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基于环状RNA支架的针刀调节RIC8A/P38 MAPK轴促进膝骨关节炎软骨修复

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DOI：

10.3791/71422

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2026年8月18日

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1Department of Tuina, Shuguang Anhui Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of First Clinical Medical College, Anhui University of Chinese Medicine, 3Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine

通讯作者： Yong-Hui Yang <yangyonghui@ahtcm.edu.cn>, Cun Bin Liu <liucb2025@163.com>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究探讨了针刀治疗是否能促进膝骨关节炎兔模型的软骨修复。将50只兔子分为五组，每周进行一次针刀治疗，持续4周。通过评估关节肿胀、组织病理学、炎性细胞因子以及与环状PDE4B/RIC8A/p38 MAPK轴相关标志物，以探究其潜在作用机制。

摘要

膝骨关节炎（KOA）以进行性软骨退变和炎症为特征。本研究探讨了针刀疗法在兔KOA模型中的治疗作用及其与环状RNA磷酸二酯酶4B（circPDE4B）/胆碱酯酶抑制剂抗性蛋白8A（RIC8A）/p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号轴的关联。将50只新西兰白兔随机分为五组（每组n = 10）：对照组、KOA模型组、塞来昔布组、针刀组和假针刀组。采用改良Videman法建立KOA模型。自造模后第6周开始，针刀组每周治疗1次，连续4周；塞来昔布组以24 mg/kg剂量每日灌胃给药，持续4周。评估膝关节肿胀程度及软骨组织病理学变化。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测软骨组织匀浆中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的水平。通过定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）检测与软骨代谢及circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK信号轴相关基因和蛋白的表达。与KOA模型组相比，针刀治疗可减轻膝关节肿胀，改善组织病理学评分，降低炎症细胞因子水平，下调基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、RIC8A及磷酸化p38 MAPK的表达，同时上调SRY-box转录因子9（SOX9）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）和相对circPDE4B的表达。其疗效与塞来昔布相当，而假针刀治疗未见显著改善。上述结果表明，针刀疗法可缓解兔KOA模型中的炎症反应和软骨退变，其作用机制与调控circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK信号轴有关。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是进行性软骨降解、滑膜炎症、软骨下骨硬化和骨赘形成1,2,3。随着全球人口老龄化，KOA 的发病率持续上升，已成为全球中老年人群关节功能障碍和慢性疼痛的主要原因4,5,6。目前临床治疗主要通过药物缓解症状，例如非甾体抗炎药（NSAIDs）和关节腔内注射糖皮质激素。然而，能够阻止疾病进展或促进软骨修复的疾病修饰疗法仍然有限7,8。

越来越多的证据表明，非编码RNA（ncRNA）在膝骨关节炎（KOA）的发病机制及进展过程中发挥着重要的调控作用9,10,11。在这些ncRNA中，环状RNA（circRNA）因其独特的共价闭合环状结构而受到越来越多的关注，这种结构使其比线性RNA更稳定，并具有多种生物学功能12,13。Shen等人报道，circPDE4B可作为分子支架，调控胆碱酯酶8A（RIC8A）/p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路抑制剂的抵抗作用，从而影响软骨细胞外基质代谢和炎症反应14。RIC8A/p38 MAPK通路在调控软骨细胞的炎症、分解代谢、凋亡和衰老过程中发挥重要作用，这些过程均参与了骨关节炎的发病机制15。

刃针是一种微创治疗技术，结合了中医理论与现代解剖学原理，在膝骨关节炎（KOA）的临床管理中显示出良好的疗效16,17。该技术利用特制的针刀器械松解软组织粘连，改善局部血液循环，并恢复病变关节周围的生物力学平衡，从而缓解KOA患者的疼痛并改善关节功能18。尽管已有上述临床益处的报道，但刃针治疗作用的分子机制，尤其是其对参与软骨修复的环状RNA（circRNA）介导信号通路的潜在调控作用，目前仍鲜有研究。

从机制上讲，小针刀通过松解关节周围软组织产生局部机械刺激。软骨细胞是具有机械敏感性的细胞，能够响应生物力学信号，而环状RNA（circRNA）已被证实参与软骨细胞的机械转导过程19,20。尽管目前尚缺乏将小针刀直接与关节软骨特异性circRNA调控关联起来的证据，但从生物学角度而言，小针刀所产生的机械信号可能调节如circPDE4B等机械敏感性circRNA，这一可能性构成了本研究的基础。

