统输送氧气和清除 CO² 的能力。这一目标可通过在收获过程中移除部分细胞量来实现。间充质干细胞（MSCs）和人羊膜间充质干细胞（HAFSCs）在中空纤维生物反应器中不增殖，而是保持静息状态。这些细胞在接种至生物反应器前需要预先扩增。然而，一旦培养体系建立，即可连续数周甚至数月持续收获细胞外囊泡（EVs）。间充质干细胞的表型在30天培养期间保持稳定，仅 CD105 表达可能例外，其表达水平随时间逐渐下降。当将生物反应器中培养的间充质干细胞 subsequently 接种至含血清培养基的培养瓶中时，CD105 的表达恢复至初始水平¹³ 。CD105 表达可能作为二维（2-D）与三维（3-D）培养的标志物。瞬时转染技术也可用于构建准稳定转染细胞系¹⁴。

3D中空纤维细胞培养更接近体内细胞培养条件的一些实例及其优势包括：随时间推移实现完整且均一的翻译后修饰^15,16、胃上皮形成微绒毛以培养隐孢子虫¹⁷、3D肝脏模型¹⁸、3D血脑屏障模型¹⁹、疟原虫子孢子的形成²⁰，以及骨髓/干细胞共培养²¹。

在中空纤维生物反应器（HFBR）中，细胞裂解受到限制，因此细胞外囊泡（EVs）高度浓缩，且细胞内蛋白和膜碎片的污染显著减少。只要培养基中不含无法透过纤维的高分子量成分，中空纤维生物反应器可兼容任何类型的培养基。如有必要，这些大分子物质可直接添加至生物反应器的外腔室（ECS）中。推荐使用高糖培养基，例如DMEM。使用成分较简单、无蛋白的细胞培养基可降低蛋白载量，从而简化后续纯化步骤。间充质干细胞和人羊水干细胞已在标准基础培养基加胎牛血清（FBS）以及多种 commercially available 的间充质干细胞培养基配方中成功培养。HFBR可利用市售即用型滤芯生产克级产量的外泌体。中空纤维生物反应器是一种在潜在cGMP条件下大规模生产外泌体的有效方法，代表了推动外泌体研究与临床转化的范式转变。

采用中空纤维生物反应器进行细胞外囊泡生产的成功与否在很大程度上取决于具体操作步骤。生物反应器的操作、细胞接种密度、收获频率以及所用培养基等因素均会影响生物反应器运行的成功率。本方案描述了一种利用中空纤维生物反应器从高密度细胞培养物中生产并收集细胞外囊泡的标准化方法。目标是提供一种可重复的囊泡收获方案，包括系统安装、细胞接种、培养维持及收获操作的指导。该方法旨在支持科研应用中稳定可靠的细胞外囊泡生产，并提供一个可针对不同细胞类型和实验目标进行调整的通用框架。

方案

所有操作均符合标准的优良实验室规范（GLP）和优良细胞与组织培养规范指南。

注意：滤芯已预先组装并经过γ射线灭菌。它采用双层袋包装，每个连接口均配有鲁尔帽，因此完全密封，即使在袋外也能保持无菌状态。滤芯端口的识别请参见图2 。所有操作均在室温下的层流罩中进行。

1. 储液帽的准备与灭菌。

1. 从双层包装的滤芯中取出两段短管。
2. 将短管连接到储液罐盖的不锈钢管接头的接头上。
3. 用铝箔包裹短管及不锈钢管外露的端部，以在高压灭菌后保持无菌状态。将组装好的部件放入高压灭菌袋中。
4. 在 121 °C 下使用干燥循环进行高压灭菌，时间 15–30 分钟。使用前让瓶盖冷却至室温。

2. 将中空纤维柱连接至储液瓶

1. 从1 L的PBS瓶中转移50 mL PBS至50 mL锥形管中，以备后续使用。
2. 取下灭菌袋上储液罐盖，并移除长金属管上的保护铝箔。
3. 打开PBS瓶盖，并将储液罐盖旋紧在PBS瓶口上。从内层无菌袋中取出滤芯。
4. 移除储液罐盖顶部一段管路上的铝箔。
5. 取下一个长滤芯管路上的鲁尔帽，并将其连接到储液罐盖的管路接口上。连接时可轻微反向旋转，以防止管路扭曲。
6. 对第二根管路连接重复上述操作。
7. 轻轻挤压棕色泵管，推动PBS流经系统，直至所有气泡完全排出。

