本文介绍了一种利用多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM），结合优化的标记、成像及定量共定位分析方法，以区分重组胶原原纤维中纤维内矿化与纤维外矿化过程的实验方案。
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本文介绍了一种利用多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM），结合优化的标记、成像及定量共定位分析方法，以区分重组胶原原纤维中纤维内矿化与纤维外矿化过程的实验方案。
本方案描述了一种多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM）方法，用于在重组I型胶原自组装纤维模型中对胶原矿化进行纳米尺度的可视化观察。该方法可同时成像胶原、非胶原蛋白（例如硫酸软骨素）以及磷酸钙矿化相。样品制备包括氨基硅烷化和胶原自组装，随后使用磷酸钙培养基进行矿化，该培养基在早期（30分钟）形成无定形磷酸钙（ACP），并在6小时后成熟为羟基磷灰石（HAP）。接着进行多重免疫荧光标记，样品首先通过共聚焦显微镜进行评估，然后在含氧清除成像缓冲液的条件下进行3D-STORM图像采集。数据处理与分析采用公开可用的软件完成。与传统的电子显微镜或共聚焦显微镜相比，本方案结合了分子特异性和纳米级分辨率（典型横向定位精度为20–30 nm，轴向为50–60 nm），可实现对纤维内与纤维外矿化模式的三维可视化。代表性结果展示了在三维空间中胶原网络、相关非胶原蛋白及矿化相的清晰成像。结果部分提供了包括Pearson相关系数（0.89 ± 0.04）和Manders重叠系数（0.91 ± 0.03）在内的定量指标。本方案为生物材料科学、生物矿化及骨组织工程领域的研究人员提供了强有力的工具，可用于深入探究矿化动态过程的纳米级特征。
胶原矿化是一种在骨和牙等硬组织形成过程中起关键作用的基本生物学过程1。胶原纤维的复杂结构与矿化沉积的精细调控相结合，赋予这些组织卓越的机械强度和结构完整性2。胶原不仅作为被动的支架，更作为主动参与者，通过复杂的分子和物理相互作用调控精确的矿化沉积3。阐明这些机制对于理解骨质疏松症和龋齿等病理状态，以及开发用于再生治疗的仿生材料至关重要4。
硬组织中胶原纤维的直径约为50至100 nm，而羟基磷灰石（HAP）颗粒更小（厚度通常为2–5 nm，长度为20–30 nm），并嵌插在纤维间隙中5。虽然间隙区可作为成核位点，但在天然组织中，矿物质最初在纤维间区域形成，随后扩展至纤维内区域。传统的表征方法包括组织学染色、共聚焦激光扫描显微镜6,7和电子显微镜8,9。组织学染色可提供宏观评估，但无法评价纳米尺度的矿化状态。共聚焦显微镜能够观察特定组分，但受衍射极限限制（横向分辨率约200 nm），无法分辨纤维内与纤维外矿化<....
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所有涉及生物样本的实验均遵循浙江大学医学院核心设施的指南和规定，并已获得机构生物安全委员会的批准（批准证书编号：BSL20235710079）。本文所述实验方案使用商业来源的试剂和体外仿生系统，不涉及人类受试者、动物实验或人体组织样本，因此无需机构审查委员会的伦理审批。
警告：所有涉及危险化学品的操作必须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）。化学废弃物应根据机构规定进行处理。对于 NaN₃，需将废液收集至标有“叠氮化物废液”的专用容器中，切勿与酸混合（有产生爆炸性气体的风险）。对于戊二醛，废弃前需用过量 10% 的亚硫酸氢钠进行失活处理。对于 β-巯基乙醇，废弃前需用漂白剂（体积比 1:10）氧化 1 小时，方可排入下水道。
注意：免疫荧光标记必须在矿化之前进行，以避免矿物质沉积遮蔽抗原表位。对于需要在矿化后进行标记的应用，可能需要进行抗原修复。
1. 矿化培养基的制备
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成功实施本方案可利用多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM）实现矿化胶原原纤维的高分辨率三维可视化。以下结果展示了典型的实验结果、质量控制及定量评估。
图1展示了非晶磷酸钙（ACP）矿化的胶原网络的多色三维STORM重建图像。胶原蛋白（用远红荧光染料标记）呈现出结构清晰的纤维网络。硫酸软骨素（GAG，用红色染料标记）与胶原纤维紧密关联，共定位区域在合并图像中显示为青色。重要的是，在胶原纤维边界内观察到ACP颗粒（绿色，用钙离子指示染料标记），表明在早期阶段（30分钟）即发生纤维内矿化。该图突出了本方案能够在纳米尺度上同时分辨三种不同组分（胶原蛋白、GAG、矿物）的能力，这是传统共聚焦显微镜无法实现的（参见图5以对比成像分辨率）。ACP在纤维内的纳米级共定位证实，非晶前体可在结晶转化之前渗入纤维内部。
图2提供了矿化6小时后成熟羟基磷灰石（HAP.......
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本方案提供了利用多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM）对胶原矿化进行纳米尺度可视化观测的完整工作流程。其中多个关键步骤需要特别注意，以确保获得成功的结果。
首先，样品制备是获得高质量STORM成像的基础。玻璃底培养皿的氨基硅烷化处理必须充分，以确保胶原原纤维在后续的洗涤和标记步骤中稳定附着。残留的APTES可能导致非特异性结合和高背景信号，而硅烷化不完全则可能引起原纤维脱落。建议采用超声处理（40 kHz下10分钟），可有效去除未结合的硅烷试剂，同时保留表面功能化。对于胶原纤维的交联，推荐使用EDC/NHS21，因其具有高特异性。也可选用0.1%戊二醛（室温孵育30分钟，然后充分洗涤），但其特异性较低。关键的是，我们建议在进行矿化前，通过透射电子显微镜（TEM）验证原纤维是否正确形成。如图3所示，特征性的67 nm D周期性条带模式的存在，表明自组装过程已产生结构完整、类似天然的胶原原纤维26。这一质量控制步骤可避免因胶.......