在先前关于 circPDE4B 在 RIC8A/p38 MAPK 信号轴中调控作用的研究基础上，本研究采用经改良Videman方法建立的兔膝骨关节炎（KOA）模型，验证针刀松解术通过调控 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 信号通路促进软骨修复的假说。本研究选择针刀松解术而非其他 KOA 干预措施，原因如下：首先，与主要提供症状缓解、疾病修饰作用有限且可能带来长期不良反应的非甾体抗炎药（NSAIDs）和塞来昔布等药物治疗相比7,8，针刀松解术是一种非药物干预手段，可同时调节局部力学因素和生物学信号通路；其次，与需反复关节腔内注射、存在感染和关节损伤风险的关节腔内皮质类固醇或透明质酸注射不同，针刀松解术作用于关节周围软组织，可能产生持续的生物力学和生化效应21；第三，临床证据表明，针刀松解术在减轻 KOA 患者疼痛和改善关节功能方面疗效与常规疗法相当或更优，且实验研究提示其可调节炎症反应和软骨细胞代谢21,22。然而，针刀松解术发挥软骨保护作用的具体分子机制尚不明确，尤其是与环状RNA（circRNA）介导的信号通路相关的作用机制。因此，探讨针刀松解术与 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 信号轴之间的关联，可能为揭示其作用机制提供新视角，并支持针刀松解术作为 KOA 疾病修饰性干预手段的应用16,18。主要观察指标包括膝关节肿胀程度、组织病理学软骨退变评分（Mankin 评分和 Moran 评分）、炎症细胞因子水平（白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-6）、软骨代谢相关标志物表达（基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13、SRY-box 转录因子 9 和聚集蛋白聚糖），以及 circPDE4B 和 RIC8A 的表达水平和 p38 MAPK 的磷酸化状态。针刀松解术在选定的关节周围穴位采用四步操作技术（纵向松解、横向剥离及结节切开），每周治疗一次，共持续4周。通过组织病理学评估、炎症因子检测以及基因和蛋白表达分析，系统评价针刀松解术的作用效果，并探索其在 KOA 中潜在的分子机制。

方案

所有动物实验均按照实验室动物护理与使用的机构指南进行，并经安徽中医药大学动物伦理委员会批准（批准号：AHUCM-rabbits-2023195）。本方案中使用的试剂、化学品、软件和工具列于材料表中。

1. 实验动物与分组
选取50只健康的成年雄性新西兰白兔（6月龄，体重2.0–2.5 kg），购自南京浦口区来福养殖场（动物生产许可证号：SCXK (苏) 2024-0007）。所有动物在实验前均经过1周的适应性饲养。按照统一操作惯例，右膝用于肿胀评估，左膝用于软骨组织采集，而非基于特定实验假设。适应性饲养结束后，将兔子随机分为5组（每组n = 10）：对照组，不进行造模或任何处理；KOA模型组，采用改良Videman法诱导KOA；塞来昔布组，在造模6周后开始药物治疗；针刀组，在造模6周后开始针刀治疗；假针刀组，在造模6周后进行仅穿刺而不切割或松解的假针刀操作。

2. 骨关节炎模型的建立
除对照组外，所有家兔均采用改良的Videman手术方法诱导骨关节炎（KOA）。术前禁食12小时。通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉。常规手术区域准备、消毒并铺无菌巾后，沿膝关节内侧做纵行切口。依次横断内侧副韧带和前交叉韧带，并完全切除内侧半月板。然后逐层缝合切口。

为降低术后感染风险，术后连续3天每日肌肉注射青霉素，剂量为40,000 U/kg。手术后将兔子放回笼中，允许其自由活动，无需关节固定。

3. 假针刀治疗
在膝骨关节炎造模后6周，假针刀组的兔子接受与真实针刀治疗相同的触诊和标记穴位操作。将一支无菌一次性针刀针（0.35 mm × 25 mm）垂直刺入每个标记点的皮肤，直至达到皮下组织。不进行任何切割、松解、横向操作或其他机械松解动作。针具插入后立即退出，不进行组织操作。假治疗每周进行一次，连续进行4周。

4. 针刀治疗
在膝骨关节炎造模后6周，将针刀组的兔子固定于治疗台上。触诊患侧膝关节周围组织，重点在髌骨周围以及内、外侧关节间隙，寻找条索状结构或坚硬结节。根据触诊结果选取4至6个治疗点，并在皮肤上标记。

治疗区域按常规无菌操作进行剃毛和消毒。使用一根无菌的一次性针刀，规格为0.35 mm × 25 mm，缓慢垂直插入每个标记点，直至到达骨面。操作按照四步针刀技术进行。首先进行纵向松解，随后进行横向分离。当遇到硬结时，需切开直至通过针刀感受到明显的松解感。操作完成后，退出针刀，每个穿刺点用无菌纱布短暂按压，并覆盖粘性敷料。治疗每周进行一次，连续进行4周。

5. 药物处理
在骨关节炎造模后第6周，塞来昔布组兔子每日一次通过口服灌胃给予塞来昔布混悬液，剂量为24 mg/kg，连续给药4周。混悬液每日新鲜配制于生理盐水中。供应商及目录号信息见材料表。

