FFPE小鼠样本中发育中的颅面组织多重荧光mRNA 原位 杂交

摘要

传统的 原位 杂交难以在颅面组织中可视化mRNA，原因在于结构复杂、背景高、探针特异性有限且灵敏度有限。该方案描述了一种多重荧光RNA原 位 杂交方法，能够在FFPE小鼠胚胎颅面组织中灵敏且特异地检测多个mRNA靶点，克服了之前的局限。

摘要

颅面发育依赖于多样且专门化的细胞群体的协调活动，这些细胞群在复杂的组织结构中相互作用，形成并维持正常的组织结构和功能。理解这些细胞如何相互通信以及与其局部微环境的相互作用，对于定义调控其形成和稳态的分子机制至关重要。这些过程的紊乱可能导致先天性颅面疾病，包括牙齿发育不全、腭裂和唇裂，无论是单独还是作为综合征性疾病的一部分。虽然像RT-PCR这样的定量技术具有高灵敏度和动态范围，但它们需要从均质化组织中提取RNA，导致空间和细胞上下文的丧失，这对于异质颅面组织尤其关键，因为转录本的细胞起源无法确定。多重荧光RNA原 位 杂交克服了这一局限，使得在保持组织结构的同时，能够灵敏且特异地检测多个mRNA转录本。这一先进方法能够精确定位细胞层面的基因表达，为脑面生物学中发育过程和疾病机制的空间调控提供了宝贵见解。

引言

实时聚合酶链式反应（RT-PCR）因其高灵敏度和宽动态范围，是基因表达分析的黄金标准;但需要从均质组织中提取RNA，导致空间和细胞上下文的丧失¹。这一限制对胚胎发育期间的异质组织尤为棘手，尤其是颅面组织，无法确定检测到的转录本的细胞来源。RNA原位杂交（ISH）技术由Joseph Gall和Mary Lou Pardue于1968年开创，克服了这一局限，使mRNA能够在完整组织结构中定位表达。尽管如此，传统的RNA ISH在技术上要求严格，且高度依赖于最佳组织固定和样本准备以保持RNA^完整性。这些挑战在高度钙化的组织中尤为严重，这些组织需要脱钙过程，通常涉及强烈化学品或长时间处理，导致RNA降解。因此，颅面组织中的RNA ISH由多种细胞类型复杂组成，需要细致优化和技术专长，耗时且存在染色不佳的风险。在具有高度复杂结构和组成的牙科组织中，mRNA表达的可视化挑战尤为明显。牙齿由釉质、牙本质、牙骨质及周围骨骼等矿化成分组成，同时还有较软的组织，如牙髓和牙周韧带。这些组织中包含了多种细胞类型，这些细胞在^{牙齿发育中}扮演着关键角色。这些特征需要严格的标准化，以确保信号检测的可靠性。因此，该方案特别适合研究牙齿形成发育和出生后阶段的基因表达。

基于多重荧光原位杂交（FISH）的空间RNA检测技术存在，包括探针扩增的RNA^FISH 5,6,7,8,9、杂交链式反应FISH 6、单分子RNA FISH ¹⁰、交换反应信号扩增FISH 5，以及高度多重的FISH平台如MERFISH¹¹和seqFISH¹²，¹³. 其中，多重荧光RNA ISH ^7,8,9因其在检测单一RNA分子时的高灵敏度而被广泛使用，该设计采用双Z探针设计，该设计中必须两个相邻探针杂交到目标序列以启动信号放大。这种双重识别设计大大提高了特异性并减少了偏靶信号。该方法支持多重检测2至4个靶点（通过类似技术可扩展至12个或更多靶点），保持组织形态，并兼容福马林固定石蜡嵌入（FFPE）^7,8,9、新鲜冷冻及部分钙化组织，适用于颅面和牙科发育中遇到的复杂样本。该方法标准化、可重复性强，配备成熟的探针文库支持，并经过广泛验证，确保结果在多个实验室中可访问且可靠。

多重荧光RNA ISH采用多个探针，靶向同一转录本的不同区域，结合增强的信号放大，使即使是低丰度或部分降解的mRNA也能实现高度灵敏和特异性检测（^14,15）。多重荧光RNA ISH已成功应用于脱钙骨样本¹⁶，且其在复杂颅面组织中的应用报道已^7,8,9;然而，尚未有详细的逐步协议描述其在该语境中的应用。