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作者声明不存在任何竞争性的经济或非经济利益。在准备本稿件过程中，作者使用了大语言模型以辅助语言润色和格式整理。
作者感谢浙江大学医学院公共技术平台提供的技术支持，并感谢何慧慧和张思思提供胶原蛋白样品。同时感谢邵长宇教授提供的技术指导。本研究受到浙江省自然科学基金（LZ25H060002）、浙江大学实验技术项目（SYBJS202321）、浙江省教育厅（Y202351321）以及农业农村部动物病毒学重点实验室开放研究项目（202201）的资助。所有作者均已审阅并同意本论文的最终版本。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚天冬氨酸 (p-Asp) | Sigma-Aldrich | P9903 | 无定形磷酸钙稳定剂 |
| 氯化钙 (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | 钙源 |
| 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 磷酸盐来源 |
| 氯化钠 (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 离子强度调节剂 |
| 聚丙烯酸 (PAA) | Sigma-Aldrich | 323667 | 高浓度钙稳定剂 |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | 缓冲液组分 |
| 叠氮化钠 (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | 抗菌剂 |
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | 玻璃表面功能化试剂 |
| 无水乙醇 | Sigma-Aldrich | 459836 | 溶剂 |
| I 型胶原蛋白溶液 (0.1 M 乙酸中 50 μg/mL) | Corning | 354249 | 自组装支架 |
| 硫酸软骨素 (CS) | Sigma-Aldrich | C9819 | 非胶原蛋白模拟物 |
| EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺) | Sigma-Aldrich | E7750 | 交联剂 |
| NHS (N-羟基琥珀酰亚胺) | Sigma-Aldrich | 130672 | 交联活化剂 |
| MES 自由酸 | Sigma-Aldrich | M5287 | 交联缓冲液 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco | 10010023 | 洗涤与稀释缓冲液 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059 | 封闭剂 |
| 兔抗 I 型胶原抗体 | Abcam | ab34710 | 胶原蛋白一抗 |
| 鼠抗硫酸软骨素抗体 | Sigma-Aldrich | C8035 | CS 一抗 |
| 偶联远红荧光染料 (Alexa Fluor 647) 的山羊抗兔 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 胶原蛋白二抗 |
| 偶联红色荧光染料 (Alexa Fluor 568) 的山羊抗小鼠 IgM | Thermo Fisher Scientific | A-11031 | CS 二抗 |
| 钙黄绿素 (钙离子指示染料) | Sigma-Aldrich | C0875 | 磷酸钙标记物 |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 洗涤缓冲液用去垢剂 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | 成像缓冲液组分 |
| 葡萄糖氧化酶 (GOx) | Sigma-Aldrich | G7141 | 除氧剂 |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C1345 | 除氧剂 |
| 半胱胺 (MEA) | Sigma-Aldrich | M6500 | 荧光团闪烁用巯基化合物 |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G6152 | 葡萄糖氧化酶底物 |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | GOx 储液缓冲液 |
| 盐酸 (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | pH 调节 |
| 氢氧化钠 (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71690 | pH 调节 |
| 磷钨酸 | Sigma-Aldrich | P4006 | 透射电镜负染剂 |
| 玻璃底培养皿 (35 mm, #1.5H) | MatTek | P35G-1.5-14-C | 样品基底；厚度 0.17 mm |
| 超声波清洗机 (40 kHz) | Branson | B200 | 清洗设备 |
| 湿室 | Thermo Fisher Scientific | 11-432-10 | 用于胶原蛋白自组装 |
| 透射电子显微镜 | Hitachi | HT7800 | TEM 成像 |
| Formvar/碳支持膜 TEM 铜网 (200 目) | Sigma-Aldrich | FCF200-Cu | TEM 样品支撑 |
| 水平摇床平台 | Labnet | S2030-RC | 轻柔洗涤 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | A1 | 初步筛选 |
| 三维STORM显微镜系统 (配备 405/488/647 nm 激光器、柱面透镜、EMCCD) | Nikon | N-STORM | 超分辨率成像 |
| 100× 油浸物镜 (NA 1.49) | Nikon | MRD01991 | 高分辨率成像 |
| pH 计 | Mettler Toledo | FiveGo F2 | pH 控制 |
| STORM 采集与分析软件 | Nikon | NIS-Elements (STORM 模块) | STORM 数据采集与处理 |
| .nd2 文件格式 (原始显微图像文件) | Nikon | N/A | 尼康显微镜生成的原始图像文件格式。 |
| 公开可用的图像分析软件 | 开源 | N/A | 例如，ImageJ 配合 ThunderSTORM 插件用于单分子定位分析（共定位、漂移校正） |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | PM996 | 孵育过程中样品覆盖 |
| 铝箔 | 任意实验室供应商 | N/A | 用于避光（例如包裹样品） |
| 棕色微量离心管 | Fisher Scientific | 05-669-21 | 保护荧光染料免受光照 |
| 盖玻片 (No. 1.5) | Corning | 2855-18 | 样品封片 |
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