6. 膝关节肿胀的评估
在干预期结束时，即膝骨关节炎造模后10周，评估膝关节肿胀情况。将一根柔软的丝线环绕于右膝关节最肿胀的区域，通常位于胫骨平台水平。取下丝线后，用直尺测量其长度至最接近的毫米，记录的长度定义为膝关节周长。

相对溶胀率通过以下公式计算：

相对肿胀率公式，实验兔研究中膝关节周长比较的方程。

7. 样本采集
干预期结束时，通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）对家兔进行麻醉。使用23号手术刀片切开左膝关节，暴露胫骨平台和股骨髁的关节面，并从此区域采集关节软骨组织。

每个软骨样本均分为两部分。其中一部分用4%多聚甲醛固定，用于组织病理学检查；另一部分置于冷冻管中，经液氮迅速冷冻后，于−80 °C保存，待进行分子分析。在完成全部组织采集操作后，立即通过耳缘静脉快速注射空气，造成空气栓塞，将家兔处死。

每组10只兔子的软骨样本（n = 10）用于组织学染色以及Mankin和Moran评分。每组随机选取3只兔子，分别获取具有代表性的苏木精-伊红及番红O-快绿染色图像。免疫组织化学和蛋白质印迹实验使用每组中随机选取的3只兔子的样本（n = 3）进行。定量反转录聚合酶链式反应和酶联免疫吸附测定使用每组中随机选取的6只兔子的样本（n = 6）进行。所有子集样本的选择均在不知晓分组信息的情况下随机完成。

8. 苏木精和伊红染色
用4%多聚甲醛固定的软骨组织在pH 7.4的10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙4–6周。每3天更换一次脱钙液。确认针刺法显示脱钙完成后，将组织经70%、80%、90%、95%和100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。包埋的组织使用切片机切为5 µm厚切片，并将切片贴附于载玻片上。

进行苏木精-伊红染色时，切片在60 °C下加热60分钟，随后用二甲苯脱蜡，每次5分钟，共更换三次，再依次在100%、95%、80%和70%乙醇中梯度水化，最后用蒸馏水冲洗。切片用苏木精染色5分钟，流水冲洗10分钟，用70%乙醇配制的1%盐酸分化2–3秒，再用蒸馏水冲洗。随后切片用伊红染色2分钟，用蒸馏水冲洗后，依次通过70%、80%、90%、95%和100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。观察软骨形态，并使用光学显微镜采集代表性图像。

9. 番红O-快绿染色
将石蜡包埋的软骨切片按照第8节所述方法脱蜡并复水。切片用Weigert铁苏木精染液染色5分钟，用蒸馏水冲洗。随后用0.05%快绿溶液染色3分钟，用1%乙酸短暂冲洗10–15秒，再用0.1%番红O溶液染色5分钟。

染色后，切片依次经95%和100%乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用光学显微镜观察染色切片。使用图像分析软件对番红O染色强度（反映蛋白聚糖含量）进行半定量分析。

10. 组织学评分
两名病理学家在不知晓实验分组的情况下，独立采用 Mankin 和 Moran 评分系统对染色切片进行评估，以评价软骨退变的程度。在评估前，所有切片均被赋予随机的识别编号。在完成全部评分之前，未向病理学家透露分组信息23。

11. 酶联免疫吸附测定
将冷冻软骨组织称重后，加入 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液，于冰上充分匀浆。匀浆液在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 20 分钟，收集上清用于分析。根据试剂盒说明书，使用兔特异性酶联免疫吸附测定试剂盒检测组织上清液中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的浓度。

12. 定量反转录聚合酶链式反应
采用基于苯酚–氯仿的方法从软骨组织中提取总RNA。简而言之，将组织在RNA提取试剂中裂解，加入氯仿以分离水相和有机相。收集水相，用异丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗涤，空气干燥后溶解于焦碳酸二乙酯处理的水中。使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度。

反转录之前，使用基因组DNA去除试剂去除残留的基因组DNA。然后根据生产商说明书，利用反转录试剂盒合成互补DNA。采用基于SYBR Green的检测方法，在实时聚合酶链式反应系统上进行定量聚合酶链式反应。扩增循环条件如下：95 °C预变性1 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性20 s，60 °C退火与延伸1 min。通过熔解曲线分析评估扩增特异性。

基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、SRY框转录因子9（SOX9）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、RIC8A 和 circPDE4B 的表达水平被测定。β-actin 作为内参基因。相对表达量采用 2−ΔΔCt 法计算。引物序列见表 表1.

