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一种用于小鼠脑区形态学观察与联合RNA-蛋白提取的半脑分离方案

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DOI：

10.3791/71465

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2026年9月1日

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1College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, 2The Transvascular Implant Instrument Research Institute, 3The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 4College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案将小鼠脑组织一分为二。其中一半用于形态学染色，另一半用于RNA和蛋白质提取。该策略可减少动物使用量，遵循3R原则，并最大限度降低个体间差异。

摘要

在日常神经科学研究中，形态学染色与核酸/蛋白质分子检测通常需要使用不同的实验动物，这增加了动物使用量，不符合动物福利的3R原则。本方案建立了一种小鼠脑组织的组织分配流程，可从单只动物中同时获得用于形态学和分子学分析的配对样本。经0.9%生理盐水心脏灌流后，将脑组织沿中线切分为两个半球。其中一个半球用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学和免疫荧光染色；切片保存于蔗糖-乙二醇-聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液中，染色质量可稳定维持长达七年。对侧半球则于-80 °C冷冻保存，用于同时提取RNA和蛋白质，所得产量足以满足后续qPCR和Western Blot分析。该方法在9–10 mg内嗅皮层穿孔组织上进行测试，其RNA和蛋白质得率低于单独分别提取RNA或蛋白质的方法，但所获得的生物分子仍足以满足分子检测需求。该流程减少了动物使用量，并消除了配对形态学与分子学分析之间的个体间差异，为小鼠脑内特定亚区的多维度分析提供了一种可行的组织制备方法。

引言

近年来，神经科学研究取得了显著进展，揭示了调控人类大脑生理、神经系统疾病发生以及治疗开发的关键机制。动物模型对于神经科学研究仍然不可或缺，为探索神经发育、生理功能和病理过程提供了可控且可重复的平台。通过对小鼠进行实验操作和组织学观察，研究人员能够表征神经元信号传导、神经回路形成以及神经与行为之间的关联。随着技术的进步，动物实验伦理问题也日益受到重视。“3R原则”（替代、减少和优化）现已成为全球公认的动物实验标准1,2，要求研究人员在保证实验结果可靠的前提下，尽可能减少动物使用数量。

条件性基因敲除系统等创新工具可实现对小鼠脑内特定亚区的精确遗传操作3。这些技术进步推动了对调控学习、记忆和情绪等功能的脑内微区（如海马体CA1、CA3和DG区）的深入研究4。要解析这些微小脑区的高级功能，需要协调进行形态学、转录水平和蛋白质水平的多重检测。然而，由于其组织量极少，开展并行多指标检测面临重大技术挑战。

形态学染色、RNA 定量和蛋白质免疫检测是神经科学中三种常规的核心检测方法。传统的研究设计需要使用三组独立的小鼠动物模型来完成这三种类型的检测。这种做法显著增加了动物使用量，并引入了较大的个体间生物学变异，从而削弱了组织学与分子数据集之间的可比性。若能建立一种统一的工作流程，从同一只动物中获取匹配的形态学和分子信号，则可有效克服上述两个关键局限性，并更好地遵循“3R 原则”中的“减少”（Reduction）原则。

本文报道了一种可重复的小鼠脑组织半脑分离方案。在经全身生理盐水灌注后，将完整脑组织分为两个半脑：其中一个半脑用于固定以进行形态学检测，对侧半脑则进行冷冻保存，用于同时提取RNA和蛋白质。采用蔗糖-乙二醇-聚乙烯吡咯烷酮（PVP）保护缓冲液固定并储存的组织，其免疫组织化学和免疫荧光染色信号稳定且质量高，可保持长达七年。我们使用内嗅皮层中仅9–10 mg的微小组织穿孔样本对该方法进行了验证，该组织重量轻于海马和前额叶皮层等常规研究脑区。成功检测到该微量组织样本表明，下丘脑和杏仁核等更小的脑亚区同样适用于本实验流程。尽管该方案获得的RNA和蛋白质浓度低于专用的单用途提取试剂盒，但所分离的生物分子质量足够满足常规下游qPCR和Western blot分析的需求。该流程可减少动物使用量，并消除配对形态学与分子分析之间的个体间差异，为小鼠脑精细亚区的多维度分析提供了一种可行的组织制备方法。

