一种多色3D-STORM高分辨率可视化协议，用于自组装重组I型胶原纤维中的胶原蛋白矿化

Summary

本文介绍了一种方案，利用多色3D-STORM技术区分重组胶原纤维中的内矿化与外矿化，结合优化标记、成像和定量共定位分析。

Abstract

该协议描述了一种多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM）方法，用于在重组I型胶原自组装纤维模型中对胶原矿化进行纳米尺度可视化。该方法能够同时成像胶原蛋白、非胶原蛋白（如软骨素硫酸盐）和磷酸钙矿物相。样品制备包括氨基硅化和胶原自组装，随后使用磷酸钙培养基矿化，早期（30分钟）形成非晶磷酸钙（ACP），并在6小时内成熟为羟基磷灰石（HAP）。随后进行多重免疫荧光标记，先通过共聚焦显微镜评估样品，然后使用氧气清除成像缓冲液进行3D-STORM成像采集。数据处理和分析使用公开可用的软件进行。与传统电子或共軛焦显微镜相比，该方案结合了分子特异性与纳米级分辨率（典型侧向精度20–30纳米，轴向50–60纳米），实现了纤维内与纤维外矿化模式的三维可视化。代表性结果显示，胶原网络、相关非胶原蛋白及矿物相在三维空间中清晰可见。结果部分提供了包括皮尔逊相关系数（0.89 ± 0.04）和曼德斯重叠系数（0.91 ± 0.03）在内的定量指标。该方案为生物材料科学、生物矿化和骨组织工程领域的研究人员提供了强大的工具，他们需要对矿化动态进行纳米尺度的洞察。

Introduction

胶原蛋白矿化是一个基本的生物过程，对骨骼和牙齿等硬组织的形成起着^{关键作用。}胶原纤维复杂的结构，加上对矿物沉积的精细调控，赋予这些组织卓越的机械强度和结构完整性².胶原蛋白不仅作为被动支架，更作为主动参与者，通过复杂的分子和物理相互作用协调精确的矿物沉积³.阐明这些机制对于理解骨质疏松和龋齿等病理状况以及开发用于再生疗法的仿生材料^{至关重要。}

硬组织中胶原纤维的直径约为50至100纳米，羟基磷灰石（HAP）颗粒更小（通常厚度为2–5纳米，长度为20–30纳米），并夹在纤维间隙^内。虽然间隙带可以作为成核位点，但在原生组织中，矿物最初形成于纤维间空间，随后扩展为纤维内区室。传统的表征方法包括组织学染色、共聚焦激光扫描显微镜^6、7和电子显微镜^8、9。组织学染色提供宏观评估，但无法评估纳米级矿化状态。共焦点显微镜可观察特定组分，但具有绕射限制（横向约200纳米），无法分辨纤维内矿化与纤维外矿化¹⁰。电子显微镜提供高分辨率，但缺乏分子特异性。虽然免疫金标记可以为电子显微镜提供分子特异性，但其需要专业处理，且不如STORM对多组分进行多重三维可视化，且涉及漫长的实验周期和^{高昂的成本}。

随机光学重建显微镜（STORM）通过高精度定位单个荧光团，实现~20纳米横向分辨率¹²。与其他超分辨率技术如受激发射耗尽（STED）^显微镜和结构照明显微镜（SIM）¹⁴相比，STORM提供了更高的定位精度（横向~20纳米，轴向~50纳米），并且兼容更广泛的有机荧光团。特别是，STED需要专用染料和高激光功率，这可能会损坏生物样本，而SIM仅提供~100纳米分辨率，不足以解析纤维尺度（50–100纳米）特征。STORM 在分辨率、复用能力和采样兼容性之间提供了实用的平衡。已发布的指南描述了标准化测试样本，以促进STORM成像参数的优化和分辨率^评估。结合三维成像能力，3D-STORM实现了多个组件的纳米级^可视化。近期进展将STORM扩展至多色和多路复用成像，使^{同一样本内}的多个靶标能够^可视化。

该方案采用基于自组装重组I型胶原纤维的仿生体外模型，并专门为体外重组I型胶原蛋白自组装纤维模型设计，以在纳米尺度上区分纤维内矿化和纤维外矿化。它不适合活细胞成像，因为STORM需要固定样品和氧气清除缓冲液。此外，未经脱钙或抗原回收，也不适合用于天然高矿化组织（如成熟骨）。如果仅需评估整体矿物密度或大面积形态，传统的共聚焦显微镜或电子显微镜更为高效。

该方案的总体目标是提供一个标准化的、逐步的工作流程，用于使用多色3D-STORM可视化单个胶原纤维内矿物质和非胶原蛋白的纳米尺度分布，特别强调区分纤维内矿化和纤维外矿化。该方案将优化的免疫标记与定制成像缓冲液相结合，实现三维范围内多种有机组分（胶原蛋白、非胶原蛋白）和无机相（ACP、HAP）的同步^追踪。一项关键创新是对纤维内矿化与纤维外矿化模式的定量评估。量化通过两个独立标准实现：（1）使用图像分析软件中的共定位模块计算矿物（钙指示染料，如钙质）与胶原蛋白（远红荧光染料）通道之间的皮尔逊共定位系数（系数>0.8表示强烈关联）;（2）分析矿物信号在单个纤维Z切片中的持续性：如果矿物信号存在于中心切片（距纤维垂直中心0至±120纳米）且强度≥最大值的50%），则被归类为纤维内信号。与传统电子显微镜或共聚焦显微镜不同，该方案结合了分子特异性与纳米级分辨率，实现了纤维内矿化的三维空间分布。

