以RNA形式递送基因组编辑器是修饰原代哺乳动物细胞和细胞系基因组的一种特别有效的方法。本方案的目标是将基因组编辑器以mRNA形式递送至原代哺乳动物细胞和细胞系中，随后通过靶向Illumina测序与分析，定量编辑结果。
本文内容
摘要
摘要
包括核酸酶、碱基编辑器和原位编辑器在内的CRISPR编辑工具可高效纠正致病性遗传变异或破坏靶基因。通常在培养的原代细胞、患者来源细胞或工程化细胞系中评估编辑效果，以研究遗传变异的影响，或作为启动动物实验或临床转化前的第一步。将编辑工具以mRNA形式与合成的向导RNA共同递送至哺乳动物细胞，相较于基于质粒的方法可提高编辑效率，并避免因持续表达导致的DNA整合或脱靶编辑等问题。本文介绍了一种通过体外转录（IVT）制备基因组编辑器mRNA的工作流程，包括共转录加帽和使用化学修饰的核苷酸，随后通过电穿孔将编辑器mRNA和向导RNA递送至人原代成纤维细胞、诱导多能干细胞（iPSCs）或淋巴母细胞样细胞系（LCLs），并利用Illumina测序平台进行靶向扩增子测序，结合CRISPResso2软件分析编辑结果。该工作流程可实现对向导RNA、电穿孔参数及编辑器变体的定量评估，并支持后续应用，包括单细胞克隆、表型检测、临床前动物研究及治疗开发。
引言
在原代哺乳动物细胞中实现高效的基因组编辑，有助于遗传模型的构建以及候选治疗策略的临床前评估。近年来基于CRISPR的技术不断进步，包括碱基编辑和原位编辑，能够在不引入DNA双链断裂的情况下实现精确的核苷酸修饰，从而提高编辑结果的纯度1,2。这些技术已成功应用于疾病建模和治疗性基因组编辑研究中，包括纠正导致镰状细胞病3和囊性纤维化4的变异位点的策略。
将基因组编辑组分递送至哺乳动物细胞的一种特别高效策略是电穿孔法递送体外转录（IVT）mRNA，该mRNA编码编辑酶，并与合成的向导RNA（gRNA）联合使用。递送mRNA可实现基因组编辑器的瞬时表达，从而最大限度地减少核酸酶的持续活性，并降低脱靶编辑事件的发生概率。体外转录技术的进步已显著提高了mRNA合成的效率、产量和质量4,5,6。质粒DNA模板和PCR扩增获得的DNA模板均常用于体外转录，各自具有不同的优势与局限性。在本实验方案中，优先选用PCR生成的模板，以避免在质粒中扩增长段多聚腺苷酸（poly(A)）序列时可能出现的重组问题及长度变异。然而，按照本方案使用PCR模板需要一条价格较高的反向引物，该引物包含120个核苷酸的poly(A)尾；此外，对于引物未编码的序列，PCR引入错误的风险可能高于质粒在细菌中的扩增。作为替代方案，Elegen和4basebio等商业供应商可提供高保真度的DNA模板，为转录模板的制备提供一种可靠但成本更高的选择。
精心设计向导RNA是成功进行基因组编辑实验的另一个关键因素。目前已开发出多种计算工具，以帮助研究人员根据预测的靶上效率和最小的脱靶活性来确定最优的gRNA序列。广泛使用的平台包括CHOPCHOP和CRISPOR，这些平台能够识别符合Cas酶原间隔序列邻近基序（PAM）要求的向导序列，并提供评分指标，用于优先选择预测活性高且特异性强的候选向导序列7，8。向导RNA设计的基本原理和最佳实践已在CRISPR相关文献中得到充分阐述9,10,11,13。
电穿孔常用于将基因组编辑试剂递送至哺乳动物细胞，因为其在通常对基于脂质的转染方法具有抗性的细胞类型中也能实现高效的递送。电穿孔可暂时增加细胞膜的通透性，使外源核酸（如mRNA和gRNA）进入细胞质。目前已针对多种哺乳动物细胞类型开发出优化的电穿孔方案，包括原代细胞、成纤维细胞、淋巴母细胞系以及诱导性多能干细胞14。Lonza 4D和Amaxa等商业化电穿孔平台提供了针对特定细胞类型的程序和试剂，旨在提高递送效率的同时维持细胞活力。Amaxa 96孔Shuttle平台等高通量电穿孔系统进一步支持在多种实验条件下进行可扩展的基因组编辑实验。Neon电穿孔系统也常被使用，但并非本方案的重点。
在递送基因组编辑组分后，通常通过靶向测序编辑位点周围基因组区域的高通量测序（NGS）来评估编辑结果。测序文库通过PCR扩增目标位点生成，随后进行加接头标记和高通量测序。利用专为基因组编辑实验设计的生物信息学分析流程对获得的测序读长进行分析。在本方案中，采用CRISPResso2对编辑结果进行定量分析，CRISPResso2是一种广泛使用的计算平台，可基于测序数据对基因组编辑结果进行详细分析15。CRISPResso2将测序读长比对至参考序列，并量化编辑结果，包括总体编辑效率、插入–缺失（indel）频率、精确的核苷酸替换以及目标区域内的编辑分布情况。该软件还提供图形化展示和统计摘要，有助于不同实验条件之间的比较以及编辑参数的优化。
综合高质量的体外转录mRNA制备、电穿孔优化递送以及高分辨率测序分析，为在培养细胞中评估基因组编辑策略提供了一套稳健的工作流程（图1）。该方法可在将基因组编辑策略推进至体内研究及潜在治疗应用之前，对编辑效率、特异性和实验参数进行迭代优化。
方案
伦理声明：
所有涉及人源细胞系的操作均按照机构指南和批准的方案进行。
1. 使用 PCR 生成线性 DNA 模板
注意：所有RNA操作步骤均需使用无RNase的耗材和工作台面。在选择适合预期基因组修饰的mRNA编辑器时，应考虑表中列出的mRNA编辑器及其不同变体（表1）。
- 使用微量质粒提取试剂盒（miniprep）或中量质粒提取试剂盒（midiprep）从细菌中提取质粒DNA，并以此为模板组装PCR反应。每50 µL PCR反应体系中加入20 ng质粒DNA，采用NEBNext Ultra II Q5 Master Mix酶，按照说明书所述方法配制PCR反应体系。 表2.