方案

伦理声明

本研究中进行的所有动物实验均由中国大连医科大学 Institutional Animal Care and Use Committee 批准（大鼠实验批准号：AEE18026，小鼠实验批准号：AEE24261）。所有实验方案均依照实验动物伦理指南实施，并完全符合动物实验的 3R 原则（减少、替代与优化）。在整个实验过程中，采取了严格的措施以有效减轻动物的痛苦与不适。同时，实验动物数量被控制在确保统计分析结果可靠性和有效性所需的最小数量。本方案中所用试剂、耗材和设备的完整清单见《材料表》。

1. 实验动物准备及经心灌注手术

  1. 麻醉与术前准备
    1. 本方案使用无特定病原体（SPF）级成年雄性Sprague-Dawley大鼠或C57BL/6小鼠。将动物饲养在温度受控（22 ± 2 °C）的环境中，光照/黑暗周期为12小时。提供无菌食物和水，自由摄取。
    2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠诱导麻醉，大鼠剂量为80 mg/kg，小鼠剂量为50 mg/kg（见图1）。
  2. 经心脏灌注操作
    1. 将麻醉后的动物仰卧位固定于手术板上。
    2. 使用直剪刀沿中线从剑突至耻骨联合切开腹壁，双侧剪开胸侧壁，充分暴露心脏。
    3. 以恒定流速用冰冻的0.9%生理盐水进行灌注：大鼠灌注100–150 mL，持续10–15分钟；小鼠灌注20–30 mL，持续5–8分钟。
  3. 脑组织采集与半球分离
    1. 灌注完成后，使用大型手术剪将动物断头。沿中线剪开头皮，暴露颅骨。
    2. 使用无菌刮勺轻轻将脑组织从颅腔中抬起，迅速将完整脑组织转移至置于冰上的无菌培养皿中。
    3. 使用无菌、无RNase的刀片沿矢状缝对称地将脑组织分为左右半球。
    4. 立即将左半球转移至含有10 mL冰冻4%多聚甲醛溶液的15 mL离心管中进行固定。将右半球转移至标记好的无RNase冷冻保存管中，液氮速冻后于-80 °C保存，用于后续RNA和蛋白质提取。

2. 脑组织固定、切片与长期保存

  1. 固定与脱水
    1. 将左侧脑半球完全浸入4%多聚甲醛溶液中，在4 °C条件下固定组织24 h。固定完成后，将脑半球转移至含有30%蔗糖溶液的15 mL离心管中，在4 °C条件下进行脱水处理。
    2. 每24 h更换一次30%蔗糖溶液，直至脑组织沉入管底。
  2. 冷冻切片制备
    1. 从蔗糖溶液中取出已脱水的脑半球，用无菌滤纸轻轻吸去多余液体。
    2. 使用最佳切割温度（OCT）包埋介质将脑半球固定于冷冻切片机的样品台上。
    3. 利用冷冻切片机连续切取厚度为30 µm的冠状面脑切片，并将连续切片收集至含有无菌0.01 M PBS的24孔板中。
  3. 脑切片的长期保存
    1. 预先配制脑切片抗冻保护保存液：在100 mL 0.01 M PBS中加入2 g PVP400、60 g蔗糖和60 mL乙二醇，在室温下搅拌至所有成分完全溶解，保存于4 °C备用。

3. 使用TRIzol提取RNA

  1. 组织匀浆与相分离
    1. 使用超细匀浆器在1 mL TRIzol试剂中匀浆内嗅皮层组织，将匀浆液置于冰上孵育15分钟。在4 °C下以8,000 × g离心5分钟。
    2. 加入200 µL氯仿，涡旋振荡10秒。在4 °C下以5,600 × g离心15分钟。然后将上层水相转移至无RNase的离心管中。加入500 µL异丙醇，在-20 °C孵育过夜以沉淀RNA。再次离心。
  2. RNA沉淀、洗涤与质量评估
    1. 弃去上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。在4 °C下以5,600 × g离心5分钟。移除上清液，将沉淀在空气中干燥10分钟，然后在20 µL经DEPC处理的水中溶解RNA，持续10分钟。
    2. 使用分光光度计测定RNA浓度和纯度（A260/A280）。将RNA储存于-80 °C，待后续分析使用。

4. 使用 Minute 试剂盒提取总蛋白

  1. 组织裂解与匀浆
    1. 将离心柱和收集管预先在冰上预冷。使用超细匀浆器在100 µL细胞裂解缓冲液中匀浆组织。用额外的100 µL细胞裂解缓冲液冲洗匀浆器，并将裂解液合并。
  2. 蛋白质回收与定量
    1. 将匀浆液转移至离心柱中，在室温下孵育2分钟。
    2. 在11,000–14,300 × g条件下离心2分钟。
    3. 离心后立即将收集管置于冰上，并弃去离心柱。使用BCA法测定蛋白质浓度。