颅面结构由复杂的组织结构组成，包含多种细胞类型，包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、釉质母细胞、成形细胞、干细胞、免疫细胞、血管和感觉神经元，这些空间协调的相互作用对组织形成、功能、再生和免疫保护至关重要⁴.因此，研究这些组织中的局部基因表达至关重要，而多重荧光RNA ISH代表了此类分析的领先方法。

本研究介绍了基于RNAscope探针和技术的多重荧光RNA ISH如何应用于研究复杂的颅面组织（见图1）。此外，我们建立了优化的FFPE切片工作流程，保持RNA完整性，并支持高质量、空间分辨的基因表达分析。

方案

所有动物操作均经美国国立卫生研究院、国家儿童健康与人类发展研究院动物护理与使用委员会（IACUC）根据动物研究协议#24-031批准。

1. 定时交配与胚胎组织采集

1. 设定定时交配。
   1. 下午晚些时候配对一只健康、有生育能力的雄性和雌性肌肉鼠。第二天早上，检查是否有阴道塞。将观察到插头的日期定为胚胎日（E）0.5。
2. 安乐死怀孕的雌鼠。
   1. 在预期发育阶段，根据机构动物护理指南，通过吸入二氧化碳后进行宫颈脱位安乐死。
   2. 将老鼠仰卧放在无菌吸收表面上。在预定切口处用70%乙醇消毒腹部区域。
3. 暴露并隔离子宫角。
   1. 用无菌手术剪刀在腹部中线切口，然后用显微手术剪刀打开腹膜壁，露出子宫角。
   2. 用钝钳轻轻地将子宫链从外面切除。沿着子宫肌组释放组织，切断输卵管和子宫正中角附着处，以分离胚胎。
4. 移植整个胚胎。
   1. 立即将含有胚胎的子宫链转移到一个10厘米的培养皿，内含冰冷无菌的1× PBS（pH值7.4）。
5. 解剖单个胚胎。
   1. 小心地将每个胚胎与周围的子宫、羊膜和绒毛膜分离。
   2. 将清洗后的胚胎转移到一个新鲜的10厘米盘中，内含冰冷无菌PBS。
6. 解剖小鼠胚胎头部。
   1. 使用无菌手术刀片解剖头部，并在冰冷PBS中冲洗一次，然后进行进一步处理。
      注意：按照动物实验方案，在预期发育阶段采集并解剖新生小鼠。

2. 组织固定与处理

1. 修复组织。
   1. 立即将解剖组织浸泡在10%中性缓冲福马林中，并在室温下用摇床固定一夜。
      注意：RNA的正确保存对于原 位 杂交分析的成功至关重要。大量研究表明，标准方法——将组织样本固定在10%中性缓冲福尔马林中，持续时间从6小时到48小时不等，具体取决于组织的具体大小和年龄——能产生可靠的RNA保存结果，^{16、17、18、19}。对于早期胚胎阶段（E12.5及以下），固定剂的渗透速度较快，应相应缩短固定时间以防止过度固定。从胚胎第17.5天（E17.5）起及出生后样本，由于头部皮肤存在，固定剂的渗透效率可能降低，皮肤起到物理屏障的作用。因此，应将皮肤从整个头部剥离，以便固定溶液高效渗透。脱钙可在含0.5%无甲醇甲醛的0.5 M EDTA（pH值8.0）中进行，温度为4°C⁷。脱钙时间可以通过快速的显微CT扫描监测，并可根据矿化程度和具体组织类型进行调整;对于E18.5胚胎，通常24–48小时就足够。
2. 冲洗并处理组织。
   1. 去除固定液，用PBS冲洗样品。将组织转移到70%乙醇中，并以4°C储存，等待进一步处理（1–4周）²⁰。按照制造商说明，使用自动化组织处理器进行组织脱水、清除和石蜡浸润。
      注意：典型的组织处理方案如下：70%乙醇30分钟，随后95%乙醇30分钟（2次），100%乙醇30分钟（3次）脱水;在二甲苯中清除1小时（3次），随后用石蜡在60°C浸润1小时（3次），然后嵌入石蜡组织块中。
3. 植入组织。
   1. 将头部嵌入石蜡中，并根据实验需求将样品定向于日冕面或矢状面。
   2. 将嵌入的块转移到石蜡块冷板上，让蜡硬化约30分钟，并根据块大小调整时间。
4. 存放FFPE块。
   1. 让石蜡完全凝固。从模具中取出块，放入标有密封的容器或密封袋中，并以4°C保存，直到准备切块。
      注意：含有良好保存RNA的FFPE块可在切片前保存数年，而不影响组织完整性。