该方案面向生物材料科学、生物矿化和骨组织工程领域需要纳米尺度矿化动力学洞察的研究人员。标准化程序也可以通过相应调整初始样品制备步骤，研究其他矿化胶原系统，如脱矿牙本质切片或基于胶原蛋白的水凝胶。

Protocol

所有涉及生物样本的实验均按照浙江大学医学院核心设施的指导方针和规定进行，并获得机构生物安全委员会批准（批准证书编号）。BSL20235710079）。本文所述的实验方案采用商业采购的试剂和体外仿生系统。它不涉及人体参与者、动物受试者或人体组织样本，因此不需要获得机构审查委员会的伦理批准。

注意：所有涉及危险化学品的操作必须在排风罩内进行，并配戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）。按照机构规定处理化学废物。对于NaN₃，应将废料收集在标有“叠氮化物废物”的专用容器中，且不得与酸混合（存在爆炸性气体风险）。对于戊二醛，处理前应在处理前用10%过量亚硫酸氢钠灭活。对于β尯基乙醇，用漂白剂（1：10 v/v）氧化1小时后再丢弃。

注意：必须在矿化前进行免疫荧光标记，以避免矿物沉积物掩盖表位。对于需要矿化后标记的应用，可能需要抗原提取。

1. 矿化介质的制备

1. 为重组胶原纤维准备矿化介质
   1. 通过滴入100微升5 mg/mL聚天冬氨酸（p-Asp，Mw 9-11 kDa）至5 mL 3.44 mM CaCl₂溶液，置于15 mL锥形管中，制备钙质溶液。
   2. 在管子里混合涡旋30秒，直到均匀。
   3. 缓慢加入对白酸钙并充分混合以稳定非晶磷酸钙（ACP）。
   4. 向钙液溶液中加入5毫升磷酸盐溶液（19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl）。
   5. 漩涡混合1分钟。
      注：混合后最终浓度：1.67 mM CaCl₂，9.5 mM Na₂HPO₄，150 mM NaCl，50 μg/mL对硫。
   6. 使用前请立即准备矿化介质。不要储存;立即使用不稳定的ACP前体以获得一致的结果。
      注意：储存会导致过早结晶。
2. 胶原凝胶/脱矿牙本质矿化介质的制备
   1. 将含钙溶液溶解8.77克NaCl、0.01克NaN₃、6.06克Tris和1.11克CaCl₂，溶于800毫升去离子水中。
   2. 用去离子水将体积调至1升。
   3. 向含钙溶液中加入350 μg/mL聚丙烯酸（PAA，Mw ~1800）。
   4. 漩涡持续1分钟。
      注意：在高钙浓度下，使用PAA代替对应-Asp，以获得更好的稳定性。
   5. 通过将0.85克Na₂HPO₄溶解于1升去离子水中，制备磷酸盐溶液，得到6 mM Na₂HPO₄。
   6. 使用0.22微米膜对磷酸盐溶液进行过滤灭菌。
   7. 将等量（例如各500毫升）的钙和磷酸盐溶液混合，以300转/分钟的磁力搅拌。
   8. 用1M HCl或NaOH，同时用pH计监测，将pH调整到7.4。
      注意：保持pH值为7.4±0.1。避免pH偏差>0.2，避免过早结晶。

2. 重组胶原纤维的制备

1. 玻璃底盘的氨基硅化
   注意：该处理使用（3-氨基丙基）三乙氧硅烷（APTES）将带正电的氨基团（-NH₂）引入玻璃表面，促进带负电的胶原单体静电吸附和稳定。
   1. 在每个玻璃底培养皿（35毫米，#1.5H厚度，0.17毫米±0.005毫米）中加入200微升APTES溶液（绝对乙醇中5% v/v）。
   2. 确保APTES溶液完全覆盖天线表面。
   3. 在室温（20–25°C）下，在黑暗中孵育2小时。
   4. 用绝对乙醇冲洗三次（每次洗2毫升）。
   5. 在去离子水中以40 kHz频率进行超声波处理10分钟。完全去除残留的APTES，以防止非特异性结合。
   6. 硅化餐具可在4°C干燥保存长达一周。
   7. （可选）烘烤以增强稳定性：将洗净和晾干的餐具放入100–120°C的烤箱，烘烤30–60分钟。
   8. 冷却至室温后再继续。
      注意：使用塑料盘时，应将温度降至80°C以下以防止变形。采用Bitter和Muir的硅化^程序。
2. 胶原蛋白自组装与交联
   1. 将100微升胶原蛋白I溶液（50微克/毫升，0.1米醋酸）移液管到每个硅化皿上。
   2. 在湿度箱中以37°C孵育10小时（>相对湿度90%）。保持湿度稳定以防止溶液蒸发。
   3. 通过相差显微镜或共聚焦显微镜验证纤维形成;成功的制备显示出细密的网状纤维网络。
   4. 为了验证超微层面纤维的正确形成，需在相同的自组装条件下（胶原蛋白-I50 μg/mL，37°C，10小时，湿度>90%）在聚乙烯正装/碳涂层TEM网格上准备一个独立样品。
   5. 用1%磷酸（pH 7.0）染色10分钟。
   6. 用去离子水洗。
   7. 在透射电子显微镜下观察。成功的纤维生成通过特征性的67纳米D周期带状图案（见图3）来判断。
   8. 小心地从玻璃底盘中吸取残留胶原蛋白溶液。
   9. 在每个碟中加入2毫升软骨素硫酸盐（CS）溶液（PBS含量50 mg/mL，pH值5.5）。
   10. 在4°C下孵育12小时，以使CS静电吸附于胶原纤维上。
   11. 制备EDC/NHS交联溶液²¹：将0.2 M EDC（1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺）溶解在MES缓冲液（0.1 M MES，pH 5.5）中。
       注意：MES缓冲液可通过将MES游离酸溶解于去离子水中，并用NaOH调节pH至5.5来制备。
   12. 去除CS溶液，加入2毫升EDC/NHS交联溶液。
   13. 在室温下孵育2小时，使CS在胶原蛋白上共价固定。
   14. 用PBS洗碗三次（每次5毫升，每次5分钟），以去除未反应的试剂。
   15. 加工胶原纤维在PBS中以4°C储存，最多24小时后才会形成矿化。