5. 从内嗅皮层（9–10 mg）同时提取RNA和蛋白质

  1. 实验前准备与试剂配制
    1. 所有提取步骤均使用DNA/RNA/蛋白试剂盒。仅使用经过认证的无RNase和无DNase耗材（见图2）。
    2. 使用前立即配制裂解缓冲液：按1:100稀释比例将蛋白酶抑制剂混合液加入试剂盒提供的裂解缓冲液中。
  2. 组织裂解与相分离
    1. 将冷冻的右侧脑半球从-80 °C取出并置于冰上。使用无菌且无RNase的打孔器从目标脑区采集9–10 mg组织。
    2. 在冰上使用电动组织匀浆器彻底匀浆组织，直至无可见组织碎片残留。将匀浆液在冰上孵育10分钟，以确保完全裂解。
    3. 向匀浆液中加入200 µL试剂盒提供的分离试剂。剧烈涡旋震荡管子30秒，并在室温下孵育3分钟。在4 °C下以8,000 × g离心15分钟，实现完全相分离。
  3. RNA纯化与洗脱
    1. 使用无RNase的移液枪头小心收集上层水相。将收集的水相转移至新的1.5 mL无RNase离心管中。向收集的水相中加入等体积的100%乙醇并混匀。
    2. 将700 µL混合液转移至试剂盒提供的RNA纯化柱中。在室温下以5,600 × g离心1分钟。
    3. 向纯化柱中加入500 µL试剂盒提供的RNA洗涤缓冲液1。在室温下以5,600 × g离心1分钟。
    4. 再向纯化柱中加入500 µL试剂盒提供的RNA洗涤缓冲液2，再次离心。将空柱在室温下以8,000 × g离心2分钟，以彻底去除柱膜中的残留乙醇。
    5. 将纯化柱转移至新的无RNase 1.5 mL微量离心管中。直接向柱膜中心加入30–50 µL无RNase水（预热至60 °C）。在室温下孵育2分钟。在室温下以8,000 × g离心1分钟，以洗脱RNA。
  4. 蛋白质沉淀与溶解
    1. 在用于RNA提取并移除水相后的原始管中，向剩余的有机相和中间相加入750 µL异丙醇。在-20 °C孵育30分钟，以沉淀蛋白质。
    2. 在4 °C下以8,000 × g离心10分钟。弃去上清液，保留管底完整的蛋白沉淀。
    3. 向蛋白沉淀中加入1 mL 95%乙醇。短暂涡旋震荡以洗涤沉淀。在4 °C下以8,000 × g离心5分钟，弃去上清液。重复此洗涤步骤两次。
    4. 在室温下将蛋白沉淀空气干燥5–10分钟，直至沉淀变为半透明且无可见残留乙醇。
    5. 向干燥的沉淀中加入50–100 µL 5–10% SDS溶液。剧烈涡旋震荡1分钟，并在冰上孵育10分钟以充分溶解蛋白。在4 °C下以8,000 × g离心5分钟。收集上清液作为最终的蛋白提取物。

6. 免疫组织化学（IHC）染色

  1. 切片预处理与内源性酶失活
    1. 从 -20 °C 的防冻剂中取出脑切片，使用玻璃针将切片转移至含有 0.01 M PBS（pH 7.4）的 24 孔板中。
    2. 在摇床上用 0.01 M PBS 室温洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    3. 将切片在 3% 过氧化氢过氧化物阻断剂中室温孵育 10 分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。阻断后重复洗涤步骤。
  2. 通透化与非特异性封闭
    1. 将切片在 0.5% Triton X-100 中室温摇床孵育 30 分钟，以实现细胞膜通透化。随后重复洗涤步骤。
    2. 将切片在 4% 牛血清白蛋白中室温孵育 30 分钟，接着在非特异性染色抑制剂中额外孵育 30 分钟（室温）。
  3. 一抗与二抗孵育
    1. 将一抗用 1% BSA 溶液按以下优化稀释比例稀释：双皮质素（DCX, 1:4000）、神经元核抗原（NeuN, 1:3000）、钙离子结合接头分子 1（Iba-1, 1:2000）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP, 1:2000）。
    2. 向每孔加入 200 µL 稀释后的一抗溶液，确保切片完全浸没。
    3. 向每孔加入 200 µL 生物素标记的二抗溶液，室温孵育 30 分钟。
    4. 用 0.01 M PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。向每孔加入 300 µL 链霉亲和素-过氧化物酶偶联物，室温孵育 30 分钟。孵育后重复洗涤步骤。
  4. 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）显色与封片
    1. 向每孔加入 200 µL DAB 工作液，在光学显微镜下观察显色反应。
    2. 使用玻璃针将切片贴附于明胶包被的载玻片上，室温下完全自然干燥。
    3. 依次通过梯度乙醇（50%、70%、90%、95%、100%、100% 乙醇，每次 5 分钟）脱水，随后用二甲苯透明两次，每次 5 分钟。