- 使用一种能够校正质粒上无活性T7启动子的正向引物，以防止环状转录的发生。
- 使用一种反向引物引入120个核苷酸的poly(A)₁₂₀尾，以支持高效的转录和mRNA稳定性。
- 使用 N1-甲基假尿苷替代尿苷，并加入 CleanCap AG 以提高 mRNA 翻译效率并降低天然免疫激活1,2,3,4 (图1).
注：其他核苷酸类似物和加帽试剂也可使用，但这些试剂在基因组编辑mRNA中 consistently 表现出较高的活性。基于纳米颗粒的递送是一种合适的替代方法，但本方案中未予讨论。
- 通过PCR扩增编辑器编码序列，共30个循环，使用引入编码区上游功能性T7启动子和下游poly(A)序列的引物（表 2 和 表3).
注意：IVT 模板的核苷酸序列在文中用下划线标出 表4. - 验证并纯化PCR产物
- 在1%琼脂糖凝胶中加入5 µL PCR产物，使用TE缓冲液，180 V电泳30分钟。在进行PCR产物纯化前，确认在约4000-6500 bp位置出现单一条带（具体大小取决于所转录的编辑器）。
- 使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物（材料表).
注意：如果观察到多条条带或PCR产物质量较差，应优化热循环条件（表5 – 故障排除表） - 使用荧光法定量纯化的DNA。进行Qubit dsDNA分析时，将试剂盒提供的796 µL高灵敏度Qubit工作液与4 µL染料混合，配制缓冲液-染料预混液。
- 在不同的离心管中，分别将198 µL缓冲液-染料主混合液与2 µL低浓度标准品S1、高浓度标准品S2及待测样品混合。按照Qubit荧光仪仪器提示，依次插入各标准品和样品，测定其原液浓度。
注意：如果样本超出分析范围，可能需要进行稀释。
2. 转录 mRNA
- 在冰上配制体外转录（IVT）反应体系，使用T7 RNA聚合酶、NTPs、共转录加帽用的帽类似物，以及以N1-甲基假尿苷三磷酸替代尿苷三磷酸，以降低先天免疫激活1˒5˒6。
- 根据表4配制IVT反应混合液。使用表4中提供的注释模板序列。每一体外转录反应最终体积为40 µL。
- 准备5–10个反应管，以生成足够用于多个实验的mRNA。每个40 µL反应可产生约100 µg mRNA。若每个原位编辑电穿孔使用1 µg mRNA，每个碱基编辑电穿孔使用3 µg mRNA ，则可进行约33–100次电穿孔。
- 转录RNA
- 通过移液充分混匀IVT反应体系，在37 °C孵育2小时。
- 纯化RNA
- 将反应液转移至1.5 mL离心管中，加入7.5 M氯化锂（LiCl）溶液，体积为总反应体积的一半，使最终LiCl浓度达到2.5 M。对于40 µL IVT反应，加入20 µL 7.5 M LiCl。轻轻移液充分混匀。
- 在-20 °C孵育30分钟。在4 °C下以16,000 × g离心15分钟。
- 用移液器吸除上清并弃去。用1 mL 70%乙醇在4 °C洗涤沉淀。无需扰动沉淀。在4 °C下以16,000 × g离心5分钟。
- 彻底去除乙醇，将沉淀在无RNase的生物安全柜中空气干燥1–2分钟。切勿过度干燥，否则难以重悬。
- 重悬并定量RNA
- 将RNA重悬于无核酸酶水中。初始时将每个反应产物重悬于50 µL无核酸酶水中，测定RNA浓度后再进一步稀释。使用荧光定量RNA检测方法（如NanoDrop）对RNA进行定量。
暂停点：在RNA定量和分装后，将mRNA分装样品储存于-80 °C直至电穿孔使用。避免反复冻融；每个分装样品仅解冻一次后即使用。 - 确认纯化后的mRNA产量约为每40 µL IVT反应100–400 µg。在分装前，用无核酸酶水将mRNA稀释至2 µg·µL-1。将分装样品储存于−80 °C。
注意：避免反复冻融。制备单次使用分装样品，未使用完的解冻样品应丢弃。建议在PCR条板中制备12.5 µL分装样品，每份可用于8–20次电穿孔。
- 将RNA重悬于无核酸酶水中。初始时将每个反应产物重悬于50 µL无核酸酶水中，测定RNA浓度后再进一步稀释。使用荧光定量RNA检测方法（如NanoDrop）对RNA进行定量。
- 评估RNA完整性