13. 蛋白质印迹分析
将软骨组织在添加苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀分析缓冲液中裂解。裂解液在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟，收集上清液作为总蛋白组分。采用二辛可宁酸法测定蛋白浓度。

将等量蛋白质（每道30 µg）通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至经甲醇预活化的聚偏二氟乙烯膜上。转膜在4 °C、300 mA条件下进行。转膜时间如下：聚集蛋白聚糖（250 kDa）为90分钟；MMP-3（60 kDa）、RIC8A（59 kDa）、SOX9（56 kDa）和MMP-13（52 kDa）为50分钟；p38 MAPK（41 kDa）和GAPDH（36 kDa）为40分钟。膜在含0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中加入5%脱脂奶粉，室温封闭2小时。随后，膜在4 °C下与以下一抗孵育过夜：MMP-3（1:2,000）、MMP-13（1:1,000）、SOX9（1:1,000）、聚集蛋白聚糖（1:1,000）、RIC8A（1:1,500）、磷酸化p38 MAPK（1:1,000）和总p38 MAPK（1:2,000）。GAPDH（1:2,000）作为上样对照。用含0.1%吐温20的Tris缓冲盐水洗涤3次（每次10分钟）后，膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（1:20,000）在室温下孵育1.2小时。再经三次洗涤后，使用增强型化学发光底物显色，并通过凝胶成像系统采集图像。使用ImageJ软件对蛋白条带强度进行定量，并以GAPDH为内参进行归一化处理。

14. 免疫组织化学
将石蜡包埋的软骨切片通过梯度乙醇系列进行脱蜡和复水（二甲苯浸泡三次，每次5分钟；随后依次为100%、95%和80%乙醇，每次3分钟）。在压力锅中用EDTA缓冲液（pH 9.0）加热进行抗原修复：将缓冲液加热至沸腾，加压后继续处理2分钟，随后冷却至室温。在室温下用3%过氧化氢孵育10分钟以封闭内源性过氧化物酶活性。洗涤后，在避光条件下用山羊血清室温孵育20分钟以阻断非特异性结合。

切片在37 °C下与抗磷酸化p38 MAPK（1:800）和抗磷酸化核因子κB（NF-κB）（1:300）的一抗孵育60分钟。用含Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤三次后，切片在37 °C下与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育30分钟。再经三次洗涤后，使用二氨基联苯胺显色（在显微镜下控制），随后进行苏木精复染（2分钟）、在70%乙醇中的1%盐酸中分化，以及在碳酸锂溶液中蓝化（30秒）。切片随后脱水、透明、封片，并用光学显微镜观察。使用ImageJ软件评估染色结果，并计算积分光学密度以进行半定量分析。

15. 统计学分析
数据以均值 ± 标准误表示。多个组之间的比较采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 事后检验。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

针刀松解术可缓解关节软骨的组织学改变
如图1A、B所示，与对照组相比，膝骨关节炎（KOA）模型组的膝关节周长和相对肿胀率显著增加。经针刀或塞来昔布治疗后，上述两项指标均显著降低，而假针刀治疗组与KOA模型组相比无显著改善。

如图1C、D所示，KOA模型组的Mankin评分显著高于对照组，而针刀或塞来昔布治疗后该评分显著降低。假针刀组未观察到显著降低。Moran评分则呈现相反的趋势。

与对照组相比，KOA模型组的苏木精-伊红染色及番红O-快绿染色显示关节软骨表面变薄且不连续，并伴有局部糜烂（图1E,F）。针刀松解术与塞来昔布可改善这些病理改变，表现为软骨轮廓更清晰、结构损伤减轻。相比之下，假针刀组的病理特征与KOA模型组相似。这些结果表明，在减轻关节肿胀、软骨退变以及改善KOA模型组织学评分方面，针刀松解术的效果与塞来昔布相当。

针刀治疗可降低炎症细胞因子水平
如图2A–C所示，膝骨关节炎（KOA）模型组软骨组织匀浆中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的浓度显著高于对照组。针刀或塞来昔布治疗均可显著降低这三种炎症细胞因子的水平。相比之下，假针刀组与KOA模型组相比无显著降低。

针刀松解术在蛋白水平调控 RIC8A/p38 MAPK 信号通路
免疫组织化学分析显示，针刀松解组和塞来昔布组中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）和磷酸化核因子κB（NF-κB）的表达水平均显著低于膝骨关节炎（KOA）模型组（图3A）。假针刀组与KOA模型组之间未观察到显著差异。

Western blot 分析显示，与对照组相比，KOA 模型组中基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、胆碱酯酶抑制剂抗性蛋白 8A（RIC8A）以及磷酸化 p38 MAPK 的蛋白水平显著升高，而软骨合成相关蛋白 SRY-box 转录因子 9（SOX9）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的水平则显著降低。与 KOA 模型组相比，针刀组和塞来昔布组中 MMP-3、MMP-13、RIC8A 和 p-p38 MAPK 的表达减少，SOX9 和 aggrecan 的表达增加。假针刀组的蛋白表达模式与 KOA 模型组相似，各检测蛋白均无显著变化（图 3B–I）。这些结果表明，针刀和塞来昔布对 KOA 的作用与调控 RIC8A/p38 MAPK 信号通路有关。