7. 免疫荧光（IF）染色

  1. 切片预处理与通透化
    1. 从 -20 °C 的冷冻保护剂中取出脑切片，转移至含有 0.01 M PBS（pH 7.4）的 24 孔板中。
    2. 在摇床上，室温下用 0.01 M PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    3. 在摇床上，室温下用 0.5% Triton X-100 孵育切片 30 分钟。
    4. 通透化处理后，在摇床上用 0.01 M PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。
  2. 封闭与一抗孵育
    1. 在湿盒中，室温下用含 4% BSA 和非特异性染色抑制剂的封闭液孵育切片 1 小时。
    2. 吸除封闭液。将一抗按优化浓度用 1% BSA 溶液稀释后，每孔加入 300 µL 稀释后的一抗溶液。在 4 °C 湿盒中避光孵育过夜。
  3. 二抗孵育
    1. 次日，在避光条件下于室温复温 1 小时。回收一抗溶液，在避光条件下于摇床上用 0.01 M PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。
    2. 按生产商推荐稀释比例，将荧光标记的二抗用 1% BSA 溶液稀释，每孔加入 300 µL 二抗溶液。室温避光孵育 1–2 小时。
    3. 在避光条件下用 0.01 M PBS 洗涤切片 5 次，每次 5 分钟。

8. 定量实时聚合酶链式反应（qPCR）分析

  1. RNA 去除基因组 DNA 及反转录
    1. 使用反转录试剂盒进行反转录反应，以合成 cDNA，每 20 µL 反应体系中加入 1 µg 总 RNA。采用试剂盒推荐的热循环程序：25 °C 反应 5 min，50 °C 反应 15 min，85 °C 反应 5 min，然后保持在 4 °C。
    2. 用无 RNase 水将合成的 cDNA 按 1:5 比例稀释。将 cDNA 储存于 -20 °C，待进行 qPCR 扩增。
  2. qPCR 反应体系配制与扩增
    1. 在专用的无 RNase PCR 操作台中，于冰上配制 qPCR 反应体系。20 µL 反应体系包含：10 µL qPCR Master Mix，0.4 µL 正向引物（10 µM），0.4 µL 反向引物（10 µM），2 µL 稀释后的 cDNA 模板，7.2 µL 无 RNase 水。
    2. 采用以下程序进行 qPCR 扩增：95 °C 预变性 30 s；进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 变性 10 s，60 °C 退火延伸 30 s；随后进行解离曲线分析，温度从 60 °C 升至 95 °C，每 5 s 升高 0.5 °C。

9. 蛋白质印迹

  1. 蛋白质定量与样品制备
    1. 根据BCA测定结果，使用5–10% SDS溶液将蛋白质提取物稀释至相同浓度。
  2. SDS-PAGE电泳与蛋白质转膜
    1. 按照标准分子生物学方案，制备10% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶。
    2. 每孔上样20 µg总蛋白。进行梯度上样实验时，每孔分别上样15 µg、30 µg和45 µg蛋白。
    3. 以80 V电泳30分钟，直至蛋白Marker进入分离胶，然后将电压升至120 V，继续电泳60–90分钟，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部。
    4. 按以下顺序组装转膜“三明治”结构（从阴极到阳极）：海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵。确保凝胶与膜之间无气泡残留。
    5. 在冰浴条件下，以300 mA恒定电流进行湿法转膜90分钟。
  3. 膜封闭与抗体孵育
    1. 转膜完成后，用TBST缓冲液短暂漂洗PVDF膜。将膜置于5% BSA溶液中，在摇床上室温孵育2小时，以封闭非特异性结合位点。
    2. 用5% BSA溶液将一抗稀释至优化浓度。将膜与一抗溶液在4 °C摇床上孵育过夜。
    3. 次日，在摇床上用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。
    4. 按厂家推荐稀释比例，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗稀释于5%脱脂奶粉溶液中。将膜与二抗溶液在摇床上室温孵育2小时。
    5. 二抗孵育后，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。随后将膜与ECL底物溶液在避光条件下孵育1–2分钟。

