本方案描述了一种延时活细胞成像方法，用于在自动化显微镜下观察由外周血单个核细胞来源的巨噬细胞介导的、针对绿色荧光蛋白标记的三阴性乳腺癌细胞的抗体依赖性吞噬作用。
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抗体介导的巨噬细胞吞噬绿色荧光蛋白标记的三阴性乳腺癌细胞的延时成像
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
抗体依赖性细胞吞噬作用是巨噬细胞吞噬抗体调理的癌细胞的关键机制。本方案描述了一种延时活细胞成像方法，用于可视化巨噬细胞对表达CD24的绿色荧光蛋白标记三阴性乳腺癌细胞的抗体依赖性吞噬过程。巨噬细胞来源于人外周血单个核细胞，在巨噬细胞集落刺激因子作用下分化，并通过干扰素γ和脂多糖极化，以获得促炎表型。在与巨噬细胞以确定的效应细胞与靶细胞比例共培养之前，癌细胞预先用抗CD24单克隆抗体进行调理。利用配备环境控制系统的自动化显微镜，在16小时期间内连续记录吞噬事件，以维持生理条件。成像过程同时使用明场和荧光通道，以便识别癌细胞并监测其被巨噬细胞内化的过程。代表性延时图像展示了荧光标记癌细胞随时间推移逐步被吞噬的现象。为实现定量评估，在相同共培养条件下平行进行终点检测，成像前去除未被内化的癌细胞，从而准确测量吞噬事件的发生数量。该方法为体外观察抗体驱动的巨噬细胞吞噬作用提供了标准化且可重复的技术流程。重要的是，将延时成像与基于终点的定量分析相结合，可对吞噬作用的动力学特征和程度进行互补性评估。本方案支持在可控的体外环境中评估治疗性抗体及靶向巨噬细胞的癌症免疫疗法。
引言
乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的恶性肿瘤，每年约有230万例新发病例1。该疾病在临床上具有异质性，根据激素受体——雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）——以及人表皮生长因子受体2（HER2）癌基因的表达状态，至少可分为四种主要的分子亚型2。腔面A型肿瘤表达ER和/或PR，但无HER2过表达（ER/PR+ 且 HER2−）；腔面B型肿瘤同时表达ER/PR和HER2（ER/PR+ 且 HER2+）；HER2+型肿瘤表现为高水平的HER2表达，与激素受体状态无关；三阴性乳腺癌（TNBC）则缺乏这三种标志物的表达（ER−、PR− 和 HER2−）2,3。在这些亚型中，TNBC是临床上最具挑战性的类型，约占所有乳腺癌的15%–20%。TNBC患者表现出最侵袭性的疾病进程，预后最差，5年总生存期最短，这主要归因于对传统化疗反应不佳以及缺乏有效的靶向治疗手段3,4。此外，TNBC表现出显著高的内脏转移倾向，尤其在诊断后5年内易转移至肺部，而晚期或转移性TNBC（mTNBC）患者的中位生存期很少超过2年5,6。这些数据凸显了开发TNBC新型治疗策略的迫切且尚未满足的临床需求。
肿瘤微环境（TME）在乳腺癌进展和免疫逃逸中发挥关键作用。肿瘤相关巨噬细胞是TME中最丰富的免疫细胞之一，近年来被确认为介导固有抗肿瘤免疫的关键因素7,8,9。尽管历史上将TAMs划分为促炎性的“M1”型和促肿瘤的“M2”型，但这种二元模型无法充分反映巨噬细胞的异质性。相反，TAMs处于一种动态的功能谱系中，会随着TME内多种生化信号的变化而演变。在此复杂环境中，癌细胞通过多种免疫逃逸策略主动抑制巨噬细胞活性，其中尤为突出的是“别吃我”信号的过表达。CD47/SIRPα轴是首个被发现的此类固有免疫检查点6,10，而近期CD24被发现是一种新型且强效的抗吞噬信号11,12。CD24是一种小分子、高度糖基化的黏蛋白样糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接锚定于细胞膜上13。在生理条件下，CD24表达于多种免疫细胞谱系，但在包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和结直肠癌等多种实体瘤中常出现过表达14。在肿瘤细胞上，CD24与巨噬细胞表面表达的抑制性受体唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素10（Siglec-10）结合。该相互作用触发Siglec-10胞内尾部免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）结构域的磷酸化，进而激活SHP-1和SHP-2磷酸酶，抑制下游吞噬信号通路11。使用单克隆抗体阻断CD24/Siglec-10相互作用已被证明可显著增强巨噬细胞对表达CD24的人类肿瘤的吞噬作用。我们近期的研究还表明，在小鼠三阴性乳腺癌模型中，敲除乳腺癌细胞中的CD24a可增加其对巨噬细胞吞噬的敏感性9。
抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）是一种关键机制，通过该机制抗体可引导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞15,16。当抗体与肿瘤细胞表达的抗原结合后，其Fc区会与巨噬细胞表面的Fcγ受体（FcγRs）相互作用，触发细胞内信号级联反应，最终导致细胞骨架重排、吞噬杯形成以及靶细胞的吞噬17。
本研究建立并验证了一种用于检测抗体驱动的巨噬细胞吞噬乳腺癌细胞的延时活细胞成像方案。该方法利用来自健康人供体的外周血单个核细胞（PBMC）来源的巨噬细胞，经巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化后，再用脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFN-γ）进行刺激。流式细胞术分析显示，刺激后CD11b⁺细胞群中CD80表达上调（图1），表明其具有经典活化表型。该活化状态赋予巨噬细胞强大的抗体介导吞噬能力，适用于评估抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。以表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的CD24阳性乳腺癌细胞作为靶细胞，在共培养前用治疗性抗CD24单克隆抗体进行调理。在受控环境条件下，使用自动化显微镜连续记录16小时内的吞噬事件。为了在动态可视化的同时实现定量评估，另设一组在相同共培养条件下进行的终点实验，通过去除未被内化的靶细胞后对吞噬作用进行严格量化。该方案为评估抗CD24抗体介导的ADCP提供了一个标准化、可重复且具有丰富视觉信息的平台。重要的是，将延时成像与基于终点的互补定量策略相结合，可同时评估吞噬作用的动力学过程和吞噬程度。该方法可适用于其他巨噬细胞靶向免疫治疗靶点的研究。本方案特别适用于评估针对肿瘤细胞表面抗原的治疗性单克隆抗体所介导的ADCP，适合用于候选抗体的比较筛选、剂量-效应关系表征以及Fc–FcγR相互作用机制研究，包括“别吃我”信号阻断效应（如CD47–SIRPα通路）的分析。由于该检测使用原代人巨噬细胞，因此也适用于在临床开发前评估供体间变异性的转化医学研究。
图1．由外周血单个核细胞诱导生成的IFN-γ/LPS刺激型巨噬细胞及其流式细胞术验证。上图：通过密度梯度离心法（使用Ficoll溶液，400 × g，20°C下离心30分钟）从健康供体分离外周血单个核细胞（PBMCs），所有试剂预先平衡至20°C ± 2°C。分离所得PBMCs在ImmunoCult-SF培养基中培养7天（第0–7天），培养基中添加100 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）以诱导巨噬细胞分化，并于第5天补充培养基。第8天时，将已分化的巨噬细胞用100 ng/mL IFN-γ和1 µg/mL LPS刺激48小时（第8–10天）。随后对细胞进行流式细胞术分析。下图：巨噬细胞的流式细胞术分析。细胞使用包含CD11b-FITC、CD80-PE和CD206-PerCP-Cy5.5的表面标志抗体组合染色，上机前加入DAPI以排除死细胞。设门策略：首先根据DAPI⁻设门选择活细胞，然后在CD11b-FITC与FSC-A散点图中确定CD11b⁺细胞群，以确认巨噬细胞身份。对活细胞中CD11b⁺群体进一步在CD80与CD206散点图中分析，确认IFN-γ/LPS刺激诱导产生的CD80⁺CD206⁻细胞群。右侧：CD11b-FITC与FSC-A的代表性散点图显示，99.8%的设门细胞为CD11b⁺，证实其巨噬细胞特性。左侧：大部分CD11b⁺细胞位于CD80⁺CD206⁻象限（Q1：95.2%），表明在所用刺激条件下成功诱导出预期的促炎表型。请点击此处查看该图的放大版本。