针刀调节转录水平上的 RIC8A/p38 MAPK 信号通路
如图 4A–G 所示，KOA 模型组中 MMP-3、MMP-13 和 RIC8A 的表达水平显著高于对照组，而 SOX9 和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达水平显著降低。与 KOA 模型组相比，针刀治疗和塞来昔布（celecoxib）均降低了 MMP-3、MMP-13 和 RIC8A 的表达，并提高了 SOX9 和聚集蛋白聚糖的表达水平。假针刀组在所测转录水平指标上与 KOA 模型组相比无显著差异。

小针刀还增加了circPDE4B的相对表达水平，表明其治疗作用与调控circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK信号轴以及减轻炎症和分解代谢信号有关。

数据可用性：
支持本研究发现的原始数据，包括 ELISA、H&E 染色、免疫组织化学、RT‑qPCR、番红 O–固绿染色以及 Western blot 数据，均公开获取于 Figshare 数据库，网址为 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935。

膝骨关节炎治疗比较；柱状图、组织学图像；分析治疗效果。
图1. 针刀治疗减轻膝骨关节炎兔模型的膝关节肿胀和关节软骨退变。（A）膝关节周长。（B）相对膝关节肿胀率。（C）Mankin组织学评分。（D）Moran组织学评分。（E）对照组、膝骨关节炎（KOA）模型组、塞来昔布组、针刀组和假针刀组关节软骨的代表性苏木精-伊红染色切片。（F）五个实验组的代表性番红O-快绿染色切片。组织学评分（Mankin和Moran评分）采用每组全部10只兔子的样本进行（n = 10），而苏木精-伊红（H&E）和番红O-快绿染色的代表性图像则来自每组随机选取的3只兔子。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。统计学比较采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。水平线表示比较的组别。P < 0.05，P < 0.01，和 P < 0.001。比例尺：100 µm。缩写：KOA = 膝骨关节炎；SEM = 均值标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

IL-1β、IL-6、TNF-α水平在KOA治疗组与对照组中的柱状图比较
图2. 小针刀降低膝骨关节炎兔模型中的炎性细胞因子水平 (A) 白细胞介素-1β浓度。 (B) 白细胞介素-6 浓度。 (C肿瘤坏死因子-α浓度。每组六个兔子（n = 6）的样本通过酶联免疫吸附测定法测量细胞因子浓度。数据以均值 ± 标准误表示。统计比较采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。水平条表示被比较的组别。 P < 0.05, P < 0.01，和 P < 0.001. 缩写：IL-1β = interleukin-1β；IL-6 = interleukin-6；KOA = 膝骨关节炎；SEM = 均值标准误；TNF-α = tumor necrosis factor-α。 请点击此处以查看此图的放大版本。

组织学图像、蛋白质表达分析、柱状图；膝骨关节炎治疗结果
图3. 针刀调节膝骨关节炎兔模型中炎症及软骨代谢相关蛋白 (A代表性免疫组织化学图像，显示对照组、KOA模型组、塞来昔布组、针刀组和假针刀组关节软骨中磷酸化核因子κB和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶的表达。比例尺， 100 µm. (B代表性 Western 印迹显示 SOX9、RIC8A、MMP-13、磷酸化 p38 MAPK、总 p38 MAPK、MMP-3、聚集蛋白聚糖和 GAPDH 的表达。C) 以GAPDH为内参的聚集蛋白聚糖密度定量分析。D) MMP-13 相对于 GAPDH 的归一化定量。E) 以GAPDH为内参的MMP-3定量分析。F) 以GAPDH为内参的总p38 MAPK定量分析。G) 以GAPDH为内参的磷酸化p38 MAPK定量分析。H) 以GAPDH为内参的SOX9定量分析。I) 以GAPDH为内参的RIC8A蛋白定量。每组使用三只兔子的样品进行Western印迹分析（n = 3）。数据以均值 ± 标准误表示。采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验进行统计学比较。水平条表示被比较的组别。 P < 0.05, P < 0.01，和 P < 0.001. 缩略语：GAPDH = 甘油醛-3-磷酸脱氢酶；KOA = 膝骨关节炎；MAPK = 丝裂原活化蛋白激酶；MMP-3 = 基质金属蛋白酶-3；MMP-13 = 基质金属蛋白酶-13；NF-κB = 核因子κB；p-NF-κB = 磷酸化核因子κB；p-p38 MAPK = 磷酸化p38 MAPK；RIC8A = 乙酰胆碱酯酶抑制剂抗性蛋白8A；SEM = 均值标准误；SOX9 = SRY-box 转录因子9 请点击此处以查看此图的放大版本。

