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方法文章

一种用于研究炎症诱导代谢改变的吡罗昔康加速型白细胞介素-10基因敲除小鼠肠炎模型

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DOI：

10.3791/71448

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2026年8月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, The University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Pathology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

本方案采用吡罗昔康加速白细胞介素（IL-10）基因敲除小鼠模型中结肠炎的发展。该方案可确保结肠炎进程的同步性，从而获得严格且可重复的实验结果，且结果不受性别、背景品系或动物饲养条件的影响。该模型可用于研究肠道炎症期间的代谢改变，具有重要应用价值。

摘要

炎症性肠病（IBD）是一种影响全球超过一千万人的消化道慢性炎症性疾病。尽管已有大量研究聚焦于IBD的免疫机制及其后果，但对黏膜炎症如何导致代谢紊乱（包括体重减轻和食欲下降）的理解仍较为有限。本文作者描述了一种在白细胞介素-10基因敲除（IL-10-KO）小鼠中使用吡罗昔康加速诱导肠炎的小鼠模型，用于研究炎症引起的代谢失调。已知IL-10-KO小鼠会自发发展为肠炎，并对由感染或药物触发的肠炎具有更高的易感性。然而，已有报道指出，动物饲养环境和遗传背景可能成为该模型中结肠炎发展的混杂因素。吡罗昔康是一种非甾体抗炎药（NSAID），已被证明可通过增加黏膜对管腔细菌的暴露，从而在动物模型中诱发或加速肠炎的发生。在本实验方案中，雄性和雌性IL-10-KO小鼠被给予含吡罗昔康的强化饲料，以替代常规饲料。每日测量食物摄入量和体重，以反映全身性代谢变化，同时记录肠炎的临床表现，如腹泻和直肠出血。该方案高效且可重复，能够在多只小鼠中同步诱导肠炎，从而允许在炎症性肠病模型中评估代谢失调情况。未来利用该方案的进一步研究可探讨肠炎对其他代谢紊乱组分的影响，例如能量消耗和体成分的变化，揭示炎症性肠病与宿主代谢之间更广泛的关联。

引言

克罗恩病和溃疡性结肠炎统称为炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD），是一类以黏膜炎症为特征的胃肠道慢性自身免疫性疾病，临床表现包括腹痛、体重减轻、便血和腹泻。全球有数百万人受此病影响，其中以西方化社会的患病率最高1。在美国，估计有超过300万人患病2,3，且发病率和患病率呈上升趋势，尤其在儿童和年轻人中更为明显4,5。

IBD 发病机制的确切机理尚未完全阐明，但普遍认为该疾病是由于遗传易感个体对肠道微生物群产生过度免疫反应所致。调节炎症反应的细胞因子在维持肠道稳态以及 IBD 的发生发展中起着关键作用。其中，白细胞介素-10（IL-10）是一种研究较为深入的抗炎细胞因子，可通过调节免疫反应的先天性和适应性免疫两个分支，在人体内帮助维持免疫稳态6,7。值得注意的是，在极早发 IBD（VEO-IBD）婴儿患者中已发现 IL-10 及其受体（IL-10RA/B）的多态性，这类患者通常在出生后最初数月内即出现肛周病变8。这一关联性在针对克罗恩病成人患者的大规模外显子组测序研究中进一步得到支持，该研究将 IL-10RA 鉴定为非单基因遗传性 IBD 的疾病易感位点9。此外，在 VEO-IBD 患者中还发现了一种涉及 IL-10 中和抗体的非遗传性通路，进一步凸显了该通路在维持黏膜免疫稳态中的重要性10。