3. FFPE组织处理多重荧光RNA ISH

1. 准备一个无RNase的工作区。
   1. 用70%乙醇消毒所有工作表面和器械。用RNase去污溶液处理表面、工具和手套，以减少RNA降解。
   2. 安装切片机并安装新刀片。将离隙角设为10°。使用前用RNase去污溶液处理镊子和刷子。
      注意：切片时务必使用新刀片，以获得精确的组织切片。叶片角度显著影响切面质量、组织完整性、厚度均匀性及形态特征的保存。
2. 准备水浴。
   1. 用超纯实验室级水注满浮选水浴。
   2. 根据胚胎阶段和组织特性，可根据需要调整温度在40–43°C之间。
3. 修剪并安装FFPE模块。
   1. 修剪嵌入组织周围多余的石蜡。把FFPE块冰冷却，然后安装到切片机冷台上。
4. 修剪到感兴趣区域。
   1. 将石蜡块面与切片片对齐，并以12微米的步长修剪，直到冠状切片中出现感兴趣区域（如臼齿或门牙邻近处）。
   2. 根据需要重新定位块和刀片，使整片头部冠状或矢状切面对称且方向正确。
5. 切开组织。
   1. 到达目标区域后，切割5–7微米的切片。将这些部分浮在水浴上，让它们轻柔放松并压平，然后再转移到滑梯上。
6. 安装并晾干各部分。
   1. 将这些部分安装在带正电的玻璃玻片上。用光学显微镜检查载玻片，以确认正确的取向和组织完整性。
   2. 在进行多重荧光RNA ISH测定前，将载玻片置于40°C的载玻片加热器上过夜干燥。

4. 第1天：脱石蜡与补充水分

1. 烤幻灯片。
   1. 用FFPE切片在60°C下烘烤1小时。
      注意：如果未立即使用载玻片，请未在室温（RT）下与干燥剂一起保存1至4周。长期储存可能导致RNA降解。
2. 平衡滑梯。
   1. 让FFPE组织载玻片在室温（RT）下平衡10分钟。
3. 去除石蜡并重新水化这些部位。
   1. 将载玻片浸入二甲苯或二甲苯替代品中，轻轻搅拌5–10分钟，在RT下重复一次以确保石蜡完全去除。
      注意：二甲苯的作业应在化学熏蒸柜内进行。如果使用低毒性二甲苯替代品，可以在化学排气罩外使用。
   2. 将载玻片转移到100%乙醇中，在RT下培养2分钟。重复一次以去除残留的二甲苯。用70%乙醇将切片重新水化2分钟。
   3. 用PBS冲洗三次这些部分。然后滴入一滴PBS，足以完全覆盖各部分，立即进入下一步。