蛋白表达（聚集蛋白聚糖、MMPs、p38 MAPK、SOX9）相对于β-肌动蛋白的柱状图，药物处理效应。
图4. 针刀调节膝骨关节炎兔模型中与软骨代谢相关转录本及circPDE4B的表达。 （A）聚集蛋白聚糖相对表达量。（B）MMP-3相对表达量。（C）MMP-13相对表达量。（D）p38 MAPK相对表达量。（E）SOX9相对表达量。（F）circPDE4B相对表达量。（G）RIC8A相对表达量。采用定量反转录聚合酶链反应检测表达水平，并以参考基因进行标准化。每组使用六只兔子的样本进行分析（n = 6）。数据以均值±标准误（SEM）表示。统计学比较采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。水平条表示被比较的组别。P < 0.05，P < 0.01，以及 P < 0.001。缩写：circPDE4B = 环状RNA磷酸二酯酶4B；KOA = 膝骨关节炎；MAPK = 丝裂原活化蛋白激酶；MMP-3 = 基质金属蛋白酶-3；MMP-13 = 基质金属蛋白酶-13；RIC8A = 胆碱酯酶抑制剂抗性蛋白8A；SEM = 均值标准误；SOX9 = SRY-box转录因子9。请点击此处查看该图的放大版本。

基因扩增子大小正向引物反向引物
（bp）（5'→3'）（5'→3'）
β-actin113CAGCCCTCCTTCATCGGTATGACATGACGTTGTTGGCGTA
MMP-3108TGTGAGTTGAAGTGGCTCATCCTGTTTGAACACCCGTAAC
MMP-13119GGCTCCTAGGCAAGTACAATGTGTACGCCCATCAGGATAA
SOX985GGAGGAAGTCGGTGAAGAATGCCTTGAAGATGGCGTTG
Aggrecan70TTGATGAGTGCCTTTCAAGCCATGTGAAAGAGTCGATGGC
RIC8A100ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGCTCGATGACAGAGTACTGGTTG
p38 MAPK103TGTTCAAGGTCTCCCACAAGTGCAGCTCCCTTATGATCTG
CircPDE4B174GTCATTTTGCCGAACTCCCCATTATCATCTGCCGTCACTG

表1：用于定量反转录聚合酶链式反应的引物序列。 该表格列出了目的基因、预期扩增片段大小以及5′至3′方向的正向和反向引物序列。缩写：bp = 碱基对；circPDE4B = 环状RNA磷酸二酯酶4B；MAPK = 丝裂原活化蛋白激酶；MMP-3 = 基质金属蛋白酶-3；MMP-13 = 基质金属蛋白酶-13；RIC8A = 胆碱酯酶抑制剂抗性蛋白8A；SOX9 = SRY盒转录因子9。

讨论

本研究评估了针刀疗法在膝骨关节炎（KOA）兔模型中的治疗效果，并发现circPDE4B表达与RIC8A/p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号轴之间存在关联。针刀治疗可改善关节肿胀和组织病理学改变，并在转录和蛋白水平上调节炎症及软骨代谢相关标志物。

在针刀治疗后，白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的降低与既往报道的针刀免疫调节作用一致21。这些细胞因子通过促进基质降解酶的表达并抑制细胞外基质合成，参与软骨退变过程22,24,25。同时，在转录和蛋白水平上，基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的降低进一步表明，针刀可抑制与膝骨关节炎（KOA）相关的分解代谢活性。

一个显著的发现是刀刺疗法引起 circPDE4B 表达变化与 RIC8A/p38 MAPK 通路调控之间的关联。该通路的异常激活与炎症、氧化应激以及细胞外基质降解相关。刀刺疗法后 RIC8A 表达和 p38 MAPK 磷酸化水平的降低提示，该治疗可能有助于恢复此通路内的信号平衡。circPDE4B 与 RIC8A/p38 MAPK 相关标志物的协调性变化与既往提出的 circPDE4B 可能作为分子支架发挥作用的假说一致26,27。然而，目前的研究结果仅为相关性，并未证实 circPDE4B 介导了刀刺疗法的治疗效应。尚需通过功能缺失和功能获得实验来确定其因果关系。

刀刺疗法与circRNA调控之间的潜在关联是本研究的一个重要方面。已有研究表明，机械刺激可在多种组织中影响circRNA的表达28,29,30,31。然而，将刀刺疗法所诱导的机械刺激直接与关节软骨特异性circRNA调控联系起来的证据仍然有限。治疗后circPDE4B相对表达量的变化可能反映了对机械刺激的直接响应，也可能是对炎症减轻的间接响应。未来结合可控机械刺激与软骨细胞特异性circPDE4B调控的研究将有助于区分这两种可能性。