- 通过琼脂糖凝胶电泳或自动化电泳评估RNA大小与完整性（图2）
- 制备含10,000倍稀释SYBR Gold的0.8%琼脂糖凝胶。使用单链RNA分子量标记物，如NEB ssRNA Marker。
- 使用2× RNA上样缓冲液对mRNA进行变性，并将样品在65 °C加热10分钟后上样至凝胶。
- 确认mRNA在约4000–6500 nt处呈现一条主带，具体大小取决于所转录的编辑器，且无明显拖尾或低分子量产物。若RNA样品出现明显降解、拖尾或多个非预期条带，应予以弃用。
3. 向导RNA的设计与制备
注意：在目标基因组位点内识别原间隔序列邻近基序（PAM）序列，并选择与所选编辑器及预期基因组修饰相容的向导RNA。可使用CHOPCHOP、CRISPOR、CRISPRware、IDT Cas9 Checker、Benchling和VectorBuilder等向导RNA设计平台，优先筛选具有较高预测活性和特异性的向导RNA6,7,8,9,10,11,12,13。
- 使用向导RNA设计工具，在目标基因组位点内识别与所选核酸酶变体（包括NGN兼容变体）相匹配的PAM位点。
- 选择预测靶上活性高且预测脱靶活性低的向导RNA，并确认该向导RNA的编辑窗口。
- 对于碱基编辑或原位编辑应用，选择能够将预期编辑位点定位在所选编辑器最佳活性窗口内的向导RNA。
- 订购sgRNA或pegRNA，其向导序列的前3个和后3个核苷酸含有2’-O-甲基化碱基类似物，并在向导序列的前3个和后2个碱基之间含有3’硫代磷酸酯键。
- 将向导RNA溶解于无核酸酶的水或TE缓冲液中（浓度为100µM）。分装成5 µL每份，于−80 °C保存。使用时取出解冻，并用电穿孔缓冲液稀释后进行电穿孔。
4. 细胞培养准备
注意：在电穿孔之前，通过显微镜检查和细胞活力检测来评估细胞完整性。
- 在添加10% FBS、4.5 g·L-1葡萄糖、GlutaMAX和110 mg·L-1丙酮酸钠的DMEM培养基中培养原代成纤维细胞或HEK293T细胞。将细胞以每瓶20%汇合度接种于无菌T75培养瓶（TC表面）中。细胞传代次数维持在1-20代之间。当细胞汇合度达到80%时进行传代，用于电穿孔的细胞应处于70%-80%汇合度。
- 在mTeSR Plus培养基中培养多能干细胞。将细胞接种于经Geltrex包被的无菌T75培养瓶中，每瓶接种密度为20%汇合度。每日更换培养基，并将细胞传代次数维持在1-20代之间。每次传代后24小时内，在培养基中添加CEPT cocktail。当细胞汇合度达到80%时进行传代，用于电穿孔的细胞应处于70%-80%汇合度。
- 将细胞在37 °C、5% CO₂培养箱中培养，直至达到电穿孔所需的适当密度，通常为70%–80%汇合度。
- 当细胞数量和汇合度达到电穿孔要求时，吸除培养基。
- 向细胞中加入TrypLE Express酶（T75培养瓶加1 mL），在37 °C孵育5分钟。轻轻吹打细胞使其脱离瓶壁，形成单细胞悬液。加入3 mL细胞培养基终止消化，并在计数前确认无明显细胞团块。
- 在1,000 × g条件下离心5分钟收集细胞，用15 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤一次，再次离心。
- 使用自动细胞活力检测仪（如Nucleocounter NC-3000配合Solution 13）测定细胞浓度和活力。在检测前，将11.4 µL细胞悬液与0.6 µL Solution 13混合。仅当细胞活力≥85%时方可进行后续电穿孔操作；低于此阈值的样品应弃用或重新制备。
- 将细胞重悬于DPBS中，密度约为0.5 × 106–2 × 106 cells·mL-1 。使用血细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数并评估活力。
- 仅当细胞活力≥85%时方可继续操作。
- 将细胞重悬于电穿孔缓冲液中。每反应取2 × 105 细胞，重悬于5 µL预冷的电穿孔缓冲液中。
- 按照生产商说明书，在使用前立即用补充液配制电穿孔缓冲液，并将缓冲液置于冰上保存。