3. 填充额外毛细管空间（ECS）

1. 吸取 20 mL PBS 使用至少1.5规格的粗针头将无菌注射器中的内容物吸入" 长度；出于安全考虑，建议使用钝针。
2. 用酒精消毒两侧的鲁尔接头，然后使其自然晾干。
3. 将装有 PBS 的注射器连接至一侧端口，将一个空的无菌注射器连接至对侧端口。关闭两个末端端口，打开两个侧端口。
4. 将PBS缓慢注入ECS，同时将卡盒保持轻微倾斜，以尽量减少气泡产生。对侧端口的空注射器将充满空气。
5. 如果ECS中存在空气，打开右端端口，用空注射器抽出液体，直至ECS完全充满液体（此操作将使PBS从储液瓶中经由纤维进入ECS）。
6. 关闭两侧端口的滑动夹，打开两端端口的滑动夹，用手指轻轻按压泵管以确认液体流动。
7. 将空的注射器留在侧端口上作为盖帽。每次将注射器移出超净工作台后，均需更换为新的注射器。

4. 纤维包被与细胞接种

注意：用特定基质蛋白包被纤维以及接种细胞的操作步骤基本相同。过量液体将流经纤维并进入储液区，而细胞或包被材料则保留在纤维外侧的细胞外空间（ECS）中。建议接种细胞数量为 1 × 10⁸ 个。对于 4,000 cm² 的中空纤维生物反应器（HFBR），建议使用 100–500 µg 基质蛋白溶于 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中进行包被。结合在纤维表面的基质蛋白不会影响截留分子量（MWCO）。

1. 在无菌的50 mL锥形管中制备包被溶液或细胞悬液。使用来自培养瓶扩增的条件培养基中的1 × 10⁸个细胞，或在PBS中加入100–500 µg基质蛋白。总体积为20 mL。
2. 使用大口径针头将20 mL细胞悬液或包被溶液吸入无菌注射器中。
3. 将装有溶液的注射器连接至一侧端口，另一侧端口连接一个空的无菌注射器。
4. 关闭两端端口，打开两个侧端口。
5. 通过在两个注射器之间转移液体，轻柔混匀溶液。每个注射器中保留一半溶液。然后关闭两个侧端口。
6. 打开右侧端口，并将储液罐盖松开1/4圈。
7. 从一个注射器向ECS中注入溶液。关闭连接的侧端口。
8. 从另一个注射器注入溶液。关闭连接的侧端口。打开两个端端口。
9. 若接种细胞，将 cartridge 置于水平位置，在室温下静置30分钟，然后沿长轴旋转180°，再静置30分钟。
   1. 若用基质蛋白包被纤维，则在室温下静置过夜。
10. 将 cartridge 放入Duet泵系统中，并启动流速设为25的灌注。

5. 收获前准备（见图2）

1. 将一个带有三通阀和无菌滤器的空无菌注射器连接到右侧端口。
2. 调节三通阀，使气体可通过无菌滤器排出。将第二个空无菌注射器连接到左侧端口。

6. 收集条件培养基（收获）

1. 打开右侧端口，并通过滤器保持无菌通气。
2. 将 cartridge 的右端向上倾斜，并用左侧注射器吸取培养基（产物）。将 ECS 内容物完全排入左侧注射器中。
3. 关闭右侧端口。关闭左侧端口，取下注射器, 并将收获物收集到一个50 mL锥形管中 管
4. 更换左侧端口的注射器。打开左侧端口。打开右侧端口。
   将储液罐盖子逆时针旋转1/4圈拧开。
5. 将盒的左端向上倾斜，通过抽吸连接在左侧端口的注射器来填充胞外液室（ECS）。持续填充至液体弯月面位于侧端口管路中央，确保ECS完全充满。
6. 关闭右端端口。打开右侧端口，将三通旋塞阀转向通过滤器排气。
7. 打开左侧端口。将 cartridge 向右侧倾斜，将 ECS 完全排入左侧注射器中。
8. 关闭左侧侧端口。取下注射器，将收集到的ECS收集至50 mL锥形管中。
9. 将注射器重新插入左侧端口。关闭右侧端口。打开右端端口
10. 将 cartridge 的左侧向上倾斜，并通过抽吸左侧注射器来填充 ECS。完全填充 ECS，直至液体弯月面位于侧端管路的中部。
11. 关闭左侧侧端口。打开左侧末端端口。拧紧储液罐盖。
12. 通过在将 cartridge 放回 Duet 泵之前手动挤压泵管来确认系统流路。