尽管针刀与塞来昔布的作用机制不同，但在多种测定指标上表现出相似的趋势。这种趋同现象可能有多种解释。首先，两种治疗方式可能作用于共同的下游通路，包括RIC8A/p38 MAPK轴和核因子κB信号通路。其次，观察到的相似性可能反映了软骨保护的共同特征，而非特定通路的作用效果。第三，所选的生物标志物可能代表了炎症和软骨代谢的共同终点，因此可能不足以区分不同的上游机制。疗效相似并不意味着机制相同，但提示这两种干预措施可能影响骨关节炎病理网络中的共同组分26,32,33。无偏倚的研究方法（如转录组学或蛋白质组学分析）可能有助于界定不同治疗方式特有的分子特征谱。

针刀与塞来昔布的类似疗效可能也具有临床意义。针刀可能提供一种非药物治疗选择，可在避免长期用药相关不良反应的同时，针对关节周围机械因素进行干预。然而，对此解释应持谨慎态度，因为兔模型未能完全模拟人类膝骨关节炎（KOA）的复杂性。在这些临床前研究结果支持更广泛的临床应用之前，尚需开展进一步的转化研究和临床研究。

应当承认存在若干局限性。首先，尚未通过功能缺失或功能获得实验验证circPDE4B与RIC8A/p38 MAPK轴之间的关联。其次，兔模型及4周的治疗周期限制了对人类疾病和长期结局的推论。第三，分子检测所用的动物样本量相对较小，可能影响对组间细微差异的检测。第四，所选的标志物组合可能无法区分治疗特异性的上游机制。最后，针刀与塞来昔布产生的相似反应需要进一步研究，以明确这两种干预措施是通过汇聚通路还是独立通路发挥作用。

结论
在膝骨关节炎（KOA）兔模型中，小针刀可减轻关节肿胀、降低炎症细胞因子水平、缓解软骨退变并减少分解代谢标志物的表达。这些效应与circPDE4B相对表达水平的变化以及RIC8A/p38 MAPK信号通路的调节相关。由于目前的研究结果仅为相关性发现，尚需进一步的机制研究以明确circPDE4B是否直接介导了小针刀的治疗作用。