基于人类研究中关于IL-10在炎症性肠病（IBD）中作用的证据，已开发出白细胞介素-10基因敲除（IL-10-KO）小鼠模型，用于研究IL-10在IBD中的功能。已知IL-10-KO小鼠在受到刺激时会产生过度的CD4+ Th1反应，并在8–12周龄时自发发展为肠结肠炎11。然而，在缺乏促发因素的情况下，IL-10-KO小鼠自发性肠结肠炎的发展可能具有不可预测性12,13,14，其表现取决于遗传背景、肠道微生物组成以及饲养条件15,16。因此，采用一种可靠的结肠炎诱导方案对于IL-10-KO模型的实际应用至关重要。以往研究曾使用非甾体抗炎药（NSAIDs）如吡罗昔康来诱导IL-10-KO小鼠发生肠结肠炎17,18。然而，这些研究主要关注免疫学改变，对肠结肠炎对代谢的影响或性别在结肠炎严重程度中的作用则相对较少涉及19。本文作者描述了使用添加吡罗昔康的饮食诱导IL-10-KO小鼠发生肠结肠炎的方法，并利用雄性和雌性小鼠对该模型中的代谢紊乱及黏膜炎症反应进行了表征。该方案通过检测体重和食物摄入量来反映整体代谢变化，同时评估结肠炎的临床表现以及组织病理学和转录组学变化以反映黏膜炎症情况。这一高效且可重复的模型为研究IBD与宿主代谢之间的关联提供了有价值的工具。

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方案

所有动物实验均按照德克萨斯大学西南医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行，符合《实验动物照护与使用指南"》的要求[批准编号：2017-102011]。安乐死操作依照机构指南执行。所进行的操作无需麻醉。材料的具体信息详见材料表。

1. 在IL-10基因敲除小鼠中建立吡罗昔康加速的肠炎模型

  1. 在12小时光照循环的特定病原体-free（SPF）设施中饲养IL-10-KO小鼠，并提供 随意摄取 自由摄取饲料和水。
  2. 将7至8周龄、年龄和性别匹配的小鼠 individually 置于独立通气隔离笼（microisolator cages）中饲养。在实验开始前，让小鼠适应单只饲养和每日抓取操作至少一周。
    注意：确保体重数据 >20 克（雄性）或 >雌性小鼠体重为17 g，且无打斗造成的伤口。
  3. 将小鼠分为实验组和对照组。对于实验组，用添加吡罗昔康的饲料替代标准饲料；对于对照组，提供新鲜的标准饲料。每个笼子的饲料盒中加入50 g饲料。
    注意：每组每种性别至少分配五只小鼠。含吡罗昔康的强化饲料（200 ppm）由Teklad公司使用研究人员提供的吡罗昔康制备，用于生产定制的实验动物饲料。为尽量减少批间差异，建议同一实验中的所有动物均使用同一批次生产的饲料。在条件允许的情况下，不同实验之间也应使用同一批次饲料，以提高实验的可重复性。

2. 体重与摄食行为的监测

  1. 使用分析天平记录每只小鼠的体重。每天在同一时间逐只称量小鼠体重，连续7天。将每日体重以第0天（设定为100%）基础体重的百分比形式报告。
    注意：若体重减轻超过20%，表明小鼠承受过度应激，有即将死亡的风险。一旦达到此阈值，应实施安乐死。
  2. 使用分析天平记录每笼中添加吡罗昔康的饲料和标准饲料的初始重量。
  3. 随后，每天在同一时间测量每笼饲料槽中剩余饲料的重量，连续7天。
  4. 通过用前一天的饲料重量减去当日剩余饲料重量，计算每日饲料消耗量。
    注意：应定期检查饲料量，若低于10 g应及时补充。吡罗昔康饲料的适口性不影响摄食量，其摄食量应与标准饲料相近。

3. 疾病活动度的监测

  1. 在第0天和第7天，目视检查每只小鼠的粪便颗粒，判断粪便中是否存在血液。
  2. 若未见明显血液，取一粒粪便涂抹于检测试纸上，加入提供的显色试剂进行粪便隐血试验。根据表1对结果进行评分。
  3. 在第0天和第7天，目视检查新排出的粪便颗粒以评估粪便性状。可使用平头镊子辅助判断粪便性状。根据表1对结果进行评分。
  4. 在第0天和第7天，通过观察肛周区域评估直肠脱垂程度。根据表1对结果进行评分。
  5. 按上述方法测量体重。根据表1对结果进行评分。
    注意：疾病活动指数（DAI）评分应由同一名研究人员以盲法在整个实验过程中完成，以确保一致性，减少观察者偏倚，并提高评估的可靠性。