结果

RNA浓度测定、琼脂糖凝胶电泳及qPCR分析

如图所示，使用DNA/RNA/蛋白联合提取试剂盒从内嗅皮层组织（9–10 mg）打孔样本中同时提取了总RNA和蛋白质。平行样本分别采用TRIzol（用于RNA）或蛋白提取试剂盒处理作为对照。该方法获得的RNA产量为235 ± 12 ng µL⁻1，比TRIzol法低36%（p < 0.05）（图3A）。然而，琼脂糖凝胶电泳显示出清晰的28S和18S rRNA条带以及5S信号，表明RNA保持完整（图3B）。CD86、IL-1β、TNF-α和IL-6的qPCR扩增均产生单一且对称的解离曲线（图3C），该组中Ct值较低（图3D）；然而，仍需进一步研究（包括RNA完整性分析）以确定这些差异是否反映了RNA质量的提升或提取效率的提高。尽管RNA得率低于TRIzol法，但清晰的28S和18S rRNA条带以及特异性的qPCR扩增曲线表明所提取的RNA质量足以满足后续qPCR分析的要求。

蛋白质浓度测定、SDS-PAGE 及 Western 印迹分析

与RNA数据一致，双相提取方案获得的总蛋白浓度低于蛋白试剂盒（p ＜ 0.05）。然而，Western blot结果显示，所检测的每个靶蛋白在双相提取样本中均呈现出明显更强的免疫反应性条带（图4A）。与RNA定量结果一致，RNA–蛋白共提取方案所回收的总蛋白量少于专用的单用途蛋白试剂盒，这一点可通过CBB全蛋白染色观察到（图4B–C）。在两种提取方法下，看家蛋白β-Tubulin均显示出清晰且稳定的条带，信号强度相当。低丰度的ULK蛋白在共提取样本中也成功被检测到。值得注意的是，PSD-95、p-ERK和p-NFκB p65在共提取组中的条带信号明显强于单次蛋白提取试剂盒组。在两组样本中，蛋白上样量从15 µg到45 µg均产生所有检测靶标的剂量依赖性条带梯度。综上所述，尽管双相提取流程的总蛋白得率较低，但其蛋白质量足以满足常规Western blot分析要求，整体检测性能不逊于传统的单用途蛋白提取试剂盒。

免疫组织化学与免疫荧光

对保存0.5–7年的脑切片进行免疫组织化学染色，结果显示DCX⁺新生神经元、AVP⁺分泌细胞以及MAP2/NeuN⁺神经元均呈现强阳性标记，且形态完整，纤维结构清晰（图5A）。对保存5–7年的切片进行免疫荧光染色，可清晰观察到GFAP⁺星形胶质细胞、Iba-1⁺小胶质细胞以及FosB⁺活化神经元（图5B）。在本实验条件下，代表性切片即使保存0.5–7年，仍可检测到免疫组织化学和免疫荧光信号。因此，该保存液能够维持组织完整性及抗原性，实现可靠的长期保存。