3. 免疫荧光标记（矿化前进行）

1. 样品制备
   1. 用500 mM氯化钠溶液冲洗胶原纤维三次（每次10毫升，每次5分钟）。
   2. 用去离子水洗三次（每次10毫升，每次5分钟）。
   3. 在以50转/分钟旋转的水平振动台上进行洗涤，以确保彻底清洗，同时最大限度减少可能剥落组装纤维的剪切力。
2. 阻断与原抗培养
   1. 在37°C的加湿腔中，与阻断缓冲液（5%牛血清白蛋白PBS）一起孵育1小时。
   2. 制备阻断缓冲液中的抗体鸡尾酒：兔子抗胶原蛋白-I（1：100稀释）和小鼠抗软骨素硫酸盐（1：100稀释）。
   3. 每个样本添加200微升抗体混合物。
   4. 用实验室密封胶覆盖样本。
   5. 在4°C下孵育一夜（12–16小时）。
   6. 用铝箔保护光线。初级抗体培养后，样本可在4°C的PBS中保存长达24小时。
3. 次级抗体染色
   1. 用洗涤缓冲液（0.1% Tween-20 PBS）洗碗三次，每次洗10分钟，去除未结合的一级抗体。
   2. 在阻断缓冲液中制备荧光二级抗体混合物（每35毫米皿200微升），含：山羊抗兔IgG结合于远红荧光染料（1：100）和山羊抗鼠IgM结合于红色荧光染料（1：100）。
      注意：从此步骤开始，保护样品免受光照，防止荧光团发生光漂白。
   3. 在室温（20–25°C）下，在黑暗中孵育1小时。
   4. 用洗涤缓冲液洗碗三次（每次10分钟），以去除未结合的二级抗体。
      注意：在成像前，将标记样本在PBS中保存，温度为4°C（光保护），最多48小时。包含无原级抗体对照以检测自体荧光。

4. 胶原纤维矿化（标记后进行）

1. 矿化过程
   1. 每盘加入2毫升新鲜矿化培养基。
   2. 在37°C下孵育30分钟（短期），以形成早期矿物（ACP）。
   3. 或者，在37°C下长期培养6小时，以实现成熟矿物（HAP）结晶。
      注意：使用校准的孵化器保持37°C±0.5°C的精确温度。
   4. 轻吸矿化介质。
   5. 用去离子水冲洗三次（每次5毫升，间隔1分钟）。
2. 磷酸钙标记
   1. 在PBS中加入4微米钙指示染料（如钙化素），每皿200微升。
   2. 在室温（20–25°C）下，在黑暗中孵育30分钟。
      注意：钙指示剂（如钙素）能结合钙离子，无法区分非晶相和结晶相;相位分配基于矿化时间（30分钟=ACP，6小时=HAP）。应用琥珀色管或铝箔膜保护它免受光照。
   3. 冲洗五次：三次用去离子水洗，两次70%乙醇洗（每次1分钟），交替进行。
3. 成像样品制备
   1. 将样品浸泡在成像缓冲液中：10%（含/v）甘油，PBS中。根据制造商说明，可选添加抗褪入剂。
   2. 施加足够体积（20–50微升）的成像缓冲液覆盖样品。
   3. 在样本上盖上一张封面。
   4. 样品在4°C的黑暗下保存，最长可达72小时。