4. 结肠组织的采集

  1. 按照文献报道的方法，通过 CO2 窒息结合颈椎脱位处死小鼠20。
  2. 将小鼠置于仰卧位，并用 70% 乙醇喷洒腹部腹侧。
  3. 用镊子提起皮肤，使用手术剪沿正中线剪开，暴露腹膜腔并定位结肠。
  4. 通过钝性分离暴露结肠和盲肠，整块切除结肠（en bloc），包括盲肠和肛管组织。
  5. 将结肠置于平坦表面，去除所有结缔组织。
  6. 测量并记录结肠长度。
  7. 测量结肠长度后，在盲肠-结肠交界处剪切，移除盲肠。
  8. 准备一支 10 mL 注射器，内含磷酸盐缓冲液（PBS），并连接可重复使用的 22 号球头不锈钢灌胃针。将针头插入结肠，冲洗肠腔内容物。
  9. 将冲洗后的结肠放入含有 PBS 的培养皿中，再次冲洗以去除残留内容物。待内容物完全清除后，用于后续实验分析。

5. 组织学分析

  1. 将结肠平放在玻璃载片上。用镊子从远端开始将组织自身卷绕，形成“瑞士卷”状。以此方式，远端/肛端将位于内层卷中，而近端区域则延伸至外层卷。
  2. 使用27号针头将卷好的结肠固定，以维持其卷曲状态，并将其放入包埋组织盒中。
  3. 为固定组织，将组织盒浸入10%缓冲福尔马林溶液中，在4 °C下固定16小时。
    警告：10%福尔马林接触皮肤有害，可导致严重皮肤灼伤和眼部损伤。操作时应谨慎，佩戴防护手套和护目镜。残留的福尔马林应按照机构规定妥善处理。
  4. 福尔马林固定后，将组织进行石蜡包埋处理，并切片后贴附于玻璃载片上。
    注：样品应提交至具备相应设备的组织学实验室，以完成组织盒的石蜡处理、卷片切片、载片贴附及苏木精-伊红染色。
  5. 按照既定方案对组织切片进行苏木精-伊红（HE）染色21。
  6. 根据表2中描述的组织学评分系统，评估每张切片中的以下组织学特征：肠炎引起的组织损伤、固有层炎性细胞浸润以及受累面积百分比。将每张切片中的各项评分相加，得出总分（表2）。
    总分 = 特征 × 受累程度（组织损伤） + 特征 × 受累程度（固有层炎性细胞浸润）  （1）
  7. 组织损伤和细胞浸润的代表性组织病理学图像可参见Erben等人的发表文献22。
    注：组织学评分应以盲法进行，最好由经过培训的病理学家完成，以确保评估的一致性和可靠性。

6. 甲醛固定石蜡包埋组织的免疫荧光染色

  1. 将组织切片放入切片架中，并置于55 °C的切片烘干机中1小时，以熔化石蜡。
  2. 将切片放入染色架中，依次将染色架浸入含二甲苯的染色缸中3分钟。重复此步骤3次。
  3. 将染色架浸入含100%乙醇的染色缸中3分钟。重复此步骤3次。
  4. 将染色架浸入含95%乙醇的染色缸中3分钟。
  5. 将染色架浸入含80%乙醇的染色缸中3分钟。
  6. 将染色架浸入含去离子水（DI水）的染色缸中5分钟。
    注意：由于二甲苯蒸气的存在，所有前述步骤必须在通风橱中进行。操作时应佩戴防护手套和护目镜，并谨慎处理。残留的二甲苯应根据机构规定妥善处置。
  7. 将切片转移至切片架中，并浸入含1×柠檬酸修复液的染色缸中。
  8. 将染色缸放入染色盘支架中。
  9. 将染色盘支架放入压力锅中。
  10. 在压力锅中加热15分钟。
  11. 从压力锅中取出切片，并使其冷却至室温。
  12. 在湿盒中，每张切片加入300 µL封闭缓冲液（含3.5%山羊血清的PBS溶液），孵育1小时。确保组织完全被封闭缓冲液覆盖。
  13. 在湿盒中，每张切片加入300 µL用封闭缓冲液稀释的一抗溶液，在4 °C孵育16小时。确保组织完全被一抗覆盖。使用的一抗为：Anti-S100A8/S100A9（1:500）。
    注意：一抗的稀释比例因试剂而异，应遵循供应商的推荐说明。
  14. 将切片在染色缸中依次浸入PBS溶液中，每次5分钟，重复3次进行漂洗。
  15. 在湿盒中，每张切片加入300 µL用封闭缓冲液稀释的荧光二抗溶液，在室温孵育1小时。确保组织完全被二抗覆盖。使用的荧光二抗为：山羊抗兔Alexa Fluor 555（1:150稀释）。
    注意：自此步骤起，切片应避光保存，以防止荧光染料发生光漂白。二抗的稀释比例因试剂而异，应遵循供应商的推荐说明。
  16. 将切片在染色缸中依次浸入PBS溶液中，每次5分钟，重复3次进行漂洗。
  17. 将切片浸入用PBS按1:5000稀释的Hoechst染色液中，染色20分钟。
  18. 将切片在染色缸中依次浸入PBS溶液中，每次5分钟，重复3次进行漂洗。
  19. 用无磨损性纸巾小心擦去切片表面残留的PBS。每张切片加入50 µL抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。