应用该技术时，使用者应考虑若干限制因素。首先，来源于外周血单个核细胞的巨噬细胞存在供体间变异，可能导致吞噬功能结果出现较大差异，因此建议使用多个供体（n ≥ 3），并同时报告单个供体数据与合并结果。其次，二维共培养体系无法完全模拟肿瘤微环境，相关发现应在三维体系或体内模型中验证后，方可进行临床推断。第三，16小时的成像窗口仅能捕获早期吞噬事件，无法反映抗原提呈或继发性免疫激活等长期过程。因此，实时成像与终点定量相结合的方法可提供互补性分析框架，有助于提高抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）测量结果的可解释性与可重复性。
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方案
本方案涉及使用来自健康供体血液样本的原代巨噬细胞。样本的采集和处理均遵循中国医科大学机构审查委员会（IRB）的指南。
1. 外周血单个核细胞来源巨噬细胞的制备
注意：涉及人类血液的所有操作均须在机构伦理审查委员会批准下进行（例如，CMUH IRB）。在采集血液前，须从健康供体处获得知情同意。
警告：所有人类血液制品均须在生物安全二级条件下操作，并采取普遍预防措施。
- 血液采集
- 将健康供体的全血采集至10 mL乙二胺四乙酸（EDTA）涂层的真空采血管中。
- 血液稀释
- 用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS；无Ca2⁺/Mg2⁺）以1:1比例稀释全血（例如，10 mL血液 + 10 mL PBS）。
- 轻轻倒置混匀3至5次。
注意：使用前将PBS置于冰上。低温有助于在处理过程中维持细胞活性。
- 密度梯度分层
- 在锥形管中，以2:1的体积比（v/v）将稀释后的血液小心地铺在Ficoll–Paque PLUS上层（例如，在15 mL管中加入8 mL血液覆盖于4 mL Ficoll上，或在50 mL管中加入30 mL血液覆盖于15 mL Ficoll上）。
- 在分层前，将稀释血液和Ficoll–Paque PLUS均平衡至20°C ± 2°C。
- 使用前至少30分钟将Ficoll–Paque PLUS从4°C取出，或短暂置于20°C ± 2°C水浴中升温。
- 请勿使用低温试剂，因为Ficoll的密度校准温度为20°C ± 2°C，温度偏差会影响分离效率和PBMC得率。
注意：将试管倾斜约45°角，沿管壁缓慢加入血液，以保持清晰的界面。切勿扰动Ficoll层。
- 离心
- 在20°C条件下，以400 × g离心30分钟，关闭刹车（图1）。
注意：使用刹车会破坏密度梯度，降低PBMC得率。
- 在20°C条件下，以400 × g离心30分钟，关闭刹车（图1）。
- PBMC收集
- 使用血清移液管小心吸取仅含白膜层（即血浆层与Ficoll层之间的乳白色界面），避免扰动上方的血浆或下方的Ficoll层。
- 将收集的液体转移至新的50 mL锥形管中。
- PBMC洗涤
- 加入PBS，使50 mL锥形管中的总体积达到25 mL。
- 使用50 mL管以确保离心时的平衡和稳定性。
- 以300 × g离心10分钟。
- 红细胞裂解
- 弃去上清液。
- 用血清移液管轻轻吹打，加入5 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液，使沉淀充分重悬，直至无可见团块。
- 室温孵育5分钟。
警告：必须完全分散沉淀以确保裂解均匀；但应避免剧烈吹打或涡旋，以免损伤PBMC。RBC裂解缓冲液孵育时间不得超过5分钟，否则可能影响PBMC活性。
- PBMC沉淀
- 以500 × g离心5分钟，使PBMC沉淀并去除裂解的红细胞碎片。
- 最终重悬
- 弃去上清液。
- 将沉淀重悬于5 mL ImmunoCult-SF巨噬细胞培养基中。
注意：在标准条件下，10 mL全血通常可获得1.5–2.0 × 107个PBMC。
2. 巨噬细胞分化（第 0–7 天）
注意：使用未经组织培养（TC）处理的培养皿，通过贴壁法筛选由单核细胞分化而来的巨噬细胞。非贴壁的淋巴细胞将在后续培养过程中被洗去。
- 第0天：细胞接种
- 进行细胞计数，并将1 × 107个PBMC接种至未经组织培养处理的10 cm培养皿中。
- 用ImmunoCult-SF巨噬细胞培养基补足总体积至10 mL，该培养基需添加100 ng/mL M-CSF（使用前将M-CSF储备液直接加入完全培养基中，轻轻倒置混匀）。
注意：本方案可根据供体PBMC产量按比例调整，以1 × 106 个细胞/mL作为起始接种密度为基准。
- 孵育与监测
- 在37°C、5% CO₂的湿润化培养箱中孵育。
- 每日观察悬浮单核细胞簇的形成及贴壁细胞的出现。