5. 激光共焦点显微镜下的观察

1. 将样品从4°C储存转移到室温（20–25°C）。
2. 保持10分钟平衡以防止冷凝。
3. 使用琥珀色容器或锡纸包裹保持轻微保护。
4. 确认成像缓冲液覆盖整个样品。
5. 将共聚焦显微镜配置为以下设置：
   1. 胶原成像（远红荧光染料）：647 nm激光，发射滤光片 650-710 nm。
   2. 用于磷酸钙成像（钙指示染料（如钙化素））：488 nm激光，发射滤光片 500-550 nm。
   3. 目标：100×油浸（NA 1.4）。
   4. 针孔直径：1 Airy 单位（AU）。
   5. 像素停留时间：1-2微秒。
      注意： 成像前请进行激光对准和针孔校准。
6. 进行顺序扫描：首次扫描时激发波长为647纳米（胶原蛋白）。
7. 进行第二次扫描，激发波长为488 nm（矿物）。
   注意：按顺序收集通道以避免泄漏。
8. 对于三维重建，将Z堆栈步长设为0.5微米或更小，以确保采样效果充足。
9. 保存存档时保留元数据。
10. 对于共定位分析，请使用能够计算皮尔逊相关系数的图像分析软件（例如，公开可用的软件和合适的插件）。

6. 通过三维随机光学重建显微镜成像（3D-STORM）

1. STORM成像缓冲液²²的制备
   注意：将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入成像缓冲液以拾取氧气，从而减少光漂白并延长荧光团的闪烁时间，这对STORM中单分子定位至关重要。
   1. 制备葡萄糖氧化酶（GOx）库存溶液，剂量为8 mg/mL，置于50 mM醋酸钠缓冲液中（pH 5.1）。
   2. 以160 μg/mL在1× PBS中制备过氧化氢酶存液。
      注意：将酶液料分装，使用液氮或干冰/乙醇浴速冻，保存温度为-20°C或-80°C。 避免反复的冻融循环。
   3. 准备新的STORM成像缓冲液，冰上并保护光线防护。
   4. 按列出的顺序组合以下组分，最终体积为1 mL：无菌无核酸酶H₂O（至1 mL）、1M NaCl（10 μL，10 mM最终）、1 M Tris-HCl pH 8.0（50 μL，50 mM 最终）、新鲜制备的1 M cysteamine（MEA）调整至pH ~7.0（50 μL，50 mM最终）、50%（w/v）葡萄糖（200 μL， 10% w/v 最终期）、GOx存量（200 μL，1.6 mg/mL最终期）、过氧化氢酶存量（200 μL，32 μg/mL最终期）。
   5. 通过移液或倒置轻柔混合。 不要旋转。
      注意：缓冲液必须新鲜制作，并放在冰上并避免光照。准备后30分钟内使用。关于STORM成像条件的详细优化，请参阅已建立的测试样品¹⁵的协议。
   6. 加入200微升新制备的STORM成像缓冲液，完全覆盖样品。
2. 3D-STORM系统配置
   1. 确保成像路径指向电子倍增CCD（EMCCD）相机。
   2. 启动圆柱形镜头模块进行3D成像。
   3. 将软件设置为3D STORM采集模式。
   4. 为所用染料配置光路滤波器。
   5. 打开647纳米激光器，并将功率设为低功率（1-5毫瓦）。
   6. 使用100×油浸物镜（NA ≥1.4），在宽视场或TIRF实时预览模式下定位感兴趣区域。
   7. 获取一张常规的广视场荧光图像以便后续比较。
   8. 切换到TIRF照明模式。
   9. 校准TIRF角度以实现薄的照明场（~100-200纳米），以最小化背景荧光。
   10. 根据初始信号强度调整相机曝光时间（10-30毫秒）。
   11. 根据初始信号强度调整成像激光功率。
   12. 进行简短的测试获取。
   13. 确认参数设置正确，不会导致快速光漂白。
       注意：确保圆柱透镜轴与样品平面精确对齐。大多数现代系统都支持自动校准。手动校准时，使用100纳米荧光珠验证对称圆点扩散函数（PSF）。
   14. 开始时以1–2千瓦^{/厘米功率}的647纳米激光功率进行10–30毫秒的曝光。
   15. 验证闪烁密度为0.1–1分子/微米^²。
   16. 如果密度过低或过高，则相应调整激光功率或曝光时间。
   17. 重复验证和调整，直到达到理想密度。
3. 3D-STORM数据采集
   1. 将采集软件设置为“持续激活”模式。
   2. 将成像激光（647 nm）设置为高功率（100-500 mW光纤输入），以使大多数荧光团转为暗态。
   3. 将激活激光（405 nm）设置为低功耗（0.1–5 mW）。
   4. 经验优化405纳米功率，以在256×256像素区域内每帧保持100–200个局部分子。
   5. 将总帧数设为10,000至20,000帧。
   6. 每个周期使用1帧激活光（405纳米），随后使用5帧成像光（647纳米）。
   7. 开始采购。