7. 将生物反应器插入泵系统中。

1. 将泵的流速设置为控制盒上的25档。在泵运行时安装滤筒更为方便。
2. 握住流路支架的右侧边缘。将泵管滑入泵的管路中。
3. 将流路底座滑入泵底座的插槽中。确保矩形定位块卡入流路支架上的切口内。
4. 将储液瓶放置在泵底座侧面的凹槽内。
5. 电源细线可穿过培养箱密封垫之间的缝隙。控制盒带有磁铁，可吸附在培养箱侧面。

8. 监测葡萄糖水平

1. 使用 1 mL 移液器，从储液瓶中取出 1 mL 培养基样品。
2. 将少量取样的培养基滴加到血糖仪试纸上，使用兼容的血糖仪测量葡萄糖浓度。

9. 葡萄糖摄取速率的计算

注意：葡萄糖摄取速率的计算方法是用初始葡萄糖浓度减去24小时后的葡萄糖浓度测量值。由于该速率取决于储液瓶的体积，需将葡萄糖浓度的下降值乘以储液瓶体积（单位为升）。例如，若储液瓶中含有250 mL液体，则乘以0.25（即25%）。（葡萄糖浓度1 - 葡萄糖浓度2）×（储液瓶体积，单位为升）。250 mL等于0.25 L。若时间超过一天，再将结果除以天数。例如：初始葡萄糖浓度为4.5 g/L；24小时后测得葡萄糖浓度为2.7 g/L；储液瓶体积为250 mL。4.5 - 2.7 = 1.8 g；1.8 × 0.25（储液瓶体积为0.25 L），即消耗了0.45 g葡萄糖。因此，葡萄糖摄取速率为450 mg/天。

10. 活性检测

1. 利用收获方案收集少量细胞样本。
2. 将细胞接种至含有新鲜10%血清培养基的T25培养瓶中。通过显微镜观察评估细胞贴壁情况和存活率。

11. 芯片每日维护及第一周培养。

注意：在培养的第一周内，增殖细胞将扩展至每天消耗 1–2 克葡萄糖的目标速率。

1. 第0天：接种细胞，根据培养基配方确定初始葡萄糖浓度。起始储液瓶体积：125 mL。
2. 第1–2天：每天测定葡萄糖浓度。当初始葡萄糖消耗达50%时，将125 mL储液瓶更换为250 mL新鲜培养基，并将血清浓度降低至7.5%。
3. 第3–4天：测定葡萄糖浓度。当初始葡萄糖消耗达50%时，将250 mL储液瓶更换为500 mL新鲜培养基，并将血清浓度降低至5%。
4. 第4–5天：测定葡萄糖浓度。当初始葡萄糖消耗达50%时，将500 mL培养基更换为1 L新鲜培养基。将血清浓度降低至2.5%，并可根据需要切换至化学成分确定的培养基。
5. 第6天及以后：测定葡萄糖浓度，收集细胞外液（ECS）。通过收获细胞控制细胞密度，使葡萄糖每日摄取量维持在1至2克之间。
6. 对于非增殖性细胞，起始储液瓶中加入125 mL培养基，每3天更换一次培养基。
7. 若葡萄糖消耗显著，将储液瓶体积增加至250 mL。在第3–4天去除ECS中的血清，并替换为基础培养基。