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图1：用于脑形态学与分子检测的半脑分离整合工作流程。 该示意图展示了完整的实验流程，包括啮齿类动物经心脏灌注生理盐水、分离出的完整脑组织沿中线切分为两半、将左侧半脑固定并制备冷冻切片用于免疫组化（IHC）/免疫荧光（IF）染色，以及对侧半脑进行冷冻保存，以用于后续同时进行RNA-蛋白共提取、定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析。所有小鼠示意图均由Jimeng AI首次生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：从冻存的啮齿类动物脑组织中同时提取RNA和蛋白质的工作流程。 该图展示了从冻存的半脑中 punch 出目标组织、组织裂解和三相分离、RNA纯化与洗脱用于qPCR，以及蛋白质沉淀、洗涤和溶解以制备用于Western blot检测的样本等连续步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3使用微量大鼠内嗅皮层样本评估RNA得率、RNA完整性及qPCR兼容性 (A) 通过共提取试剂盒与TRIzol法获得的RNA浓度定量结果（均值 ± 扫描电子显微镜（SEM）。B琼脂糖凝胶电泳显示两个提取组均具有完整的28S和18S rRNA条带。C) 单个熔解曲线证实了目标炎症基因及作为参考基因的GAPDH的特异性扩增。D两种提取方法在相同RNA投入量下检测到的炎症基因的Ct值。*p < 0.05, **p < 0.01 与 TRIzol 组对比。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图4：通过RNA/蛋白质共提取方案回收的蛋白质的Western印迹分析。 (A) 梯度蛋白上样（15/30/45 µg) 显示突触和信号蛋白的剂量依赖性条带信号。BULK1 大分子量蛋白检测，以考马斯亮蓝总蛋白染色作为上样参照。C两种提取流程间目标蛋白的等量上样Western印迹比较 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图5保存0.5–7年的游离脑切片的免疫组织化学和免疫荧光染色 (A) 200倍明场免疫组织化学染色显微照片× 和 400× 放大倍数。DCX 和 AVP 染色在小鼠组织样本上进行，而 MAP2 和 NeuN 染色在大鼠组织样本上进行。B大鼠组织样本获得的代表性免疫荧光图像。 GFAP 标记星形胶质细胞，IBA-1 标记小胶质细胞，FOSB 指示神经元活动。 本图中所示的所有免疫荧光染色实验均使用大鼠样本进行，以评估神经元标志物的表达及细胞定位， 200 倍显微照片× 放大倍数  请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在小鼠研究中，由于形态学分析与核酸/蛋白检测的制备流程不同，通常需要使用不同的动物样本。这会增加动物使用量，并引入个体间的生物学差异，从而可能降低组织学与分子数据集之间的可比性。为解决这些局限性，我们开发了一种工作流程，可从同一只动物中同时获取组织学和分子数据。

该实验流程的核心设计是在经心脏灌注0.9%生理盐水后，将脑组织分为两个半球5,6。其中一个半球用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学和免疫荧光染色，而对侧半球则储存于−80 °C，用于后续的RNA-蛋白共提取、qPCR和Western blot分析。然而，所选检测指标在两个大脑半球之间可能并不完全可比。已有研究记录显示，啮齿类动物大脑存在结构和功能上的偏侧化，此类半球间差异可能在对对侧组织进行分析时引入变异性7,8。因此，研究人员应根据其研究目的，始终选择同一侧大脑半球的组织进行实验。

该方法的一个显著优势在于能够长期保存固定的漂浮脑切片。经过30%蔗糖脱水后，30 µm冠状切片被储存在蔗糖-乙二醇-PVP保存液中。先前的研究表明，蔗糖-乙二醇-PVP冷冻保护溶液有助于在长期储存期间维持组织形态和抗原性9,10。然而，很少有研究评估超过数年的储存时长。本实验室的数据进一步拓展了这些发现：在测试条件下，储存长达七年的代表性切片仍可检测到免疫组织化学和免疫荧光信号。这些观察结果支持将漂浮脑切片储存数年，用于回顾性分析和后续实验的可行性。

值得注意的是，该实验流程通过从单个冷冻脑半球中同时提取RNA和蛋白质，提供了另一项关键优势。尽管这种共提取方案所获得的RNA和蛋白质量略低于传统的单一靶标提取方法，但所得生物材料仍足以进行可靠的qPCR和Western blot检测。关键在于，共提取技术能够从完全相同的组织样本中定量转录本和蛋白质的丰度，消除了因独立样本处理而产生的生物学变异，从而实现高度一致且整合的分子谱型分析11,12。此外，该方法仅需约9–10 mg的少量组织，因此特别适用于样本量有限的特定脑区亚群的分析。

尽管该方法具有上述显著优势，但也存在某些局限性，需予以重视。首先，相对较低的RNA和蛋白质得率可能限制其在需要大量核酸或蛋白质实验中的应用，例如大规模蛋白质纯化或高深度RNA测序。其次，虽然组织切片的长期保存在七年内效果良好，但某些不稳定的抗原或核酸仍可能随着时间推移逐渐降解，从而影响染色强度或分子检测的灵敏度。第三，该方法目前主要针对小鼠脑组织进行优化，若应用于其他组织或不同的动物模型，可能需要进行相应调整，因为不同物种和器官的组织组成及结构特性存在差异。最后，5–10%的SDS可能干扰质谱分析、酶活性测定、蛋白质-蛋白质相互作用研究13,14以及其他对SDS敏感的应用。因此，可能需要额外的去污剂去除或缓冲液置换步骤。