注意：随着分化进程推进，单核细胞会逐渐增大并形成细胞簇。部分单核细胞将开始贴附于培养皿表面。此步骤无需干预。
- 第5天：补充培养基
- 轻柔地向培养皿中加入5 mL新鲜的ImmunoCult-SF巨噬细胞培养基（含100 ng/mL M-CSF），注意避免扰动已贴壁的巨噬细胞。
- 继续培养2天（至第7天）。
警告：应沿培养皿侧壁轻柔加入新鲜培养基，避免扰动贴壁巨噬细胞，因为机械性干扰可能影响分化效率和细胞得率。
注意：避免更换培养基，以保留支持巨噬细胞分化的自分泌/旁分泌因子。
- 第7天：形态学评估
- 在倒置显微镜下检查巨噬细胞分化效率。
- 贴壁细胞呈现典型的巨噬细胞形态：体积大、扁平、形状不规则，并可见伪足。
- 第7天时，应可观察到充分分化的巨噬细胞。
警告：第7天的形态学评估是后续流式细胞术验证的关键前提。显微镜下应清晰可见充分分化的巨噬细胞，贴壁细胞中具有巨噬细胞形态的比例越高，表明分化效率越高（约70%融合度且具有典型形态的贴壁巨噬细胞可视为分化成功）。若培养物贴壁稀疏、细胞以圆形为主或形态学分化不良，则流式细胞术结果不可靠，不应进入后续刺激与染色步骤。
3. 巨噬细胞极化（第8–10天）
- 收集和澄清条件培养基
- 第8天，小心吸出培养皿中的15 mL培养基，避免扰动贴壁的巨噬细胞，并将其转移至无菌的50 mL锥形管中。
- 将收集的培养基在400 × g下离心5分钟，以沉淀细胞碎片。
- 保留澄清的上清液用于下一步操作。
- 干扰素γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）刺激
- 将澄清后的15 mL上清液转移至新的无菌管中，并加入100 ng/mL IFN-γ和1 µg/mL LPS。
- 轻轻吹打混匀（5–10次），确保细胞因子均匀分布，同时避免产生气泡。
- 将全部15 mL添加了细胞因子的培养基重新加回原培养皿中，沿内壁轻轻吹打，避免扰动贴壁的巨噬细胞。
- 在37°C、5% CO₂条件下孵育48小时（第8天至第10天）。
注意：使用条件培养基（旧培养基）以保留自分泌/旁分泌因子。本实验采用IFN-γ和LPS联合刺激，以诱导巨噬细胞极化为促炎表型。在本方案所用的IFN-γ（100 ng/mL）和LPS（1 µg/mL）刺激条件下，巨噬细胞会表现出特征性的形态学变化，包括出现细长的片状伪足，符合活化的促炎状态，同时表达CD11b和CD80。
警告：LPS为具有生物活性的内毒素，接触后可能引发炎症反应，操作时应遵循适当的实验室安全规程。
4. 通过流式细胞术确认经干扰素-γ和脂多糖刺激的巨噬细胞的炎症表型标志物
- 细胞收获
- 在第10天收获一部分极化后的巨噬细胞用于表型分析。
- 加入含10 mM EDTA的PBS，于37°C孵育10–15分钟。
- 通过轻柔吹打使细胞脱落。
注意：若细胞仍贴壁，可将EDTA孵育时间额外延长30分钟（37°C），然后重复轻柔吹打操作。避免剧烈吹打或机械刮擦，以保持细胞活性及表面标志物的完整性。
- 抗体染色准备
- 使用荧光素偶联抗体对细胞进行染色，抗体包括CD11b（泛巨噬细胞谱系标志物）、CD80（炎症标志物）和CD206（抗炎标志物，作为排除炎症表型的阴性排除标志物）。
- 染色步骤
- 将5 × 105个脱落的巨噬细胞转移至含有100 µL冷PBS的流式管中。
- 加入CD11b-FITC、CD80-PE和CD206-PerCP-Cy5.5抗体，每种抗体终浓度为1 µg/mL。
- 通过轻柔吹打混匀细胞悬液。
- 将样品置于冰上避光孵育1小时。
- 在4°C下以300 × g离心1分钟。
- 小心吸除上清液。
- 加入0.5 mL冷PBS洗涤细胞沉淀。
- 在4°C下以300 × g离心1分钟。
- 弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于200 µL冷PBS中。
- 加入DAPI，终浓度为1 µg/mL。
注意：应设置相应的同型对照以及活性染料（例如DAPI或Viobility 405/452可固定活力染料）。
- 流式细胞术分析
- 使用流式细胞仪采集染色后的样品。
- 确认巨噬细胞群体中CD11b和CD80的表达。
- 仅在确认标志物表达符合炎症表型后，方可进行后续吞噬功能实验。
- 流式细胞术数据采集与设置
- 仪器设置
- 使用以下通道配置流式细胞仪：Pacific Blue/V450（DAPI）、FITC（CD11b）、PE（CD80）和PerCP-Cy5.5（CD206）。