5. 多重荧光RNA ISH在FFPE组织切片上

注：本研究遵循制造商指示，使用RNAscope技术²¹在FFPE组织切片上进行多重荧光RNA ISH检测。

1. 第1天：预处理与探针杂交
   1. 画出疏水屏障。
      1. 用屏障笔在每个组织切片周围画一层疏水屏障。让载玻片在室温（RT）下自然风干约10分钟。
      2. 确保组织切片始终覆盖PBS，以防止干燥。
         注意：使用无绒屑湿巾（镜片湿巾）在保持组织水分的同时，擦干玻片周围的组织。确保屏障笔墨水不会接触到组织切片。
   2. 进行预处理。
      1. 将定制的预处理试剂完全覆盖每个部分。将载玻片在40°C的加湿舱中孵育30分钟，置于杂交炉内。
         注意：对于所有滴管瓶中的试剂，滴入足够多的滴剂以完全覆盖屏障内的切片。确保所有试剂在使用前都送往RT。
   3. 冲洗各个部分。
      1. 用PBS多次冲洗切片，然后在RT中新鲜PBS中培养2分钟。
         注意：使用5毫升转移移液器，分别用PBS清洗每张切片。在2分钟洗涤过程中，确保各部分区域保持PBS完全覆盖。
   4. 抑制内源性过氧化物酶活性。
      1. 在每个切片上涂抹3%过氧化氢，并在RT培养10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。
   5. 重复洗涤。
      1. 用PBS在RT下洗2分钟，重复两次。
   6. 准备探测器。
      1. 将探针预热在40°C下10分钟。使用前请让探头冷却至RT状态。
   7. 准备探针混合物。
      1. C1探针以1×工作溶液的形式提供;直接用这个。
      2. 相比之下，C2、C3和C4探针以50×浓度提供;用C1探针溶液稀释这些探针。如果未使用C1探针，请用制造商提供的探针稀释剂稀释C2、C3和/或C4探头。
   8. 杂交探针。
      1. 每个组织切片涂抹30–40微升探针混合物，确保完全覆盖。将载玻片在40°C的加湿腔室内孵育2小时，置于杂交炉中。
         注意：学习RNAscope技术时，建议在测试运行时同时使用阴性和阳性对照探针。这种方法有助于验证检测结果并确认手术质量。需要注意的一个潜在限制是，一些制造商提供的阳性对照探针可能无法在目标组织中表达。为此，可以使用针对细胞类型的探针。例如， Col1a1 是结缔组织的可靠正对照。对 Col1a1 （或其他已知高表达基因）的染色可以作为评估样本中RNA保存和组织形态的第一步。一旦掌握该技术，通常通过处理载玻片而不使用探针，但使用其他溶液处理来进行负性对照。该方法提供所有检测信道背景信号的关键信息。标准的Multiplex V2套件支持最多四个不同探针的同时染色和成像。当通过先前转录组学研究确定基因表达水平后，建议将表达较低的基因分配到Cy5和Cy7通道。高度表达的基因应置于GFP和RFP通道中，以实现最佳检测。如果探针均未靶向高表达基因，则GFP通道应保持不使用。这使得GFP信道可以作为从RFP信道中背景减法的参考，从而提高低表达目标信号检测的准确性。
   9. 用洗涤液冲洗。
      注意：市售20×洗涤缓冲液在使用前用无RNase水稀释至1×。
      1. 用套装附带的1×洗涤缓冲液在RT上洗2分钟。重复两次。
   10. 在5倍盐水-柠檬酸钠（SSC）缓冲液中孵育。
       注意：市售的20×SSC缓冲液（3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 7.0）在使用前用无RNase水稀释至5×。
       1. 清洗后，在RT的5×SSC缓冲区中孵育切片过夜。
2. 第2天：信号放大、荧光标记与安装
   1. 洗洗幻灯片。
      1. 将载玻片放入1号×室温（RT）下用洗涤液清洗2分钟。重复两次。
   2. 执行放大步骤。
      1. 在每个切片上涂抹扩增1试剂，并在加湿室中以40°C培养30分钟。
      2. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      3. 涂抹扩增2试剂，并在40°C下培养30分钟。
      4. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      5. 施加扩增3试剂，并在40°C下孵育15分钟。
         注意：无论开发哪些通道（探针），这三种放大步骤均为必要。
      6. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
   3. 开发花根过氧化物酶（HRP）和荧光团。
      1. 计算所需的荧光团体积（通常每片100–200微升），并稀释蛋白石荧光团库存。
         注意：荧光团推荐的稀释范围为1：300–1：1500。在这些实验中，Opal Polaris 780（荧光团试剂）在抗体稀释剂中稀释1：500，其他染料则以1：1000稀释在TSA缓冲液中。尽可能减少幻灯片的光照。
      2. 涂上HRP-C1试剂，并在40°C下培养15分钟。
      3. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      4. 每个区块涂抹30–40微升蛋白石染料（如Opal 570或Opal 690）。在40°C下孵育30分钟。
      5. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      6. 涂抹HRP阻断剂，并在40°C下孵育15分钟。
      7. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      8. 涂抹HRP-C2或HRP-C3试剂，并在40°C下培养15分钟。
      9. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      10. 涂入30–40微升第二种蛋白石染料，并在40°C下孵育30分钟。
      11. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      12. 涂抹HRP阻断剂，并在40°C下孵育15分钟。
      13. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      14. 涂抹HRP-C3或HRP-C4试剂，并在40°C下孵育15分钟。
      15. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
   4. 进行酪胺类信号放大-地高西宁（TSA-DIG）和荧光团标记（如适用）。
      1. 每切片施用30–40微升稀释的TSA-DIG试剂，并在RT下培养30分钟。
      2. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      3. 涂抹阻断剂，并在40°C下孵育15分钟。
      4. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
      5. 涂抹30–40微升稀释荧光团试剂，并在40°C下培养30分钟。
      6. 用一次冲洗×用洗涤液在RT下冲洗2分钟。
   5. 进行对应染色和安装。
      1. 施用4′6-二酰胺二苯吲哆酮（DAPI），并在RT中黑暗中孵育5分钟。
      2. 冲洗DAPI，并迅速使用防褪色贴片安装，轻柔地贴上盖片，避免气泡困住。选择与纸巾覆盖面积相匹配的封面尺寸。
      3. 将载玻片在黑暗中用RT干燥2小时，然后保持载玻片在4°C下长期保存。
         注意：如果在4°C的黑暗环境下保存并安装适当的防褪色装置，荧光可保存长达一年。
   6. 进行影像检查。
      1. 使用多通道荧光显微镜进行成像，配备LED照明和滤光片进行光谱分离（见图2A）。激发和发射波长分别为：DAPI（353/465 nm）、FITC波长（495/519 nm）、Cy3（548/561 nm）、Cy5（650/673 nm）和 Cy7（747/773 nm）。特定滤光片可最小化光谱重叠，并区分蓝、绿、橙、红及近红外信号。
      2. 所有图像均采用相同的曝光和照明设置，确保一致性并实现可靠的比较分析。