   8. 以最大灵敏度操作EMCCD（施加电磁增益）
   9. 每帧曝光时间为10–30毫秒。
   10. 采集过程中，监测活性分子密度。
   11. 调整405纳米激光功率，以保持单分子事件的稳定流。
       注意：原始电影数据可以存储在标准硬盘上，以便长期归档，然后再重建。
4. 胶原矿化数据分析（使用配合STORM模块的图像分析软件）
   1. 在分析软件中，选择相应的相机驱动（STORM模块）。
   2. 点击STORM面板中的 [分析GUI]。 分析窗口打开。
   3. 点击 [文件打开]。选择进行分析的原始显微镜图像文件。点击打开。
   4. 确定有效信号的最小荧光值（最小高度）。
   5. 找到最暗但仍可识别为单分子信号的斑点。
   6. 把鼠标移到中心。
   7. 阅读峰值高度值。
   8. 记录这个数值。
   9. 点击 [识别设置]。在对话框中设置以下参数：最小高度（输入步骤6.4.8中记录的值）、最大高度（20000）、CCD基线（100），对于3D-STORM数据，勾选“3D”（取消勾选2D）。
   10. 点击 >> 以展开更多参数。设置：最小宽度（nm）为200，最大宽度（nm）为700（2D为400），初始拟合宽度（nm）为300，最大轴向比为2.5（2D为1.3），最大位移（像素）为1。
   11. 点击确定关闭对话框。
   12. 进行测试分析以验证参数。取消勾选漂移修正。
   13. 将周期设为1。
   14. 点击 [测试]。
   15. 分析完成后，点击弹窗对话框中的确定。
   16. 检查信号点是否正确标识。背景噪音不应被错误选择。真正的地方绝不能错过。
   17. 如果不满意，重复步骤6.4.9–6.4.16，调整参数直到正确。
   18. 测试分析通过后，进行完整分析。检查漂移修正。
       注意：该分析软件使用冗余交叉相关（RCC）算法进行漂移校正，最大化分子定位时间段间的相关性。无需任何信托珠，²³。
   19. 保持周期 = 1。
   20. 点击 [开始] （或再次点击 [测试] ，然后 [开始]）。
   21. 等分析完成。在弹窗对话框中点击确定。
   22. 分析后，会在与 the.nd2 文件相同的文件夹中生成两个结果文件（.bin 和 .txt）。
   23. 对于共定位分析（647 nm和488 nm通道），应在分析窗口的通道列表中同时显示这两个通道。
   24. 选择一个合适的兴趣领域（ROI）。
   25. 使用共定位模块计算皮尔逊相关系数。如果没有自动提供，请手动将点云数据导出到公开图像分析软件中的共定位插件。记录价值。
   26. 进行Z切片分析以确认纤维内矿化。在主菜单中，选择“视图>Z步进”>切片。
   27. 以60纳米间隔提取单个平面。
   28. 观察矿物信号（绿色，488纳米通道）。检查信号是否停留在中心切片（Z = 0 nm ±120 nm）。持续性证实纤维内矿化。
   29. 可选：进行密度过滤以减少密集发射器产生的过度计数。使用单分子定位分析插件在公开的图像分析软件中打开STORM重建图像²⁴。
   30. 为了减少密集发射体的过度计数，应根据信号密度应用密度滤波（如中位滤波器或局部密度阈值）。
   31. 如果第6.4.18步未启用漂移校正或需要额外修正，则执行漂移校正。根据受托人标记的PSF正确。或者，可以使用交叉相关算法（例如在同一插件中实现的漂移修正）。
   32. 进行频谱解混以消除信道串扰。在STORM分析窗口中，点击“消除串扰工具”（通常位于右下角）。
   33. 将半径设置为25.0纳米（推荐）。选择源信道。选择移除方法：建议采用统计方法。
   34. 要消除激发激光引起的交叉激活，请选择除 NSA 外，选择 Subtrim 以及 > Cross Activation。点击确定。一个新的通道——非特异性激活-Xt，会自动生成。
   35. 使用未染色的对照样本验证自发荧光水平和背景信号。确保所有信号都有明确标识。
   36. 进行三维可视化。在分析窗口中选择一个感兴趣区域（ROI）。
   37. 点击 [3D] 按钮（或 [显示3D]）。生成3D投影或体积渲染。
   38. 右键点击调整渲染参数。导出常见格式的视频（例如.avi或.mp4）。
   39. 要将矿物信号分类为纤维内信号，需执行Z切片分析，如6.4.26–6.4.28所示。导出强度曲线。
   40. 将纤维中心定义为胶原信号最大值的Z平面。
   41. 如果矿物信号在Z=0（中心）和Z±=60纳米处的强度均为该纤维最大矿物强度的≥50%，则称为纤维内信号。如果信号在Z=0时降至30%以下，则归类为纤维外。
   42. 记录每种条件至少50根纤维的分类，以计算纤维内矿化百分比。
       注意：还有其他公开插件可用于密度过滤、漂移校正和频谱解混。