7. RNA 提取

  1. 将整个结肠或结肠片段在液氮中速冻，然后于 -80 °C 保存。或者，将其浸入 1.5 mL RNALater 保存液中，并按照制造商说明进行储存。
  2. 解冻先前冷冻的结肠组织，置于平坦表面。使用手持式匀浆器对组织进行破碎和均质化处理。
  3. 使用试剂盒提取 RNA，并遵循制造商提供的操作说明。
  4. 使用分光光度计测定 RNA 浓度。A260/A280 比值> 1.8 且 A260/A230 比值在 2.0–2.2 范围内，表明 RNA 纯度符合要求。
  5. 进行逆转录反应，随后使用 SYBR Green 插入染料进行定量 PCR（qPCR）。
  6. 使用定量分析平台或类似仪器分析结果。

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结果

雄性和雌性IL-10-KO小鼠在短期摄入含吡罗昔康的饲料后均会发展为肠结肠炎（图1A–E）。在第2天时，接触吡罗昔康的小鼠体重下降程度显著高于同性别普通饲料喂养的对照组，且不同性别间体重下降程度相似（图1B）。在整个吡罗昔康暴露及肠结肠炎发展过程中，每日表观食物摄入量保持不变，与标准饲料摄入量相近，表明该模型中的体重下降并非主要由摄入减少引起，而是由促进代谢消耗的其他因素所致（图1C）。

为了进一步研究肠道炎症的进展，通过体重减轻、粪便潜血、粪便性状以及直肠脱垂程度的综合评分来评估疾病活动度。在基线和第7天评估改良疾病活动指数（DAI），第7天的评分结果见图1D。此外，在吡罗昔康暴露的小鼠中观察到的结肠炎发展呈现出死亡率升高的强烈趋势，尽管该差异未达到统计学显著性（p = 0.12；

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讨论

炎症性肠病是一种复杂的多基因疾病，其临床前模型是解析参与炎症性肠病发病机制的通路以及开发新型诊断和治疗策略的宝贵工具。目前，许多炎症性肠病的临床前模型依赖于化学诱导方法，例如葡聚糖硫酸钠（DSS）、氧化偶氮酮（oxazolone）和三硝基苯磺酸（TNBS），因其操作简便而被广泛使用。此外，也可采用可自发性结肠炎的遗传模型。其中，IL-10基因敲除（IL-10-KO）模型尤为有价值，因为IL-10信号通路的基因变异已知可导致人类肠道炎症，且IL-10-KO小鼠会自发产生慢性肠结肠炎，其病理特征与人类疾病相似。然而，该模型的一个主要局限在于无法解释表型的变异性。尽管肠结肠炎可自发产生，但其发病时间可能因小鼠品系背景和动物饲养条件的不同而存在差异27。

通过将化学暴露与遗传模型相结合，本文所述方案提供了一种可靠且可重复的小鼠实验性结肠炎模型。在IL-10基因敲除小鼠中，吡罗昔康可加速肠炎的发生，摄入含吡罗昔康的饲料后7天内即可出现疾病表型。该方案可实现结肠炎发展的同步化。该模型重现了其他常用小鼠结肠炎模型中观察到的多种特征，包括体重减轻、粪...