结果

利用所述方案（图1），我们演示了在蔡司显微镜平台上成像的小鼠全头部多重荧光mRNA ISH转录本检测（图2B）。可以通过侧边标签页（黄色框）选择特定图像视图，同时通过频道标签（红色框）同时可视化多个频道。实时图像的亮度、伽马和对比度可以通过显示标签页（绿色框）下的控制键直接调整，以优化重要特征的可见性。

我们还展示了野生型新生儿头部矢状切片中的转录本可视化，该转录本通过多重基因面板检测出 Sfrp2、 Dspp和 Dkk1 （见图2C）。高倍图像显示下颌门牙及周围骨骼中基因表达的明显模式，凸显每个转录本的精确空间定位。这些结果共同表明，使用上述方法进行多重荧光RNA ISH时，能够准确、高分辨率地绘制发育中的颅面组织中的基因表达。

讨论

原位杂交作为研究基因表达的基础工具已有四十多年，并持续不断完善。然而，传统的ISH方法常受限于灵敏度低、背景信号高以及冗长且劳动密集的操作。这些限制限制了其更广泛的应用，尤其是在复杂的颅面组织中，精确的空间分辨率和低丰度转录本的检测至关重要。多重荧光RNA ISH通过其独特的探针设计和信号放大策略克服了许多这些^挑战，该策略选择性地扩增目标特异性信号，同时最小化非特异性背景3。因此，该方法显著提升了信噪比，并实现了单细胞甚至亚细胞水平的高分辨率转录本定位。