Results

该方案的成功实施使得利用多色3D-STORM实现矿化胶原纤维的高分辨率三维可视化。以下结果展示了典型结果、质量控制和定量评估。

图1 展示了胶原网络的多色3D-STORM重建，该网络矿化于非晶磷酸钙（ACP）。胶原蛋白（用远红色荧光染料标记）呈现为一个清晰的纤维网络。软骨素硫酸盐（GAG，标记为红色染料）与胶原纤维密切相关，合并图像中共定位区域呈青色。值得注意的是，在胶原纤维边界内观察到ACP颗粒（绿色，标记有钙指示染料），显示出纤维内矿化，早期阶段（30分钟）。该图强调了该方案在纳米尺度下同时分辨三种不同成分（胶原蛋白、GAG、矿物）的能力，这一成就在传统共軛焦显微镜中无法实现（见 图5 的成像分辨率对比）。ACP在纤维内的纳米尺度共定位证实了非晶前体可以在晶体转变前渗透纤维内部。

图2 提供了成熟羟基磷灰石（HAP）在矿化6小时后纤维内穿透的定量证据。 图2A 展示了二维STORM图像，显示胶原蛋白（红色）和HAP（绿色）广泛共定位，合并通道呈现黄色。 图2B 是一个三维体积重建，展示了集成架构。图2C 展示了从顶部（Z=−120纳米）到中心（Z=0）及更深切面（Z=+120纳米）60纳米间隔的Z轴切片分析。HAP信号在中心切片（Z = 0至±120 nm≥）中以最大值的50%强度持续存在，符合协议步骤6.4.39–6.4.41中定义的纤维内矿化分类标准。对三个独立实验（n=3个重复，每个实验有5个兴趣区域）的定量共定位分析得出皮尔逊相关系数为0.89±0.04，曼德斯重叠系数为0.91±0.03（平均标准差±SD）。这些数值表明胶原蛋白与HAP在纤维内存在强烈且特异的关联，证实成熟晶相也存在于纤维内。

图3 利用透射电子显微镜验证了自组装胶原支架的结构完整性。用1%磷酸（pH 7.0）染色的胶原纤维表现出典型的67 nm D周期交叉条纹，这可诊断出类原生纤维生成。这一质量控制步骤在进行矿化实验前至关重要，因为它确认支架结构完好且具备支持纤维内矿物沉积的能力。没有这种带状图案，胶原蛋白可能会变性或组装不良，导致人工矿化图案。

图4 展示了矿化条件未被妥善控制时（如缺乏聚天冬氨酸或pH值>7.6）时得到的代表性负结果。在这些次优条件下，HAP沉积（绿色）仅出现在胶原纤维外的玻璃基底（红色），没有纤维内侵入。这一结果是一个重要的控制：它表明 图1 和 图2 中观察到的纤维内矿化并非由于非特异性沉淀或洗刷不完全，而是需要对化学环境（pH 7.4±0.1、聚天冬氨酸的存在以及立即使用新鲜矿化介质）进行精确控制。研究人员应纳入此类负面对照以验证自身系统。

图5 展示了STORM采集前用于初步样本筛查的代表性共聚焦显微镜图像。胶原通道（图5A）显示出清晰的纤维结构网络，HAP通道（图5B）显示与纤维相关的矿物质。合并后的图像（图5C）确认了在衍射极限能级（~200 nm）下的共定位。这些图像有两个目的：（1）在进行耗时的STORM成像前，验证样品质量（充分标记、最小聚集和特定矿物关联）;以及（2）指导3D-STORM采集的兴趣区域选择。值得注意的是，共焦图像缺乏分辨率，无法区分纤维内矿化和纤维外矿化。注意矿物信号沿着纤维连续，但无法显示是内部还是外部。这一限制凸显了这里描述的超分辨率方法的必要性。

图6 展示了两个对照实验。 图6A （无原抗对照）显示仅应用二级抗体时无特异性信号，确认标记样本中观察到的信号并非非特异性二级抗体结合所致。 图6B （未染色对照）显示无荧光信号（完全黑色），排除了样品或底物显著的自发荧光。这些对照对于验证免疫荧光标记的特异性至关重要。这些控制中任何可检测到的信号都表明需要调整阻挡或洗涤步骤。

在优化成像条件下，3D-STORM系统实现了横向20–30纳米和轴向50–60纳米的典型定位精度，符合原始3D-STORM文献²⁵。漂移校正在后处理过程中使用内置冗余交叉相关（RCC）算法完成，该算法消除了对外生基分标记²³的需求。相位分配时，ACP在矿化30分钟时被分配，HAP在6小时时，基于已建立的成熟动力学。能够在时间上区分这两种相，结合纳米尺度定位，使研究人员能够研究纤维内矿物转变的动态。

总之，代表性结果表明该方案能够通过量化共定位指标和适当的负面对照，在重组胶原模型中区分纤维内矿化和纤维外矿化。该方法对研究生物矿化机制、仿生材料和骨组织工程的研究人员尤为有价值。

补充表1 总结了矿化和STORM成像过程中常见的问题及其可能原因和推荐的解决方案。 请点击这里下载此文件。

图1：矿化胶原纤维的多色3D-STORM重建。 胶原蛋白（红色、远红色荧光染料）和软骨素硫酸盐（GAG、蓝色、红色荧光染料）同时成像。胶原蛋白和GAG的共定位在合并通道中呈现品红色，三者重叠的区域呈现白色。还显示非晶磷酸钙（ACP，绿色，钙指示染料）。ACP在胶原纤维的边界内被观察到，表明其定位在纤维内。比例尺：1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：纤维内羟磷灰石（HAP）矿化的3D-STORM成像。 （A） 胶原蛋白（红色、远红色荧光染料）、HAP（绿色钙指示染料）及合并通道的二维STORM图像。（B）三维体积重建。（C） 60 nm 间隔下的 Z 轴切片分析（Z = −120， −60， 0， +60， +120 nm）。中心切片中持续存在的HAP信号（Z = 0至±120 nm）符合纤维内矿化的分类标准（强度≥最大值的50%）。定量共定位基于此图计算：皮尔逊 r = 0.89 ± 0.04，曼德重叠 = 0.91 ± 0.03。比例杆：0.1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：透射电子显微镜（TEM）验证自组装胶原纤维。 胶原纤维被1%磷酸（pH 7.0）染色。诊断性67 nm D周期交叉条纹图案确认了纤维生成和结构完整性的成功。比例条：200纳米。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：代表性阴性结果：纤维外矿化。 胶原蛋白（红色远红荧光染料）和HAP（绿色钙指示染料）。HAP仅沉积在胶原纤维外的玻璃基底上，无纤维内侵入。将这一次优结果作为负面对照纳入，以展示可能结果的范围。比例尺：0.1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5： 用于初步筛查的代表性共焦图像。 （A）胶原蛋白（红色远红色荧光染料）通道显示出清晰的纤维网络。（B） HAP（绿色钙指示染料）通道显示矿物质关联。（C）合并后的图像显示胶原蛋白和HAP的共定位。比例条=2微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：对照实验。 （A）无一级抗对照：仅施用二级抗体;没有特定信号。（b）未染色对照组：未应用荧光团或抗体;没有荧光信号（完全黑色）。比例条=1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：故障排除指南。 矿化和3D-STORM采集/分析过程中常见问题及其可能原因和推荐的解决方案。详见文本了解详细步数。请点击这里下载此文件。