结果

按照本方案，接种增殖型细胞系的4,000 cm²培养筒通常每天消耗1–2 g葡萄糖。若使用高葡萄糖培养基（如DMEM），则相当于每2–3天更换1 L培养基。细胞在接种后一周内达到最大密度。收获应于接种后5–7天开始，或当葡萄糖消耗速率达到每天1 g时启动，此后应尽可能每天进行。在培养的第一周内，若需要血清，可将ECS中的含血清培养基替换为无血清基础培养基，同时在循环培养基中保留血清。一旦葡萄糖消耗速率达到1 g/天，即可轻松转换为低血清培养基或其他化学成分明确的培养基。间充质干细胞（MSCs）和人羊水来源干细胞（HAFSCs）的葡萄糖消耗速率远低于转化细胞系（如CHO、293或杂交瘤细胞）。MSC和HAFSC以及其他细胞类型通常会形成球状体（图3）。每日监测葡萄糖水平可可靠地反映培养状态和代谢活性。标准的市售无异源成分培养基已成功用于MSC和HAFSC培养。每次收获体积约为20 mL。收获间隔以24小时为最佳，因为细胞外囊泡（EV）浓度在24小时后达到峰值（图4）。收获培养基中典型的外泌体浓度范围为1–5 × 10¹² 粒子/mL，具体数值取决于细胞类型、接种细胞数量及其他因素，并可在离心后形成可见沉淀（图5）。可接种大量细胞，且应依据细胞数量而非培养面积进行接种（图6）。

结果表明，细胞外囊泡（EV）的产量与葡萄糖消耗所反映的代谢活性相关，这为监测和优化培养性能提供了实用的参数。每隔24小时进行一次每日收获，可在维持培养稳定的同时使EV浓度最大化。这些发现支持将葡萄糖监测和可控的收获频率作为中空纤维生物反应器中可重复生产EV的关键参数。

图1：中空纤维生物反应器的横截面示意图。培养基流经纤维内部，细胞附着于纤维外表面。小分子量组分（如葡萄糖和乳酸）可自由穿过纤维壁，而分泌产物（如细胞外囊泡EVs）则无法穿过纤维壁，从而在纤维外部区域（称为ECS，即毛细血管外空间）高度富集。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2： 带端口和夹具的盒式装置照片。流路中的单向止回阀可产生培养基的循环流动。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：当以足够数量接种到 cartridge 中时，间充质干细胞、人羊水干细胞、心肌前体细胞以及其他一些细胞类型会形成球状体。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：不同时间间隔收获后EV浓度的测定。24小时后，EV浓度达到最大值。最佳收获时间为24小时。（数据由洛杉矶儿童医院EV核心实验室Paolo Neviani提供）请点击此处查看此图的放大版本。

图 5： DIFI 细胞在 C2011 中空纤维生物反应器中培养一周后收获的细胞外囊泡（EVs）。EVs 通过差速离心法分离。（数据由范德堡大学 Jeff Franklin 提供）^18,19。请点击此处查看此图的放大版本。

图6： 可将数量远超预期的细胞接种至中空纤维生物反应器中。间充质干细胞（MSCs）在二维培养中占据较大面积；而在三维培养中以球状体形式生长时，其所占空间更小。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

中空纤维生物反应器无法合理地以真正的商业化规模生产蛋白质或抗体。然而，它们具有独特的能力，可在高密度条件下培养相对大量的细胞，并以临床相关规模分泌浓缩的细胞外囊泡（EV）产物。直到最近几年，以组织为中心的生物反应器的真正优势才被认识到。在符合cGMP标准的培养基中进行高密度灌注培养，可获得浓度较高的EV，其产量可能适用于科研及潜在的临床应用。一次4,000 cm²规模的收获物可能在10–20 mL体积中含有5 × 10¹²至1 × 10¹⁴个EV。这些产量处于已报道的EV剂量研究范围之内²²。