- 保持细胞低温并迅速操作。全程将细胞置于冰上，并立即进行电穿孔实验设置。
5. 电穿孔
注意：请在PCR条形管中准备编辑载体，以便进行多通道移液操作。电穿孔后，将细胞重悬于添加了CEPT混合物的培养基中，以提高细胞存活率12。
- 准备RNA货物。
- 在冰上将编辑器mRNA和向导RNA(s)加入电穿孔缓冲液中，制备RNA货物。
- 对于碱基编辑器和核酸酶，每份样品制备终体积为1.5 µL（3 µg）mRNA、0.5 µL（50 pmol）向导RNA和15 µL电穿孔缓冲液的电穿孔溶液。
- 对于先导编辑器，每份样品制备终体积为0.5 µL（1 µg）mRNA、1.5 µL（150 pmol）向导RNA和15 µL电穿孔缓冲液的电穿孔溶液。
- 将RNA货物溶液配制成1.2×主混合液，以补偿转移和样品操作过程中的体积损失。根据每个靶位点和编辑器变体的需要，优化试剂体积和比例。
- 分配细胞、货物并进行电穿孔。
- 将5 µL细胞悬液加入每个电穿孔孔中。
- 将17 µL含RNA货物的电穿孔缓冲液加入5 µL细胞中。用移液器吹打两次以混匀悬液。
注意：细胞与RNA货物混合后应迅速操作，因为细胞分泌的RNase可快速降解编辑器mRNA。在细胞与RNA货物混合后2分钟内完成电穿孔。 - 运行针对所选细胞类型优化的电穿孔程序（表6；图2；图3）。
- 对于原代人皮肤成纤维细胞或HEK293T细胞，使用Lonza 4D电穿孔系统及SF缓冲液。每反应加入200,000个细胞至20 µL电穿孔比色皿中。运行程序CM-130。立即加入80 µL预热的DMEM + 10% FBS、4.5 g·L-1葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺和110 mg·L-1丙酮酸钠。在稀释至96孔或24孔板前，恢复培养10分钟。
- 对于多能干细胞，使用Lonza 4D电穿孔系统及P3缓冲液。每反应加入200,000个细胞至20 µL电穿孔比色皿中。运行程序DN-100。立即加入80 µL预热的mTeSR Plus培养基。在稀释至24孔板前，恢复培养10分钟。
- 接种后每日观察细胞，监测细胞状态和恢复情况。
6. 基因组DNA提取
注意：在进行 PCR 扩增之前，应确保基因组 DNA 具有足够的质量且不含抑制物，因为 DNA 质量会影响测序文库的制备以及基因组编辑结果的准确定量9,10,11。
- 洗涤并收集细胞。
- 电穿孔后2-3天收集细胞。用DPBS洗涤细胞一次，并立即进行基因组DNA提取。
- 通过将10 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）、5 mL 10%（wt/vol）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液与无核酸酶水混合至终体积1 L，制备不完全裂解缓冲液。将不完全裂解缓冲液于室温保存，可稳定长达6个月。
- 取一份不完全裂解缓冲液，新鲜配制完全裂解缓冲液：按1:1,000（vol/vol）比例加入蛋白酶K。将完全裂解缓冲液加入细胞中以启动裂解。对于96孔板中每个含有约80,000个细胞的孔，加入40 µL完全裂解缓冲液。不要反复吹打，以免造成样品损失。
- 消化样品。
- 将样品在37 °C孵育60分钟，以完成细胞裂解和蛋白酶K消化。
- 灭活蛋白酶K。
- 将裂解物转移至PCR管或96孔PCR板中。在80 °C孵育30分钟以灭活蛋白酶K。
- 储存裂解物。
暂停点：将裂解液在 −20 °C 保存，直至进行 PCR 扩增。
7. 用于编辑分析的靶向扩增子测序
注意：在测序前应将PCR产物按等摩尔量混合。每个样本大约10,000条测序读长通常足以用于定量分析大规模基因组编辑结果。
- 设计位点特异性引物，以扩增包含编辑位点上下游至少25 bp、长度约300 bp的片段表7).
- 根据所提供的条件进行PCR1，扩增目标基因组位点 表8，表9.
- 使用PCR1产物作为模板，通过PCR添加独特的样本索引，例如使用下表所示的引物 表7 “PCR索引引物示例”标签页。使用第2个标签页所示的PCR条件 表8 和 表9.