Discussion

该协议为利用多色3D-STORM实现胶原矿化纳米级可视化提供了全面的工作流程。若干关键步骤需要特别关注，以确保成功的结果。

首先，样品准备是高质量STORM成像的基础。玻璃底盘的氨基-硅化必须彻底，以确保胶原纤维在后续清洗和标记过程中稳定附着。残留APTES可能导致非特异性结合和高背景，而不完全的硅化可能导致纤维脱落。推荐的超声波步骤（40 kHz下10分钟）有效去除未结合的硅烷，同时保持表面功能化。对于胶原纤维的交联，推荐使用EDC/NHS21以提高特异性。或者可以使用0.1%的戊二醛（在室温下孵育30分钟，然后彻底清洗），但其特异性较低。关键是，我们建议在进行矿化前通过透射电子显微镜（TEM）验证纤维形成的正常情况。如图3所示，具有特征性的67纳米D周期带状图案的存在证实了自组装过程产生了结构完整的、类似原生的胶原纤维²⁶。这一质量控制步骤防止了胶原蛋白支架形成不良或变性后结果的误解。

其次，矿化介质必须以精确的pH控制（7.4 ± 0.1）制备并立即使用。非晶磷酸钙（ACP）前体对pH和离子强度高度敏感;微小偏差可能导致过早结晶。因此，矿化介质必须在制备后立即使用。对于需要跨多个时间点比较的研究，应为每个实验准备新鲜培养基，而非使用储存溶液。当矿化条件未得到妥善控制（例如聚天冬氨酸不足或pH值不正确）时，纤维外矿化占主导，如图4所示。在该阴性对照中，HAP仅沉积在胶原纤维外的玻璃基底上，没有纤维内侵入。包含此类阴性结果对于验证 图1和 图2 中观察到的纤维内信号确实是受控的纤维内矿化，而非非特异性沉淀或洗涤不完全所致的关键。此外，以往研究强调，区分纤维内矿化和纤维外矿化需要对局部化学环境的严格控制以及如聚天冬氨酸²⁷号等稳定添加剂的存在。

第三，免疫荧光标记需要精心优化。抗体浓度（1：100）适合上述胶原蛋白和软骨素硫酸盐系统，但不同抗体或样本类型可能需要滴定。始终包含无原抗对照以评估自发荧光和非特异性结合。从次级抗体开始，严格的光防护对于防止荧光团光漂白至关重要。

第四，STORM成像缓冲液必须新鲜制备并于30分钟内使用。氧气清除系统（葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶）随着时间推移活性减弱，而半蒸气素既对光敏感又对氧敏感。预先分价酶库并储存在-80°C下，确保实验间性能一致。闪烁密度应实时监测，并通过调制405纳米激光功率进行调整;分子过少会延长采集时间，而分子过多则会导致PSF重叠并降低定位精度。关于STORM成像参数的详细优化，我们建议读者参考已建立的测试样品协议¹⁵。

第五，数据处理需要标准化参数以实现样本间的有意义比较。最小光子计数阈值（通常为500-1000光子）排除了低置信度定位。如果采样信号较弱，可以适当降低到300光子，但不建议低于200光子。使用依据标记或交叉相关算法进行漂移校正对于保持分辨率至关重要，尤其是在三维^重建中。频谱解混有助于消除信道间的串扰，这对于准确的共定位分析至关重要。常见问题排查见补充表1。

该协议存在若干限制。它针对仿生体外模型进行了优化;应用于天然高矿化组织（如成熟骨骼）可能需要额外步骤，如脱钙或更积极的抗原回收，这可能影响超微结构。依赖特定抗体可能导致标记密度问题或立体障碍，尤其是在密集结构中。该技术设备密集型，需要配备配备相应激光线的高端STORM显微镜和EMCCD相机。此外，从样品准备到数据分析所需的总时间（~53小时）可能限制某些应用的吞吐量。

尽管存在这些局限性，该协议相较于其他方法具有显著优势。与电子显微镜相比，它通过免疫荧光标记实现分子特异性，使得同时可视化多种有机和无机组分成为可能。与共聚焦显微镜相比，它实现了空间分辨率高出约10倍，从而能够区分纤维内和纤维外矿化模式。三维能力提供了理解胶原蛋白基质矿物质分布的关键体积信息。