综上所述，这种半脑分配流程能够在减少动物使用数量和个体间变异的同时，对同一动物进行形态学与分子学的配对分析。该流程适用于需要进行组织学与分子学配对分析的研究，尤其在组织样本有限的情况下具有重要价值。其长期切片保存能力还可支持回顾性分析和标准化样本归档，而使用小脑区样本的特点则有利于特定脑区的深入研究。该流程的主要局限性包括RNA和蛋白质得率较低、可能存在半脑不对称性、仅限于小鼠脑组织应用，以及与SDS敏感性实验的兼容性有限。未来的研究应优化生物分子的回收效率，验证该流程在其他组织和物种中的适用性，并评估其他分子靶标在长期储存中的稳定性。

披露

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究由辽宁省教育厅（一般研究项目 JYTMS20230571）与大连医科大学资助。’s 2023 “中西医结合促进健康与保健” 辽宁省本科教学改革研究项目（H0.2XY2023KY10），两项均授予刘CQ教授；以及2025年辽宁省大学生创新创业训练计划项目。 & 创业培训计划（S202510161061）与中国大连医科大学’本科生创新人才培养与教学改革基金（项目编号：112307010209），由 YK Li 获得。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 无RNA酶离心管AxygenMCT-150-C-S组织穿孔样本及RNA/蛋白提取组分的收集
15 mL 锥形离心管BiofilCFT010150固定、蔗糖脱水及溶液储存
24孔细胞培养板NEST702001游离脑切片的收集、染色及长期保存
30% 蔗糖溶液实验室自制N/A冷冻切片前对固定脑半球进行冷冻保护
4% 多聚甲醛溶液BiosharpBL539A用于形态学指定脑半球的浸没式固定
5× 蛋白上样缓冲液Beyotime BiotechnologyDL101SDS-PAGE蛋白样品制备
琼脂糖SolarbioCat: A8201通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性
抗双皮质素抗体Abcamab18723双皮质素免疫组织化学的一抗
抗ERK抗体BeyotimeAB2014总ERK蛋白Western blotting的一抗
抗GFAP抗体Abcamab10062胶质纤维酸性蛋白免疫荧光的一抗
抗Iba1抗体WakoNCNP24离子化钙结合接头分子1免疫荧光的一抗
抗NeuN抗体MilliporeA60神经元核抗原染色的一抗
抗NF-κB p65抗体HUABIOET1603-12NF-κB p65 Western blotting的一抗
抗磷酸化ERK抗体BeyotimeET1610-13磷酸化ERK蛋白Western blotting的一抗
抗PSD95抗体HUABIOET1602-20PSD95蛋白Western blotting的一抗
抗ULK1抗体HUABIOET1704-63ULK1蛋白Western blotting的一抗
抗-β-微管蛋白抗体ABclonalAC021Western blotting中作为上样对照的一抗
抗荧光淬灭封片剂BeyotimeP0126-5免疫荧光染色切片的封片介质
生物素-链霉亲和素过氧化物酶检测试剂盒福州迈新生物技术有限公司KIT-9720DAB免疫组织化学的二抗检测系统
牛血清白蛋白千胜生物科技有限公司QO3000免疫染色和Western blotting的封闭缓冲液
C57BL/6小鼠辽宁长生生物科技有限公司4周龄C57BL/6小鼠用于小鼠脑组织采集的实验动物（如包含）
化学发光成像系统上海勤翔科学仪器有限公司ChemiScope 6200 Touch检测Western blot化学发光信号
共聚焦激光扫描显微镜Leica Microsystems CMS GmbHSN: 591974免疫荧光切片图像采集
冷冻保护保存液实验室自制N/A在−20 °C下长期保存游离脑切片
冷冻切片机LeicaCM1950制备30 μm冠状面脑切片
DAB显色底物试剂盒SigmaSLBP7387V免疫组织化学显色反应
DAPI核染色液CoolaberSL7100免疫荧光中的核复染
数字光学显微镜宁波永新光学股份有限公司型号 NE910+FL-900监测DAB显色过程及明场染色切片成像
DNase IVazymeR223-01逆转录前去除残留基因组DNA