- 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳PCR1和PCR2产物，以确认在预期大小处存在单一条带。
- 将PCR2产物等摩尔量混合。按照生产商说明书，使用0.65:1的AMPure XP磁珠与样品比例对混合后的PCR2文库进行纯化。用30 µL无核酸酶水中洗脱纯化后的文库，并在测序前通过凝胶电泳确认接头二聚体已去除。
- 使用荧光法定量双链DNA的方法对最终合并的文库进行定量。通过毛细管电泳评估片段大小分布。
- 使用Illumina MiSeq仪器对文库进行单端300个循环的测序。将最终混合文库稀释至4 nM。取5 µL 4 nM的混合文库与5 µL 0.1 M NaOH混合，用移液器吹打混匀。室温孵育5分钟以实现变性，然后加入MiSeq试剂盒提供的预冷HT缓冲液990 µL，以中和溶液并稀释至20 pM。加入15% PhiX对照。将文库加载至Illumina MiSeq测序芯片，按照制造商的标准运行参数进行单端300个循环的测序。目标为每个样本获得约30,000条读长，尽管每个样本10,000条读长已足以进行编辑分析。12MiSeq测序可在某些公司（如Genewiz或Quintara）按单个样品进行。
8. 基因组编辑结果的分析
注意：CRISPResso2 分析能够定量总体编辑效率、核苷酸转换频率以及插入/缺失（indel）频率，并可用于表征不同实验条件下的编辑结果15。
- 对测序数据进行解复用，并根据基因组位点和实验条件整理 FASTQ 文件。
- 根据 Github 仓库（https://github.com/pinellolab/crispresso2）中提供的说明安装 CRISPResso2。
- 使用指定输入 FASTQ 文件和分析参数的 batch.txt 文件运行 CRISPResso2 批量分析（示例见 表7）。将最小读段质量分数设为 30。将“w”窗口宽度设为 20。若使用胞嘧啶碱基编辑器，部分插入/缺失（indel）可能不仅出现在切口位点，还可能集中在碱基编辑的核苷酸周围。在此情况下，应将“wc”窗口中心调整为 -10，而非默认的切口位点中心，以更好地捕获这些 indel 事件。
- 从相应的汇总输出文件中提取定量结果，例如核苷酸转换频率、插入/缺失（indel）频率，以及（如适用）HDR 或 prime editing 频率。这些结果通常位于名为“CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt”和“Nucleotide_percentage_summary.txt”的文件中，可用 Microsoft Excel 或其他电子表格软件打开。
- 将定量编辑值导出，用于后续作图与数据分析，如 图3-4 所示。使用“alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf”文件（如 图5 所示）评估等位基因编辑结果。
结果
使用高效的编辑器和易于接近的测试位点（例如带有HEK3对照位点的ABE8e碱基编辑器），如果递送系统与实验所用细胞匹配良好，通常可实现超过90%的编辑效率。如果编辑器mRNA、向导RNA、靶位点或递送条件存在问题，导致任一因素不适合编辑，则可能导致较低的编辑效率。使用可识别更多样化PAM序列但结合力较弱的Cas9变体，或将编辑器靶向其理想编辑窗口之外的核苷酸，均可能降低编辑效率。体外转录（IVT）生成的编辑器mRNA若成功，通常在电泳中表现为一条主条带，弥散或低分子量降解产物极少，表明转录本完整性高，适用于后续电穿孔实验（图2）。
在将编辑器mRNA和合成向导RNA进行电穿孔后，大多数细胞可在24–48 h内恢复，并在合适的电穿孔程序下保持其典型形态（图3–4）。电穿孔条件应根据特定细胞类型进行优化，因为不同缓冲液可能导致显著不同的结果。Lonza在线知识中心针对常见细胞类型提供了缓冲液和电穿孔程序代码的推荐方案，Lonza还为细胞系和原代细胞分别提供独立的优化试剂盒。通过实验比较不同缓冲液有助于确定高效递送的最佳条件。不合适的电穿孔程序可能导致完全无法递送，或对细胞产生高度毒性（细胞死亡超过50%，或阻碍细胞周期的继续）。代表性优化实验表明，不同电穿孔条件下基因编辑结果存在显著差异，某些程序可实现高效编辑，而其他程序则几乎无编辑效果，凸显了针对每种细胞类型进行实验优化的重要性（图3–4）。
在iPSCs、成纤维细胞和LCLs中，采用靶向扩增子测序结合CRISPResso2分析来定量编辑效率及副产物（图4）。此处展示了HEK3测试位点的腺嘌呤碱基编辑结果（图4），在分析的样本中实现了预期的核苷酸转换，且插入缺失（indel）频率较低。CRISPResso2分析能够可视化靶位点处编辑与未编辑等位基因，并有助于定量预期核苷酸转换、indel频率及其他编辑副产物，从而对编辑结果进行全面评估（图5）。编辑效率通过测定靶位点处精确的单核苷酸替换频率来量化。由于HEK3位点具有特征明确的编辑谱型，并在不同实验系统中表现出良好的可重复性，因此被用作模型位点，可用于在不同条件下稳健评估碱基编辑性能。我们建议在优化人类细胞中新编辑流程时，将该向导RNA作为阳性对照进行测试。碱基编辑通常以高比例富集预期核苷酸转换，且indel频率较低；而先导编辑则产生精确编辑与低频副产物的混合结果3,12。不同条件下编辑效率存在差异，在细胞类型和电穿孔程序之间观察到明显区别（图3-4）。这些差异可能反映了细胞摄取能力、存活率以及DNA修复活性的不同，同时也受到电穿孔参数对递送效率影响的作用。总体而言，这些发现强调了针对不同细胞类型优化电穿孔参数的重要性，以实现一致且最大化的编辑效果。
图1．通过体外转录制备编辑器mRNA。