该方法在生物矿化研究中具有广泛的应用价值。潜在应用包括研究非胶原蛋白在矿物成核中的作用、评估仿生材料用于骨骼再生、研究骨质疏松和龋齿等疾病的病理性矿化，以及评估治疗干预对矿物质分布的影响。经过适当修改，该方案可调整用于研究组织或生物材料中的其他有机-无机界面。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
聚天冬氨酸（对-Asp）	西格玛-奥尔德里奇	P9903	非晶磷酸钙的稳定剂
氯化钙（CaCl2）	西格玛-奥尔德里奇	C1016	钙源
磷酸钠二基（Na2HPO4）	西格玛-奥尔德里奇	S0876	磷酸盐来源
氯化钠（NaCl）	西格玛-奥尔德里奇	S9888	离子强度调节器
聚丙烯酸（PAA）	西格玛-奥尔德里奇	323667	高浓度钙的稳定剂
三角基底	西格玛-奥尔德里奇	T1503	缓冲分量
叠氮化钠（NaN3）	西格玛-奥尔德里奇	2002年季	抗菌剂
（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）	西格玛-奥尔德里奇	440140	玻璃表面功能化剂
绝对乙醇	西格玛-奥尔德里奇	459836	溶剂
I型胶原蛋白溶液（50 & mu;0.1 M醋酸中的克/毫升）	科宁	354249	自组装脚手架
软骨素硫酸盐（CS）	西格玛-奥尔德里奇	C9819	非胶原蛋白拟态
EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）卡硼二亚胺）	西格玛-奥尔德里奇	E7750	交联剂
NHS（N-羟琥珀酰胺）	西格玛-奥尔德里奇	130672	交联剂激活剂
MES游离酸	西格玛-奥尔德里奇	M5287	交联缓冲
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	吉布科	10010023	洗涤与稀释缓冲
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛-奥尔德里奇	A3059	阻断剂
兔子抗胶原蛋白I抗体	阿布卡姆	AB34710	胶原蛋白的一级抗体
小鼠抗软骨素硫酸盐抗体	西格玛-奥尔德里奇	C8035	CS的一级抗体
山羊抗兔IgG结合远红荧光染料（Alexa Fluor 647）	赛莫飞世尔科学	A-21244	胶原蛋白的二级抗体
山羊抗小鼠IgM与红色荧光染料结合（Alexa Fluor 568）	赛莫飞世尔科学	A-11031	CS的二级抗体
钙化素（钙指示染料）	西格玛-奥尔德里奇	C0875	磷酸钙标签
Tween-20	西格玛-奥尔德里奇	P1379	清洗缓冲剂用的洗涤剂
甘油	西格玛-奥尔德里奇	G5516	成像缓冲组件
葡萄糖氧化酶（GOx）	西格玛-奥尔德里奇	G7141	氧气拾荒者
过氧化氢酶	西格玛-奥尔德里奇	约1345年	氧气拾荒者
半蒸气（MEA）	西格玛-奥尔德里奇	M6500	硫醇用于荧光团闪烁
D-葡萄糖	西格玛-奥尔德里奇	G6152	葡萄糖氧化酶的底物
醋酸钠	西格玛-奥尔德里奇	S2889	GOx库存缓冲
盐酸（HCl）	西格玛-奥尔德里奇	320331	pH调节
氢氧化钠（NaOH）	西格玛-奥尔德里奇	71690	pH调节
磷酸	西格玛-奥尔德里奇	P4006	TEM的负染色
玻璃底培养皿（35毫米，#1.5H）	MatTek	P35G-1.5-14-C	样品基底;厚度：0.17毫米
超声波清洗机（40 kHz）	布兰森	B200	清洁装置
湿度室	赛莫飞世尔科学	11-432-10	对于胶原蛋白自组装
透射电子显微镜	日立	HT7800	透射电子显微成像
Formvar/碳涂层透射电子显微成像网格（200网目）	西格玛-奥尔德里奇	FCF200-Cu	TEM采样支持
水平振动台	实验室网	S2030-RC	温和洗涤
共焦激光扫描显微镜	尼康	A1	初步放映
3D-STORM显微镜系统（配备405/488/647纳米激光，圆柱形透镜，EMCCD）	尼康	N-风暴	超分辨率成像
1000次;油浸目标（NA 1.49）	尼康	MRD01991	高分辨率成像
pH计	梅特勒·托莱多	五围F2	pH控制
STORM 采集与分析软件	尼康	NIS-Elements（STORM模块）	STORM数据采集与处理
.nd2 文件格式（原始显微镜图像文件）	尼康	无	由尼康显微镜生成的原始图像文件格式。
公开的图像分析软件	开源	无	例如，ImageJ 搭配 ThunderSTORM 插件进行单分子定位分析（共定位、漂移修正）
副胶片	贝米斯	PM996	培养过程中的样本覆盖
铝箔	任何实验室供应商	无	用于光防护（例如包裹样本）
琥珀微离心管	费舍尔科学	05-669-21	用于荧光团的光保护
Coverslips（1.5号）	科宁	2855-18	样品安装