- 设置采集参数，在定义的父门内每样本采集10,000个事件。
- 阈值与增益校准
- 打开四个点图，横轴为FSC，纵轴分别为一个荧光通道。
- 制备与各荧光染料匹配的同型对照抗体染色的细胞样品。
- 采集同型对照样品数据。
- 调节各通道增益，使同型对照群体位于对数尺度101以下。
- 以此阈值定义背景信号水平。
注意：建议使用101至101·5的对数范围，以实现背景信号与特异性信号之间的可靠分离。
- 补偿调节
- 向1.5 mL微量离心管中加入一滴补偿微珠。
- 加入对应荧光素偶联抗体，终浓度为1 µg/mL。
- 避光冰上孵育30分钟。
- 在400 × g下离心1分钟。
- 弃去上清液。
- 将微珠重悬于200 µL冷PBS中。
- 采集单色对照数据。
- 应用光谱补偿以校正荧光溢出。
- 设门策略
- 活细胞筛选
- 纵轴显示Pacific Blue/V450（DAPI），横轴显示FSC。
- 圈选DAPI阴性事件（低于101）以获取活细胞。
- 巨噬细胞鉴定
- 将活细胞群体设为父门。
- 纵轴显示FITC（CD11b），横轴显示FSC。
- 圈选CD11b⁺事件（高于101）。
- 炎症表型鉴定
- 将CD11b⁺细胞群体设为父门。
- 纵轴显示PE（CD80），横轴显示PerCP-Cy5.5（CD206）。
- 在两个轴上均以101.5为界进行象限设门。
- 在左上象限（Q1）中识别CD80⁺CD206⁻细胞。
- 活细胞筛选
- 仪器设置
- 接受标准
- 确认在CD11b⁺父门内的细胞中，≥90%为CD80⁺CD206⁻表型。
- 仅当达到此标准时，方可进行后续吞噬功能实验。
- 若样品未达到该标准，需重新进行PBMC分离、M-CSF诱导分化及IFN-γ/LPS刺激处理。
5. 抗体依赖性吞噬作用检测
注意：在建立检测前，需验证癌细胞中GFP表达的稳定性。在检测前确认靶细胞表面CD24的表达。为获得最佳实验效果，应使用CD24阳性率为50%–100%的癌细胞。本方案中使用的MDA-MB-468细胞CD24阳性率为100%。
- 巨噬细胞接种
- 将经步骤4验证的IFN-γ和LPS刺激的巨噬细胞以每孔2 × 105个细胞的密度接种于24孔组织培养板中。
- 将培养板置于37°C、5% CO₂条件下静置培养12–16小时，以促进细胞贴壁（图2A）。
注意：在继续后续操作前，需确保巨噬细胞牢固贴壁。贴附不良的巨噬细胞可能在成像过程中脱落，从而干扰实验结果。
- 癌细胞的准备
- 将CD24阳性GFP标记的乳腺癌细胞（MDA-MB-468）培养至70%–80%汇合度。
- 吸除培养基。
- 用PBS洗涤细胞单层一次。
- 癌细胞的脱离
- 向培养皿中加入含10 mM EDTA的PBS。
- 在37°C孵育5–10分钟。
- 通过轻柔吹打使细胞完全脱离。
注意：避免使用胰蛋白酶进行细胞脱离。酶消化可能从细胞表面切割CD24，影响抗体结合。
- 癌细胞的收集与计数
- 将脱离的细胞收集至离心管中。
- 以300 × g离心5分钟。
- 弃去上清液。
- 用完全RPMI 培养基重悬细胞沉淀。
- 计数活细胞数量。
- 癌细胞的抗体调理
- 将癌细胞以2 × 105个细胞/mL的密度重悬于0.5 mL完全RPMI 培养基中。
- 加入抗CD24单克隆抗体，使其终浓度为1 µg/mL。
- 通过轻柔吹打混匀细胞悬液，确保抗体分布均匀。
- 在37°C静置孵育30分钟。
注意：设置同型匹配的IgG对照，浓度与实验组相同，作为抗体依赖性吞噬作用的阴性对照。
- 共培养前准备
- 调理后无需洗涤细胞。
- 直接进行共培养，以维持细胞表面的抗体包被状态。
- 共培养体系建立
- 将1 × 105个经抗体调理的GFP标记乳腺癌细胞加入含有巨噬细胞的各孔中。
- 保持效应细胞与靶细胞比例为2:1。
注意：可根据实验设计调整效应细胞与靶细胞的比例。为增加细胞间接触频率并增强吞噬事件的检测，可采用高于2:1的巨噬细胞与癌细胞比例（例如3:1或5:1）。
图2．抗体依赖性细胞吞噬作用的延时成像。 （A）共培养系统及延时成像设置的示意图。成像参数包括每10分钟采集一次，总采集时间为16小时（共97帧），使用10×物镜，相位对比与GFP通道。（B）从1小时到16小时的代表性延时图像，显示随时间推移巨噬细胞内化GFP阳性癌细胞的吞噬事件。黄色虚线圆圈标示典型的吞噬事件。在相位对比通道中，被吞噬的癌细胞表现为巨噬细胞胞质内明亮的细胞内结构（白色箭头）。在GFP通道中，荧光信号定位于巨噬细胞内部，证实了内化过程。（C）在0、1、4和16小时的代表性吞噬事件的放大视图，展示了巨噬细胞介导的GFP标记癌细胞吞噬过程的连续步骤。该图像序列的选择基于对巨噬细胞介导吞噬事件的清晰可视化。白色箭头指示巨噬细胞与靶细胞相互作用并将其内化的过程。请点击此处查看该图的放大版本。