多重荧光RNA ISH是一种高度灵敏且特异性的技术，显著推动了完整组织环境中细胞层面基因表达的空间定性和定量分析。与传统ISH方法不同，多重荧光RNA ISH几乎可以检测任何转录本，包括低丰度mRNA，并且与技术上较为复杂的样本如钙^{化组织兼容}4.尽管有这些优势，但由于牙齿独特的结构和组成特征，包括广泛的矿化和复杂的组织结构，其在牙科组织中的应用仍然具有...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1×PBS	热费舍尔	10010023	使用 在工作流程中进行洗涤
20多次;SSC	热费舍尔	J60839。K2	用来制作1和急性;洗涤缓冲
50 mL锥形管（Ambion）游离RNAse	热费舍尔	AM12502	用于储存不同溶液中的样品
先进轨道震荡器	VWR	6683-470	在孵育期间用于摇晃固定溶液中的组织
酒精，70%，Fisherbrand，HistoPrep	费舍尔科学	HC-1000-1GL	用来清洁和消毒所有工作区
抗体稀释剂	阿古谷生物科学	ARD1001EA	TSA-DIG稀释剂
自动真空组织处理机	徕卡生物系统	ASP300S	用于样品的清除、脱水、补水和蜡浸渍
玻璃罩厚度1.5,25毫米×25毫米及nbsp;	科宁	2850-25	在 Visium HD 工作流程中用于安装幻灯片
定制预处理试剂	ACD，生物科技	300040	以优化组织渗透和靶点可及性
EDTA	米利波尔西格玛	03690	用于脱钙矿化组织
乙醇 100%	航空基地集团	6505001050000	用于去除木胺并在处理过程中重新水化样品
HistoCore水澡	徕卡生物系统	HIS2326	使用浮动40-43度的截面;C 用于去除 FFPE 切片上的皱褶
HybEZ加湿纸	ACD，生物科技	310015	在HybEZ烤箱内使用以保持湿度，防止杂交过程中组织切片干燥
HybEZ 烤箱、托盘和架子	ACD，生物科技	310011, 310012, 310014	用于在杂交和孵化过程中提供温度、湿度和载玻片的正确定位。
ImmEdge 疏水屏障笔	载体实验室	H-4000	用于在载玻片上绘制疏水边界，将试剂限制在染色过程中的组织切片内。
低矮型一次性刀片 DB80LX	徕卡生物系统	14035843496	用于分段FFPE块
中性缓冲福马林 10%	阿泽尔科学	NBF-4-G	用来修复组织
欧泊520试剂包	阿古屋生物科学公司	FP1487001KT	通过荧光标记扩增和检测靶向RNA信号。
欧泊570试剂包	阿古屋生物科学公司	FP1488001KT	通过荧光标记扩增和检测靶向RNA信号。
欧泊620试剂包	阿古屋生物科学公司	FP1495001KT	通过荧光标记扩增和检测靶向RNA信号。
欧泊690试剂包	阿古屋生物科学公司	FP1497001KT	通过荧光标记扩增和检测靶向RNA信号。
Opal Polaris 780试剂包	阿古屋生物科学公司	FP1501001KT	通过荧光标记扩增和检测靶向RNA信号。
延长钻石	热费舍尔	P36970	一种抗衰落安装介质，用于保存荧光信号并在成像过程中保护RNAscope信号
RNAscope 4-plex辅助套件专用界面	ACD，生物科技	323120	RNAscope多复用荧光v2检测中使用的其他材料
RNAscope DAPI	ACD，生物科技	320858	一种用于RNAscope测定的荧光核染色器，用于观察细胞核
RNAscope多重荧光试剂套件v2	ACD，生物科技	323100	进行多复用荧光原位杂交
RNAscope多路复用TSA缓冲区	ACD，生物科技	322810	RNAscope中用于稀释蛋白石染料的缓冲剂
RNAscope 洗涤缓冲试剂	ACD，生物科技	310091	用于在检测过程中清洗载玻片上的组织切片
RNaseZap RNase 去污溶液	热费舍尔	AM9782	用于清洁和去除RNase
半自动旋转切片机	徕卡生物系统	RM2245	请按指南中报告的FFPE区块进行分区。
滑板布赖特	电子显微镜科学	23401-01	用于RNAscope处理前的脱石蜡步骤。
带盖的滑套加热器	首映	XH2004	用于不同温度下的载玻片孵育
超级霜冻加幻灯片及nbsp;	费舍尔科学	12-550-15	用于连接Vsium HD的分段
Surgipath Paraplast（护送伞）	徕卡生物系统	39601006	用于组织浸润和嵌入组织
组织培养皿 100 X 20 MM 500/CS	费舍尔科学	877222	用于采集和解剖1&急性样本;PBS
二甲苯	费舍尔科学	6.81001E+12	用作清除剂，去除酒精并使组织透明