编辑器mRNA生成的示意图。（步骤1）制备包含编辑器编码序列和T7启动子的质粒模板。（步骤2）通过PCR扩增生成线性DNA模板。（步骤3）利用T7 RNA聚合酶进行体外转录，合成带帽的mRNA。（步骤4）纯化mRNA以去除模板DNA、酶和游离核苷酸。所得的带帽mRNA适用于通过电穿孔或脂质纳米颗粒递送至哺乳动物细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2．mRNA 琼脂糖凝胶电泳示例图
三种基因编辑器 mRNA 在 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳并以 SYBR Gold 染色后的成像结果。左侧为 NEB 提供的单链 RNA 标记物，其大小标记已标注对应长度。未见明显拖带或小分子量条带，表明这些 mRNA 质量符合实验要求。请点击此处查看该图的高清版本。
图3．诱导性多能干细胞（iPSC）基因组编辑电穿孔条件的优化。
展示了在不同电穿孔条件下iPSC中获得的编辑效率。细胞使用多种缓冲液与程序组合进行电穿孔，包括CB-150缓冲液P4、CD-118缓冲液P3、DN-100缓冲液P3和DC-100缓冲液P3，均在Lonza 4D核转染装置上进行。同时使用Neon电穿孔装置（参数：1600 V，20 ms，1次脉冲）进行编辑效果评估。编辑效率通过靶向测序分析编辑位点确定。每样本n=1。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．成纤维细胞基因组编辑电穿孔条件的优化。
使用不同核转染程序进行电穿孔后的编辑效率。成纤维细胞采用多种Lonza Nucleofector程序（CA-137、CM-138、DS-150、EH-100、EN-150、EO-114和FF-113）进行电穿孔，通过靶向测序定量编辑结果。结果显示了两个重复样本（P2、P3）的结果，并包含未递送编辑器的阴性对照。比较不同电穿孔程序代码的结果，揭示了不同电穿孔设置下编辑效率的差异，从而可确定成纤维细胞基因组编辑的最佳参数。每样本n=1。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5．靶向基因座基因组编辑结果的表征。
由 CRISPResso2 生成的等位基因频率表，显示通过高通量测序分析在编辑后检测到的靶向 sgRNA 区域周围编辑与未编辑等位基因的相对丰度。红色标注指示碱基编辑窗口以及所用细胞系中存在的预先存在的杂合多态性。引导 RNA 的间隔序列以灰色下划线标出。“预测切割位置”由虚线表示，由于在分析批处理文件（见表 8示例）中对窗口中心“wc”进行了修改，该位置相对于 SpCas9 典型的“PAM 减 3”位置发生偏移。这并不会实际改变真实的预测切割位点，但以这种方式展示输出结果，是为了表明将在虚线周围 20 个核苷酸的窗口内评估插入缺失（indels），从而同时涵盖以真实切口位点为中心以及以脱氨核苷酸为中心的插入缺失事件。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1. 本研究中使用的基因组编辑器及序列
第1列：AddGene上可用于体外转录的基因组编辑器。本方案所述适用于体外转录的质粒名称及其Addgene编号。第2列：本研究中使用的向导RNA间隔序列。请点击此处下载该表格。
表2. 用于扩增mRNA质粒模板的PCR试剂。
本表列出了用于扩增质粒模板以生成线性DNA进行下游应用的试剂和反应组分，以及正向和反向转录引物的序列。请点击此处下载该表格。
表3. 扩增mRNA模板的PCR循环条件。
本表格列出了在进行下游应用之前，从质粒DNA扩增mRNA模板所用的热循环条件。 请点击此处下载该表格。
表4. 实验所用试剂 体外 体外转录（IVT）反应。
该表格列出了用于体外转录以从线性DNA模板合成编辑器mRNA的试剂和反应组分。示例模板序列（ABE8e）以颜色编码的元素显示。 请点击此处下载此表格。
表5. 基因组编辑工作流程中关键步骤的故障排除指南。
本表总结了在体外转录（IVT）制备编辑器mRNA以及MiSeq测序分析过程中可能出现的常见技术问题。针对工作流程中的每个步骤，提供了潜在问题、可能原因及推荐解决方案，以帮助优化编辑效率并确保准确检测编辑结果。请点击此处下载该表格。
表6. 不同哺乳动物细胞类型的最优电穿孔程序。
本表列出了用于将编辑器mRNA和向导RNA高效递送至不同哺乳动物细胞类型的电穿孔程序代码及缓冲液条件。所列出的电穿孔参数经过测试，以确定在保持细胞活力的同时最大化基因组编辑效率的条件。相同的程序可能不适用于每一种细胞系或原代细胞来源，因此如果初次编辑未成功，建议从本表中尝试其他可选条件。请点击此处下载该表格。
表7. 用于定量基因组编辑结果的CRISPResso2分析参数。
第一个标签页列出了用于扩增目标位点的HTS1引物设计示例。第二个标签页提供了文库构建过程中所用索引引物的示例。第三个标签游戏副本展示了在测序过程中为每个样本分配唯一索引的索引排列示例。第四个标签页包含一个CRISPResso2分析的输入批量文件示例，第五个标签页提供了另一个CRISPResso2分析输入批量文件的示例。请注意，针对碱基编辑器调整了窗口中心“wc”，以便更有效地检测以脱氨碱基为中心的插入缺失，而不仅限于以核酸酶切割位点或切口位点为中心的插入缺失。请点击此处下载该表格。
表8. MiSeq文库构建的PCR1（表1）和PCR2（表2）试剂。
本表列出了用于表1（PCR1）中扩增目标基因组位点，以及用于表2（PCR2）中引入样本特异性索引序列和Illumina测序接头的试剂与反应组分，从而生成适用于MiSeq分析的测序就绪文库。请点击此处下载本表。
表9. MiSeq文库构建的PCR1（标签1）和PCR2（标签2）扩增条件。