6. 时间序列成像（自动化活细胞成像系统）
注意：在进行实验之前，使用 Lionheart 自动化活细胞成像系统和 Gen5 自动化活细胞成像软件配置成像方案。在操作成像系统前应接受适当培训，以确保准确设置、最佳性能和安全使用。
- 仪器准备
- 打开成像系统、环境控制模块和CO₂培养箱₂ 成像前至少提前1小时开启气体供应。
- 在自动活细胞成像软件中打开环境控制面板。
- 设置温度至 37°C 和 CO₂ 5%
- 确认腔室温度在规定范围内稳定 ± 0.2°C 和 CO₂ 5.0% ± 0.1% 在加载平板之前。
- 平板设置
- 将24孔板放入成像系统的成像室中。
- 初始配置
- 打开自动活细胞成像软件的任务管理器。
- 选择[成像仪手动模式]。
- 点击[立即捕获]以初始化成像参数。
- 选择一个10× 目标
- 选择微孔板作为滤光片设置。
- 从自动活细胞成像软件的板库中选择一个24孔板。
- 聚焦与图像设置
- 选择相差通道。
- 选择一个具有代表性的孔（例如，A1）。
- 在进行延时成像采集前启动自动对焦。
- 使用相机图标拍摄图像。
- 确认细胞形态和聚焦质量。
- 导航至[流程/分析]。
- 选择[从图像集创建实验]以配置实验。
- 延时成像采集参数
- 打开[Procedure]设置面板。
- 设置温度至 37°C 和 CO₂ 5%
- 在[开始动力学]下，将运行时间设置为16:00:00。
- 将成像间隔设置为 0:10:00。
- 将总读数设为 97。
- 使用10–15分钟的成像间隔，以在捕捉早期吞噬事件时平衡时间分辨率与光毒性。
- 成像通道配置
- 将通道1设置为相差模式。
- 将通道2设置为GFP（激发波长469/35，发射波长525/39）。
- 选择一个10× 实现最佳视野和分辨率的目标
- 将照明、积分时间和增益设置为[自动]，或手动调节。
- 使用典型的GFP曝光时间100–300 ms，以避免信号饱和。
- 对所有孔应用相同的成像设置。
- 成像位置设置
- 打开[定义信标]菜单。
- 关闭Z轴层扫采集。
- 关闭图像拼接采集功能。
- 在单一焦平面上进行成像。
- 通过显微镜图标在每个孔内选择具有代表性且不重叠的区域，手动定义成像位置。
- 在所有时间点保持相同的成像位置。
- 每孔选择至少4–6个视野。
- 延时成像采集
- 点击[播放]以启动自动延时成像。
- 数据导出与可视化
- 采集完成后打开已保存的实验文件。
- 选择成像位置。
- 以MP4格式导出延时数据。
- 打开[Process Tool]。
- 如有需要，应用[图像去卷积]以增强可视化效果，并识别具有代表性的吞噬事件。
注意：仅使用延时成像进行定性观察。未被吞噬的GFP阳性癌细胞可能与巨噬细胞重叠或短暂结合，导致假阳性信号。请使用独立的终点检测法进行定量分析。
7. 终点吞噬作用定量分析
- 去除未内化的细胞
- 在相同的共培养条件下进行实验。
- 在4小时终止实验。
- 移除培养基。
- 加入含10 mM EDTA的PBS。
- 在37°C孵育5分钟。
- 用PBS轻轻洗涤，以去除未内化的GFP阳性细胞。
- 加入新鲜的巨噬细胞培养基。
- 用于定量的图像采集
- 使用相差和GFP通道采集图像。
- 每孔至少采集4–6个视野。
- 每种条件至少分析三个孔。
- 吞噬事件的定义
- 识别细胞边界内完全包裹GFP阳性信号的巨噬细胞。
- 图像分析
- 在ImageJ软件中打开图像。
- 使用Cell Counter插件。
- 计数总的巨噬细胞数量。
- 计数含有内化GFP阳性细胞的巨噬细胞数量。
- 吞噬指数的计算
- 计算：
- 以盲法方式进行分析。
- 在至少三次独立实验中重复分析。
- 计算：
- 数据展示
- 按时间顺序展示代表性的时间推移图像（图2B 和 图2C）。
- 展示代表性的终点图像（图3A 和 图3B）。