每日监测葡萄糖摄取速率是评估培养性能的重要参数，也是细胞代谢、细胞数量和细胞健康状况的直接指标。通常首选葡萄糖含量较高的培养基，例如起始葡萄糖浓度为 4.5 g/L 的 DMEM。当葡萄糖消耗达到 50% 时，应更换为新鲜培养基。某些细胞（如间充质干细胞，MSCs）在葡萄糖浓度高于 3 g/L 时倾向于消耗葡萄糖并产生乳酸，而在葡萄糖浓度低于 3 g/L 时则转为消耗谷氨酰胺并产生氨。目前尚未对三维培养条件下的间充质干细胞进行完整的代谢谱分析。

成功进行生物反应器培养最关键的参数是细胞接种数量。对于4,000 cm² C2011生物反应器，最低细胞接种量为1 × 10⁸个细胞。对于如MSC或HAFSC等非增殖性细胞，建议接种更多细胞，最多可达总共1 × 10⁹个细胞。储液罐体积应与 cartridge 中的细胞数量成比例。1 × 10⁸ 个细胞所用的储液罐体积不应超过125 ml；1 × 10⁹个细胞的储液罐体积不应超过1 L。若储液罐过大，可能导致细胞进入迟滞期，表现为细胞不消耗葡萄糖，尽管台盼蓝染色显示其仍具活力。此时应减小储液罐体积或增加接种细胞数量。为获得足够数量的细胞以实现有效的生物反应器培养，可能需要进行多次细胞接种。只需将额外的细胞直接接种到 cartridge 中已有的细胞之上即可。在评估生物反应器性能时，需注意细胞接种量；细胞接种量增加10倍，可能带来外泌体（EV）产量增加10倍的效果。

根据细胞类型和期望的产量，可对实验方案进行若干修改，包括培养基成分、表面包被物、细胞数量、收获体积、收获频率或注射器尺寸的调整。连续培养可实现便捷的实时条件优化，因为在培养过程中可随时进行调整，并实时获得结果²¹。故障排查应重点关注无菌状态的维持以及代谢活性的监测。需确保管路无堵塞或弯折，尤其是在滑动夹具周围。细菌污染会导致葡萄糖迅速消耗以及储液瓶内液体变浑浊。真菌污染的特征是卡盒左端帽处出现絮状白色聚集物，造成液体流动受阻。中空纤维生物反应器系统的使用需要熟练的操作技巧并严格遵守操作规程。关键步骤包括接种适量的细胞、收获过程中维持无菌状态，以及密切监测葡萄糖消耗情况，以防止细胞过度生长或营养耗竭。大多数细胞会附着在纤维上，有时依赖于纤维连接蛋白包被的蛋白基质，该基质有助于细胞快速附着。某些细胞，如间充质干细胞（MSCs）、人羊膜来源干细胞（HAFSCs）和心脏前体细胞，会持续附着在纤维上并形成三维球状结构。

中空纤维生物反应器（HFBR）系统支持大多数细胞类型的高密度、化学成分明确且无异源成分的培养，有助于大规模生产细胞外囊泡（EV）²³。每日葡萄糖监测为生物反应器性能提供了可靠的评估指标。该封闭式灌注系统符合cGMP标准，可通过使用更大或多个培养盒实现放大生产。在优化条件下，可能实现克级EV的生产。中空纤维生物反应器在受控条件下为持续、可重复的EV生产和收集提供了稳定平台。本文所述方案强调了实际操作中的关键考虑因素，包括系统安装、无菌操作和代谢监测，以确保操作的一致性和结果的可靠性。未来可能需要进一步研究，以评估不同培养条件下EV的特性与功能属性，并将其性能与其它生产系统进行比较。

该方法广泛适用于研究和临床用途的细胞外囊泡（EV）制备，包括再生医学和治疗应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16 号 1.5" 针头	Stellar Scientific	SOLM-111615
三通止流阀，无菌	Cole-Parmer	UX-48523-28
20 mL 鲁尔锁型注射器	Becton Dickenson	302830
25 mL 血清移液管，无菌	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25 mm 注射器滤器，无菌	Thomas Scientific	1162B74
38 mm 储液罐盖	FiberCell Systems	A1006
50 mL 圆锥形离心管	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL 杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS 无菌酒精消毒片，480 片装	CVS Pharmacy	商品编号 # 376560
中空纤维生物反应器	FiberCell Systems	C2011
人纤维连接蛋白，1 mg	Corning	354008