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披露

作者声明无相关披露信息。

致谢

我们希望感谢UTSW核心设施对本研究工作的支持。本工作得到了以下资助来源的支持：NIH通过K08DK127197（LS-D）、T32DK007745（JW）以及Southwestern基金会通过Docstars奖（LS-D）提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 缓冲福尔马林StatLab28600-11 加仑
27 号针头BD305109
抗S100A8 + S100A9抗体AbcamAB288715
平衡Fisher ScientificS94792DFisher Science Education 便携式天平，300 g
柠檬酸盐缓冲液Sigma AldrichC9999-1000mL
去离子水Fisher ScientificSTLSL301
解剖镊Fisher Scientific22-327379
乙醇，100%（200 proof）Fisher ScientificNC1675398Pharmco Products 乙醇 200 证明
乙醇，190 proof，95%Fisher ScientificAC615110010
80% 乙醇Fisher ScientificT08204K7
EZ-Quick 染色缸IHC 世界IW-2511染色缸
EZ-Quick 染色架IHC 世界IW-2512载玻片架
饲喂针Fisher ScientificNC992498622号，25毫米
精细剪刀Fisher Scientific14060-11
平头镊子Fisher Scientific21-125-109
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555赛默飞世尔科技AB_2535849
手持式匀浆器Fisher Scientific15-340-167
HemoCueDanlee Medical Products, Inc.BCK 64151AHemoccult Dev/单张检测卡 - CLIA豁免
Hoechst 33342Invitrogen62249
IL-10 基因敲除小鼠杰森实验室品系编号：002251IL10基因敲除小鼠，基因型：B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC小鼠笼具阿伦镇小鼠 500
液氮AirgasNI UHP300
显微镜盖玻片Fisher Scientific12541033
Nanodrop赛默飞世尔科技ND-ONE-W
正常山羊血清Vector LaboratoriesS-1000-20
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma AldrichD8537
培养皿Fisher ScientificFB0875713
吡罗昔康Sigma AldrichP0847供应至Inotiv以制备定制动物饲料
含吡罗昔康的强化饲料Inotiv自定义200 ppm
引物：小鼠 GAPDH 正向Sigma AldrichN/A5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' 正向引物
引物：小鼠 GAPDH 反向引物Sigma AldrichN/A5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' 反向引物
引物：小鼠 IFN-γ 正向Sigma AldrichN/A5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' 正向引物
引物：小鼠 IFN-G 反向Sigma AldrichN/A5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' 反向
引物：小鼠 IL-10 正向Sigma AldrichN/A5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3'（通用）
引物：小鼠 IL-10 反向Sigma AldrichN/A5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3'（野生型反向）
引物：小鼠 IL-10 反向 (2)Sigma AldrichN/A5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3'（突变型反向）
引物：小鼠 IL-1β 正向Sigma AldrichN/A5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' 正向引物
引物：小鼠 IL-1B 反向Sigma AldrichN/A5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' 反向引物
引物：小鼠 IL-6 正向Sigma AldrichN/A5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' 正向引物
引物：小鼠 IL-6 反向Sigma AldrichN/A5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' 反向引物
引物：小鼠 TNF 正向Sigma AldrichN/A5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' 正向引物
引物：小鼠 TNF 反向Sigma AldrichN/A5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' 反向引物
QuantStudio 7 Pro赛默飞世尔科技A43183
RNAlater 溶液InvitrogenAM7020RNA稳定溶液，100 mL
RNeasy mini试剂盒Qiagen74104
SHURDry SD-II 玻片干燥仪一般数据SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip 载玻片染色架Fisher Scientific22-038-494染色架
SlowFade Gold 抗荧光淬灭试剂InvitrogenS36936
染色皿支架BioSBBSB7086
Staintray IHC 免疫组化切片染色系统免疫组化世界M918-1免疫组化用湿盒
SuperScript VILOInvitrogen11755050
SYBR Green预混液应用生物系统公司A46109
Tintoretriever 压力锅BioSBBSB7008
组织包埋盒Fisher Scientific 50-197-8152Research Products International Corp 组织处理盒，粉色，每箱500个
二甲苯Pharmco3990000001 加仑

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