图3．通过终点分析定量抗体依赖性巨噬细胞吞噬作用。（A）巨噬细胞与GFP标记的乳腺癌细胞共培养4小时后，经EDTA处理去除未被吞噬的细胞，其代表性相差图像与GFP荧光图像如图所示。合并相差与GFP荧光通道以识别巨噬细胞及内部化的GFP阳性靶细胞。使用ImageJ软件中的Cell Counter插件对巨噬细胞（计数器0）和GFP阳性吞噬性巨噬细胞（计数器1）进行计数。在IgG对照组中未观察到吞噬事件，而抗CD24单克隆抗体处理组中巨噬细胞内出现明显的GFP阳性信号，表明发生了活跃的吞噬作用。比例尺 = 200 µm。（B）吞噬指数的定量结果，定义为含有内化GFP阳性细胞的巨噬细胞占总巨噬细胞群体的百分比。与IgG对照组相比，抗CD24单克隆抗体显著提高了吞噬指数（0.00 ± 0.00% vs. 18.76 ± 4.01%，均值 ± 标准差；每组n = 6个视野；***p < 0.001，Welch非配对t检验）。数据代表至少三次独立实验的结果。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
通过形态学评估和流式细胞术分析，确认了从外周血单个核细胞（PBMCs）成功生成并极化为巨噬细胞（图1）。通过密度梯度离心法分离的PBMCs在添加M-CSF的培养基中培养，至第7天时形成贴壁细胞，具有典型的巨噬细胞形态。经IFN-γ和LPS刺激后，细胞表现出与所施加条件一致的活化表型。流式细胞术分析显示，门控细胞中99.8%为CD11b阳性，证实了向巨噬细胞的高效分化（图1）。在CD11b阳性细胞中，绝大多数位于CD80⁺CD206⁻象限（95.2%），表明在指定刺激条件下实现了成功的极化。这些结果证实，该方案能够可靠地生成具有预期标志物表达谱的巨噬细胞。
延时成像实现了对抗体依赖性细胞吞噬作用的直接可视化（图2）。对所获取的延时数据和终点数据的图像分析流程详见补充图1。将GFP标记的CD24阳性乳腺癌细胞与巨噬细胞共培养，通过随时间推移GFP阳性细胞逐步被巨噬细胞内化的过...
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讨论
本方案中有多个步骤对于获得可靠且可重复的结果至关重要。首先，外周血单个核细胞（PBMC）分离的质量和纯度直接影响巨噬细胞的得率和分化效率。将稀释后的血液小心地铺在Ficoll密度梯度液上，并在离心时关闭刹车，是保持血浆与密度梯度液界面完整的关键，以利于获取白膜层。红细胞裂解不完全或裂解缓冲液作用时间过长均会降低PBMC的存活率。其次，在进行吞噬实验之前，必须通过流式细胞术验证促炎型巨噬细胞的极化状态；未能上调CD80表达的巨噬细胞可能吞噬能力减弱，从而干扰对抗CD24抗体效应的正确解读。第三，肿瘤细胞的解离方法也十分重要——应避免使用胰酶消化，因为酶解过程可能切割细胞表面的CD24，降低抗体结合效率。基于EDTA的细胞解离方法可保持表面抗原的完整性，因此推荐使用。
本方案可根据不同的实验目的进行调整。效应细胞与靶细胞的比例（E:T）可从本文所述比例进行调整；高于文中所述的2:1巨噬细胞与癌细胞比例（例如3:1或5:1）可增加每个视野中吞噬事件的发生频率，这在处理CD24表达水平较低的癌细胞系时可能更具优势。抗CD24抗体浓度（1 µg/mL）是针对本研究中使用的细胞系优化的，但在将...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由中国台湾教育部（MOE）高等教育深耕计划框架下的中国医药大学癌症生物学与精准治疗研究中心特色领域研究中心计划资助（CBPTC-PROJ-5-2）。
感谢癌症生物学与精准治疗中心提供资金和学术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）储备液 | Sigma-Aldrich（或同等产品） | E7889（或同等产品） | 用于配制 PBS 中含 10 mM EDTA 的工作液，以进行细胞解离 |
| 24孔组织培养板（TC处理） | 康宁（或同等品牌） | 3524 | 用于巨噬细胞与癌细胞在吞噬作用检测过程中的共培养 |
| 抗人CD206抗体（流式细胞术） | BioLegend（或同等产品） | 321122（或同等产品） | 替代性巨噬细胞表型标志物 |
| 抗人CD24单克隆抗体 | 赛默飞世尔科技公司（或同等产品） | MA1-91384（或等效产品） | 用于肿瘤细胞的抗体依赖性吞噬作用的调理 |
| 配备环境控制室的自动活细胞成像系统（例如，Lionheart FX） | 安捷伦科技公司（或同等产品） | BioTek Lionheart FX 自动显微镜 | 可在受控温度条件下实现长期延时成像 2 条件 |
| 用于自动活细胞成像的成像软件（例如 Gen5） | 安捷伦科技公司（或同等产品） | N/A | 用于延时成像数据的采集与分析 |