本表格列出了在第1步（PCR1）中用于扩增目标基因组区域的热循环条件，以及在第2步（PCR2）中用于引入样本特异性索引序列和Illumina测序接头的热循环条件，从而生成适用于MiSeq分析的测序就绪文库。请点击此处下载该表格。
讨论
本方案提供了一种利用电穿孔将编辑器mRNA和合成向导RNA递送至原代哺乳动物细胞中进行基因组编辑的工作流程。与质粒递送相比，以mRNA形式递送通常可获得更高的编辑效率；与编辑器蛋白或核糖核蛋白复合物相比，mRNA的制备过程通常更简便且批次间一致性更高。在先前部分研究中，对碱基编辑器的mRNA形式与核糖核蛋白形式进行直接比较时，mRNA形式表现出更优的编辑效率3。相较于质粒或病毒递送方法，基于mRNA的递送可实现瞬时表达，并降低基因组整合的风险，尽管其可能需要针对不同细胞类型进行优化。除编辑效率较低外，使用质粒DNA进行基因组编辑还存在随机整合至靶细胞基因组的风险，并可能因编辑器的持续表达而增加脱靶编辑的可能性。结合靶向扩增子测序与CRISPResso2分析，可实现对编辑效率的标准化定量以及对所有等位基因编辑结果的特征化分析3。
成功的关键因素有多个。本方案中的关键步骤包括通过严格的无RNase操作来维持RNA完整性、选择最佳的向导RNA，以及针对每种细胞类型仔细优化电穿孔条件。RNA完整性和严格的RNase控制对实验结果具有显著影响，而向导RNA的选择仍是决定编辑效率和副产物谱的主要因素。电穿孔参数需根据不同细胞类型进行经验性优化，某些可实现高效编辑的程序也可能导致细胞毒性。若观察到编辑效率较低，应考虑优化电穿孔参数、RNA质量或向导RNA设计。若出现过度毒性，降低电穿孔强度或RNA用量可能改善细胞活力。其他优化策略包括测试针对目标细胞类型定制的替代电穿孔缓冲液和程序，或调整编辑器或向导RNA的浓度。该工作流程提供了一个实用平台，可用于评估编辑器性能并生成经修饰的细胞，以用于后续的单细胞克隆、表型分析、体内研究或转化开发。该流程广泛适用于在原代细胞中评价基因组编辑策略，支持在不同基因组背景和细胞类型中系统比较各类编辑模式。它可通过引入或纠正临床相关变异来支持疾病建模，并实现对编码区及非编码调控元件的功能性探究。此外，该流程还为优化治疗性基因编辑方法提供了平台，包括评估靶向编辑效率、脱靶活性和编辑持久性。该工作流程还可用于筛选和优先选择向导RNA与编辑系统、评估递送策略，以及在精准医学框架下测试患者特异性变异。总体而言，它在基础基因组生物学、转化研究与临床前开发之间起到了多功能的桥梁作用。该方法的一个局限性在于，不同细胞类型的电穿孔效率和细胞存活率可能存在显著差异，需要进行经验性优化。此外，编辑结果可能受向导RNA设计与纯度以及靶位点可及性的影响，这可能限制不同实验系统间的可重复性。尽管存在这些限制，通过仔细优化实验参数和向导RNA设计，仍可降低变异程度，从而在多种细胞体系中实现可靠且可重复的应用。
披露
N.W. 和 E.V.B. 已通过约翰斯·霍普金斯大学就基因组编辑技术提交了专利申请。G.A.N. 已通过布罗德研究所和约翰斯·霍普金斯大学就相关基因组编辑技术提交了专利申请。
作者贡献：
M.V.、J.N.W.、E.V.B.、D.M.E.、J.D. 和 G.A.N. 各自撰写了文本的不同部分。M.V. 汇总并编辑了最终文稿，随后所有作者进行了修改。
致谢
我们感谢 Beatriz Olalla Sastre 对本实验方案的有益讨论。本研究得到了英国心脏基金会（British Heart Foundation）“大跳动挑战奖”（Big Beat Challenge）对 CureHeart 项目（资助编号：BBC/F/21/220106）、囊性纤维化基金会（Cystic Fibrosis Foundation）（资助编号：NEWBY23XX0）以及美国国立卫生研究院（US National Institutes of Health）（资助号 R00HL163805 和 DP2OD038783，授予 G.A.N.）的支持。 J.N.W. 的研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 T32 GM148383 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | R0491 | Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g |
| AMPure XP SPRI 磁珠 | Beckman Coulter | B23317 | A63880，用于DNA纯化的AMPure XP磁珠，5 mL，Beckman Coulter |
| ATP（100 mM） | New England Biolabs | N0450 | |
| CEPT混合液 | Bio-Techne / Tocris | 7200 | |
| CleanCap AG 试剂 | TriLink Biotechnologies | N-7113 | CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT 试剂盒，125 × 20 µL 反应 |
| CTP（100 mM） | New England Biolabs | N0450 | |
| 定制DNA引物 | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| DNA上样缓冲液 | New England Biolabs | B7024 | |
| DPBS（Dulbecco’s 磷酸盐缓冲盐水） | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | D8537-100ML |