驴抗兔IgG，488标记Thermo Fisher ScientificA21206免疫荧光用荧光二抗
驴抗兔IgG，594标记Abcamab150076免疫荧光用荧光二抗
E.Z.N.A. DNA/RNA/蛋白提取试剂盒Omega Bio-TekD3892-01
电泳电源Bio-Rad1645050琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE的电源供应
乙二醇国药集团化学试剂有限公司10009828冷冻保护保存液的组分
凝胶成像系统上海勤翔科学仪器有限公司ChemiScope 6200 Touch琼脂糖凝胶成像以评估RNA质量
明胶包被载玻片启泰实验耗材制造有限公司REF: 10127105P P/N: 80312-2101用于贴附DAB染色的游离脑切片
图像分析软件美国国立卫生研究院ImageJ/FijiWestern blot条带密度分析及图像处理
异丙醇国药集团化学试剂有限公司80109218从有机相/中间相中沉淀蛋白
制冷型微量离心机盐城凯特实验室仪器有限公司TGL16MRNA/蛋白提取及洗涤步骤中的离心操作
Minute蛋白提取试剂盒InventMS-026
中性树胶封片剂 上海源叶生物科技有限公司，中国上海目录号 S30509，CAS 96949-21-2脱水后DAB染色切片的封片
OCT包埋介质Sakura4583用于固定脑半球冷冻切片的包埋介质
光学qPCR板或管AxygenPCR-0208-CqPCR扩增反应容器
Parafilm封口膜amcorPM996密封多孔板以长期保存切片
戊巴比妥钠华兰生物57-33-0经心灌流前的麻醉剂
培养皿BiosharpBS-90-D冰上处理脑组织及分离脑半球
酚/胍盐RNA提取试剂SparkladeAC0101-BRNA提取对照实验的比较试剂
磷酸酶抑制剂混合物APExBIOK1015-100蛋白提取过程中维持磷酸化状态
磷酸盐缓冲液BiosharpBL601A洗涤缓冲液、蔗糖溶液溶剂及冷冻保护剂溶剂
聚偏二氟乙烯膜MilliporeIPVH08100Western blot转膜用膜
聚乙烯吡咯烷酮K40Sigma9003-39-8冷冻保护保存液的组分
蛋白酶抑制剂混合物BeyotimeP1045组织裂解过程中防止蛋白降解
蛋白提取试剂盒InventMS-026总蛋白提取对照实验的比较试剂盒
实时PCR系统AmolarrayMA6000定量PCR扩增及熔解曲线分析
十二烷基硫酸钠BioFroxx3250GR500溶解蛋白沉淀及SDS-PAGE样品制备
无菌剃刀刀片BiosharpBS-RB-11冰上分离脑半球及修剪组织
链霉亲和素-过氧化物酶偶联物福州迈新生物技术有限公司KIT-9720DAB免疫组织化学的信号放大/检测试剂
蔗糖沪试57-50-1冷冻保护溶液及冷冻保护保存液的组分
SYBR qPCR预混液VazymeQ711-02定量PCR扩增
转膜装置Bio-Rad1703930将蛋白从SDS-PAGE凝胶湿法转至膜上
含Tween 20的Tris缓冲盐水实验室自制N/AWestern blot膜洗涤缓冲液
Triton X-100Sinopharm9002-93-1免疫染色前脑切片的通透处理
TrizolSparkladeAC0101-B
UltraSensitive SP免疫组织化学检测试剂盒（适用于鼠/兔一抗）福州迈新生物技术有限公司KIT-9720DAB免疫组织化学的二抗/检测试剂
Wistar大鼠辽宁长生生物科技有限公司280-320 g，雄性用于大鼠脑组织采集的实验动物（如包含）
二甲苯国药集团化学试剂有限公司10023418封片前对DAB染色切片进行透明处理
中性树胶封片剂 上海源叶生物科技有限公司，中国上海目录号 S30509，CAS 96949-21-2脱水后DAB染色切片的封片
链霉亲和素-过氧化物酶偶联物福州迈新生物技术有限公司KIT-9720DAB免疫组织化学的信号放大/检测试剂
Triton X-100Sinopharm9002-93-1免疫染色前脑切片的通透处理
UltraSensitive SP免疫组织化学检测试剂盒（适用于鼠/兔一抗）福州迈新生物技术有限公司KIT-9720DAB免疫组织化学的二抗/检测试剂
二甲苯国药集团化学试剂有限公司10023418封片前对DAB染色切片进行透明处理

参考文献

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