| 离心机（摆桶转子） | 赛默飞世尔科技公司（或同等产品） | Multifuge X4R Pro 配备 TX-1000 转子（或同等型号） | 用于PBMC分离和细胞洗涤步骤 |
| 2 培养箱（37°C，5% 2) | 赛默飞世尔科技（或同等产品） | 直接加热法 2 培养箱（或同等设备） | 维持细胞培养的生理条件 |
| 2 带调节阀的气体供应 | 安捷伦科技公司（或同等产品） | N/A | 材料与试剂 2 用于培养箱和成像系统的环境控制 |
| 锥形管（15 mL 和 50 mL） | Corning（或同等产品） | 352070（或同等型号） | 用于PBMC的分离、洗涤和离心步骤 |
| EDTA抗凝采血管（真空采血管） | BD 生物科学公司（或同等产品） | 367863（或同等产品） | 用于采集供体的全血样本 |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva（或同等产品） | 17144003（或同等编号） | 用于分离外周血单个核细胞的密度梯度介质 |
| 流式细胞仪（例如 FACSCanto II） | BD 生物科学（或同等产品） | BD FACSCanto II | 用于巨噬细胞的表型分析 |
| 补偿微珠（流式细胞术） | Biolegend（或同等产品） | 424602 | 用于单色补偿对照 |
| FITC 抗人 CD11b 抗体（流式细胞术） | BioLegend（或同等产品） | 101205（或同等产品） | 用于鉴定巨噬细胞的标记物 |
| PE 抗人 CD80 抗体（流式细胞术） | BioLegend（或同等产品） | 375410（或同等产品） | 与活化巨噬细胞表型相关的标志物 |
| 表达GFP的乳腺癌细胞系（MDA-MB-468） | ATCC（或同等机构） | HTB-132（或等效产品） | 吞噬作用实验中使用的靶细胞；GFP可实现可视化 |
| ImmunoCult-SF 巨噬细胞培养基 | STEMCELL Technologies（或同等产品） | 10961（或同等产品） | 用于巨噬细胞分化的无血清培养基 |
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | 赛默飞世尔科技（或同等产品） | 12100046 | 用于癌细胞的培养和重悬 |
| 同型对照抗体（IgG） | Bio X Cell（或同等产品） | BE0297（或同等产品） | 抗体依赖性吞噬作用检测的阴性对照 |
| 脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich（或同等产品） | L2630（或等效产品） | 用于与IFN联合激活巨噬细胞的刺激物γ |
| 重组人干扰素γ（IFN-γ) | STEMCELL Technologies（或同等产品） | 78020（或同等产品） | 用于巨噬细胞激活的细胞因子 |
| 重组人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） | STEMCELL Technologies（或同等产品） | 78057（或等效产品） | 用于巨噬细胞分化的生长因子 |
| 巴斯德吸管或血清移液管 | Jetbiofil（或同等产品） | GSP010010（或同等产品） | 用于PBMC分离和细胞培养过程中的液体操作 |
| PBS（Ca²⁺）2+-/Mg2+无（free） | 赛默飞世尔科技公司（或同等产品） | BP399-500（或等效产品） | 用于洗涤细胞和稀释步骤的缓冲液 |
| 培养皿（100 mm，非–组织培养处理的 | 康宁（或同等品牌） | 430591 | 通过贴壁筛选法用于巨噬细胞分化 |
| 红细胞裂解缓冲液 | BioLegend（或同等产品） | 420301（或同等产品） | 用于在分离外周血单个核细胞时去除红细胞 |
| Viobility 405/452 可固定染料 | 美天旎生物技术（或同等产品） | 130-130-404（或同等产品） | 用于在流式细胞术分析过程中评估细胞活力 |
| DAPI | Sigma-Aldrich（或同等产品） | D9542（或等效产品） | 用于流式细胞术中的死细胞排除 |
参考文献
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