披露

作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究受到国家自然科学基金（项目编号：81774436）、安徽省临床医学研究转化项目（项目编号：202427b10020136）、安徽省教育厅科学研究项目（项目编号：2023AH050824）、安徽省卫生健康科研项目（项目编号：AHWJ2023A30123）以及安徽省中医药学会传承与创新研究项目（项目编号：2024ZYYXH153）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3% 过氧化氢Fuzhou Maixin BiotechSP kit-A3在免疫组织化学中阻断内源性过氧化物酶活性。
4% 多聚甲醛BiosharpBL539A在脱钙和组织学处理前固定软骨组织。
乙酸MerckA6283用于配制70%中的1%盐酸
创可贴浙江仁康RK-8802用于针刀术后。
聚集蛋白聚糖抗体Proteintech13880-1-AP用于检测软骨蛋白提取物中的聚集蛋白聚糖的一抗。
无水乙醇国药集团化学试剂10009228用于组织脱水和切片复水等组织学处理过程。
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Fisher ScientificA55860用于测定蛋白浓度。
塞来昔布BiochempartnerBCP02156通过灌胃给予的参考药理学治疗药物。
离心机安徽嘉文仪器JW-3021HR通过离心分离澄清组织裂解液和匀浆液。
氯仿南京试剂67-66-3用于总RNA提取过程中的相分离。
柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0ZSGB-BIOZLI-9065用于免疫组织化学前的热诱导抗原修复。
冻存管NEST 生物科技607001用于冷冻样本储存
DAB 底物Fuzhou Maixin BiotechKit-5230用于显色HRP标记的免疫组织化学信号的显色底物。
DEPC处理水Generay 生物科技D1007无RNase水，用于RNA溶解和分子生物学实验。
一次性针刀针，0.35 mm × 25 mm马鞍山邦德医疗器械GB3525R用于针刀术和假针刀术操作的无菌针刀。
EDTAbiosharpBL617A用于配制含软骨组织的脱钙溶液。
增强型化学发光底物Thermo 340958340958用于显色Western blot条带。
伊红溶液珠海贝索BA4022用于苏木精-伊红染色的复染剂。
快绿溶液SolarbioG1371用于番红O–快绿染色的复染剂。
GAPDH 抗体ZsbioTA-08用作Western blot上样对照，但目前未列出。
凝胶成像系统上海培清科技JS-1070P用于捕获化学发光Western blot图像。
玻璃载玻片CITOTEST‌188105用于切片贴附
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgGZSGB-BIOZB-2305用于小鼠一抗的HRP标记二抗。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgGZSGB-BIOZB-2301用于兔一抗的HRP标记二抗。
山羊血清ZSGB-BIOZLI-9056在免疫组织化学中阻断非特异性抗体结合。
GraphPad Prism，版本10GraphPad Software不适用用于统计分析和图表制作。
苏木精溶液珠海贝索BA4041用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学复染的核染剂。
匀浆器WitegSGCR-5-553-722用于软骨组织匀浆，以进行ELISA和分子检测。
盐酸Merck7607用于配制70%中的1%盐酸
Image Lab 软件Bio-Rad不适用用于Western blot条带的密度分析。
Image-Pro Plus，版本6.0Media Cybernetics不适用用于番红O染色强度的半定量分析。
异丙醇国药集团化学试剂SCR40007960用于总RNA提取过程中RNA的沉淀。
光学显微镜OlympusCX41用于观察和成像染色的软骨切片。
医用标记笔edding497985用于标记治疗点
甲醇上海苏懿20180427用于活化PVDF膜
切片机LeicaRM2016将石蜡包埋组织切成5 µm切片。
MMP-13 抗体Biossbs-0575R用于检测基质金属蛋白酶-13的一抗。
MMP-3 抗体Biossbs-43017R用于检测基质金属蛋白酶-3的一抗。
中性树脂无锡江源ZLI-9516用于染色组织切片永久封片的封固介质。
新西兰白兔（雄性，6月龄，体重2.0–2.5 kg）南京浦口区来福养殖场SCXK (苏) 2024-0007用于膝骨关节炎建模和治疗评估的实验动物。
23号手术刀片CaissonSCX08-100PC用于样本采集。
脱脂奶粉Gene9999S用作封闭试剂。
p38 MAPK 抗体Biossbs-0637R用于检测总p38 MAPK的一抗。
石蜡Thermo8330用于组织包埋
PBSZSGB-BIOZLI-9062用于组织匀浆、洗涤和试剂配制。
青霉素吉林华牧动物保健品不适用术后以40,000 U/kg/天剂量使用
戊巴比妥钠北京化学试剂61222以3%、30 mg/kg剂量用于麻醉。
磷酸盐缓冲液beyotimeST448用于免疫组织化学中的组织匀浆和洗涤。
生理盐水servicevioG4702用于配制塞来昔布混悬液
PMSFBeyotimeST506在蛋白提取过程中加入裂解缓冲液中的蛋白酶抑制剂。
p-NF-κB 抗体Santasc-136548用于免疫组织化学分析中检测p-NF-κB的一抗。
p-p38 MAPK 抗体Biossbs-5476R用于检测磷酸化p38 MAPK的一抗。
含gDNA Eraser的PrimeScript RT 试剂盒TaKaRaRR047A用于基因组DNA去除和RNA逆转录为cDNA。
PVDF 膜MilliporeIPVH00010用于Western blot中蛋白转膜的膜。
兔IL-1β ELISA 试剂盒吉因生物JYM0011Rb定量分析样本中兔白细胞介素-1β。
兔IL-6 ELISA 试剂盒吉因生物JYM0006Rb定量分析样本中兔白细胞介素-6。
兔TNF-α ELISA 试剂盒吉因生物JYM0003Rb定量分析样本中兔肿瘤坏死因子-α。
实时PCR系统Thermo Fisher ScientificPIKOREAL 96进行基于荧光的定量PCR扩增。
RIC8A 抗体Biossbs-11355R用于检测RIC8A的一抗。
RIPA 裂解缓冲液BeyotimeP0013B从软骨组织中提取总蛋白。
番红O溶液SolarbioG1371在番红O–快绿组织学染色中染色软骨蛋白聚糖。
SDS-PAGE 试剂或预制胶SolarbioS8010包括凝胶浓度或产品。
SOX9 抗体Biossbs-4177R用于检测SOX9的一抗。
分光光度计南京悟易科技OD1000+测定RNA浓度和纯度。
无菌纱布振德V505463用于拔针后压迫止血。
SYBR Green Master MixNovoproteinE096-01B用于定量PCR的荧光试剂。
Tris缓冲盐水SolarbioT8060用于配制Western blot的洗涤和封闭缓冲液。
TRIzol 试剂Life Technologies15596018用于总RNA提取的苯酚–胍盐试剂。
Tween 20SolarbioT8220非离子型去垢剂，添加至Tris缓冲盐水和磷酸盐缓冲液洗涤液中。
Weigert 铁苏木精溶液Merck1.15973用于番红O–快绿染色。
二甲苯国药集团化学试剂10023428用于脱蜡和组织透明化。

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