| Dulbecco’s 改良Eagle培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | 高葡萄糖DMEM [4,500 mg/L]，含[4.0 mM] L-谷氨酰胺和[110 mg/L]丙酮酸钠，500 mL |
| 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| GTP（100 mM） | New England Biolabs | N0450 | |
| Illumina索引引物 | Illumina | FC-131-2001 | 10 µM 储存液 |
| Illumina MiSeq 测序仪 | Illumina | SY-410-1003 | |
| 氯化锂RNA沉淀溶液 | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
| Lonza 4D 核转染系统 | Lonza | AAF-1002X | |
| ssRNA 标记物 NEB | NEB | N0362S | 每反应5 µL |
| MiSeq 试剂盒 v3（300个循环） | Illumina | MS-102-3002 | |
| N1-甲基伪尿苷-5′-三磷酸 | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NEBNext Ultra II Q5 预混液 | New England Biolabs | M0544 | |
| 无核酸酶水 | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| NucleoCounter NC 滑片 A8 | ChemoMetec | 941-0008 | |
| NucleoCounter NC-3000 | ChemoMetec | NC-3000 | 10 µL 细胞溶液和 0.4167 μL DAPI 溶液 |
| 溶液15，Hoechst 33342，1 mL 910-3015 Chemometec | Chemometec | 910-3013 | 500 μg/mL ~ 0.9 mM ~ 0.05% |
| 核转染杯条 | Lonza | V4XP-3032 | |
| P3 原代细胞核转染溶液 | Lonza | V4XP-3032 | 1 × 0.675 mL P3 原代细胞核转染® 溶液 |
| Phusion 高保真DNA聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F530L | |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | 数量：1 mL，>600 U/mL（约20 mg/mL） |
| Q5 高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0491 | 2,000 单位/mL，100 单位 |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit RNA 宽范围检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q10211 | |
| Qubit™ 检测管 | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| RNA上样缓冲液（2×） | Thermo Fisher Scientific | R0641 | 每反应5 µL |
| RNA纯化试剂盒 | Zymo Research | R1017 | |
| RNase Away | Thermo Fisher Scientific | 1236B62 | |
| SDS，10% 溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15553027 | |
| SYBR Gold 核酸凝胶染料 | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Safe DNA 凝胶染料 | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| 合成sgRNA / pegRNA | Synthego / IDT | Custom | 2 µg |
| HiScribe T7 高产量RNA合成试剂盒，250次反应 | New England Biolabs | E2040L | |
| TrypLE Express 酶 | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 100 mL |
| TE缓冲液（Tris-EDTA） | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | TE，pH 8.0，无RNase，Thermo |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 1× |
| 胎牛血清（FBS），优质，500 mL | Thermo Fisher Scientific | A5670701 | |
| mTSER PLUS | STEM cell Technologies | # 100-0276 | |
| 青霉素/链霉素混合液 10,000 µg/mL，100 mL，4瓶装 | Quality Biological | 120-095-721 |
参考文献
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重印与许可
