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方法文章

原位 生成 Claudin18.2 特异性 CAR-T 细胞通过脂质纳米颗粒介导的 mRNA 递送

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DOI：

10.3791/71482

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2026年8月14日

 ,  ,  , 
1School of Medicine, Shanghai University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

CAR T细胞在实体瘤中的应用受限于复杂的微环境 离体 制造与安全方面的考虑。本方案描述了一种方法 原位 瞬时CAR-T细胞的制备 通过 LNP介导的CAR编码mRNA递送，提供了一种可重复且适用于其他基于mRNA的免疫细胞工程应用的平台。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已取得显著的临床成功；然而，其更广泛的应用仍受限于高昂的制备成本以及对实体瘤疗效不足。为克服这些挑战，一种 原位 基于脂质纳米颗粒（LNP）介导的靶向Claudin18.2的CAR mRNA递送策略，开发了在肿瘤组织内直接瞬时生成CAR-T细胞的方法。经LNP转染后，活化的T细胞可高效表达表面CAR。这些瞬时性CAR-T细胞对Claudin18.2阳性的胃癌细胞系（包括NUGC4和NCI-N87）表现出强烈的细胞毒活性，并在荷瘤小鼠模型中产生显著的抗肿瘤效果。本方案详细描述了以下操作步骤： 体外 CAR mRNA转录、LNP制剂、T细胞激活与转染、CAR表达分析 体外 和 体内 CAR-T细胞介导的细胞毒性的功能评估。综上所述，该策略提供了一种经济高效且多功能的平台，用于生成瞬时性CAR-T细胞，并为实体瘤的治疗提供了有前景的方法。

引言

全球范围内，癌症的发病率和死亡率正在迅速上升，对人类生存和社会发展构成严重威胁。胃癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，具有很高的发病率1。由于早期诊断率较低，大量患者在确诊时已处于晚期阶段。传统治疗方法包括手术、放疗和化疗。对于中晚期或复杂性胃癌患者，手术切除可能不完全；此外，手术创伤大、术后恢复时间长，可能影响患者的生活质量并导致并发症。放疗和化疗在治疗过程中会对正常组织造成严重损害，产生多种副作用。相比之下，靶向治疗和细胞治疗具有更高的精准性和疗效，已成为现代治疗的重要手段，并代表了未来治疗策略选择的主要趋势。

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法的出现推动细胞治疗实现了里程碑式的突破，在治疗血液系统恶性肿瘤方面展现出强大的疗效2,3CAR-T 疗法利用患者自身的 T 细胞，这些 T 细胞经过基因修饰 体外 通过插入特定的嵌合抗原受体（CAR）实现。该受体可识别肿瘤细胞表面的特异性抗原，并激活T细胞以攻击癌细胞。近年来，针对胃癌的CAR-T疗法研究也取得了进展。治疗靶点的选择尤为关键，因其直接决定了CAR-T细胞的靶向精确性和治疗效果。继HER2之后，Claudin18.2已成为胃癌中另一个重要的治疗靶点，在患者中的表达率为40%至87%。Claudin18.2通常埋藏于胃黏膜内部，当恶性肿瘤....

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方案

所有动物实验均经上海市第十人民医院实验动物伦理委员会批准（批准号：SHDSYY-2025-P0085；批准日期：2025年1月1日）。本研究符合当地法律法规及机构相关要求。实验使用6–8周龄的NSG雌性小鼠。本研究中使用的外周血单个核细胞（PBMCs）来源于商业渠道。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. CAR mRNA 的制备

  1. 线性化DNA模板的制备
    注意：含有CAR序列的质粒使用BspQI限制性内切酶进行线性化。所选的限制性内切酶应在启动子区域右侧将DNA片段插入，并且在插入的DNA片段内部不含有该酶的识别位点。
    1. 加入双蒸水（ddH₂O）2O）、10× 缓冲液、DNA 模板和 BspQI 酶，按指定顺序加入 表1. 37°C 培养 50 °C 2 h后，使酶失活 80 °C 20 分钟。线性化质粒可在 4 °C.
      1. 在无菌微量离心管中设置限制性酶切反应。按指定顺序和体积依次加入重蒸水、限制性内切酶缓冲液、质粒DNA模板和BspQI限制性内切酶 表1.
      2. 用移液器轻轻吹打混匀反应体系，然后在微量离心机中短暂离心。将混合物在指定温度下孵育 50 °C 在热循环仪中孵育2小时，以确保完全消化。通过将混合物在指定....

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结果

靶向Claudin18.2的CAR序列由人源化抗Claudin18.2单克隆抗体的单链可变区片段（scFv）、CD8铰链区、CD28跨膜区、共刺激结构域以及CD3ζ激活结构域组成。基于该序列构建了包含T7启动子和poly A尾的DNA模板，用于 体外 CAR mRNA转录（图1A）。CAR mRNA 长度约为 1800 bp，经毛细管电泳验证（图1B一条具有尖锐峰形且无拖尾的单一条带，以及平直干净的基线，表明mRNA未发生降解。

然后，使用微流控装置制备脂质纳米颗粒（LNPs）。LNPs分散于TBS中，在4 °C下可稳定保存1周。采用定量检测试剂盒检测mRNA的包封效率（图2A），同时测定颗粒大小、zeta电位和多分散系数（PDI）（图2B）。结果显示，LNP的包封效率超过90%，粒径约为150 nm，PDI低于0.2，表明颗粒.......

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讨论

本方案提供了一种非病毒性mRNA递送系统，可避免整合到宿主基因组中，从而规避包括免疫排斥在内的多种风险。其瞬时功能还可防止脱靶毒性，实现CAR-T细胞中短期、可控的表达，以降低副作用和安全风险。

优化CAR mRNA序列设计以调控其翻译效率和表达持续时间。mRNA分子的5'非翻译区（5'UTR）、3'非翻译区（3'UTR）、5'端帽结构（5'-Cap）和多聚腺苷酸尾（poly(A)尾）协同调控mRNA的翻译效率与稳定性12在序列设计中采用了T7启动子，该启动子与T7 RNA聚合酶可形成高度特异且高效的转录系统13，实现大规模 体外 RNA合成。随后加入一个120个碱基对的poly(A)尾14，延长mRNA半衰期并延长蛋白质表达持续时间。同时， 体外 转录在mRNA的5'端添加了5'-帽子结构。5'-帽子相对于3'-poly(A)尾的正确位置和完整性对于确保mRNA的翻译活性和效率至关重要

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致谢

我们感谢上海大学和上海市第十人民医院中心实验室为本研究提供了科研平台。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇Sigma-Aldrich459836有机相
琼脂糖BeyotimeST004L凝胶电泳
anti-G4S linker (B02H1) mAb PE HycellsGS-ARPE100CAR 检测
BspQI 限制性内切酶NEBR0712质粒线性化
BV421 小鼠抗人 CD25BD Biosciences564033活化标志物
CD3/CD28 活化磁珠Thermo Fisher Scientific11161DT 细胞活化
胆固醇Sigma-AldrichC8667结构脂质
CO2 细胞培养箱Thermo Fisher / 等效产品250i用于 T 细胞和肿瘤细胞培养
DMG-PEG2000Avanti Polar Lipids880151聚乙二醇化脂质
DNA 提取磁珠SYNTHGENE10501-005DNA 纯化
DNase I（无 RNase）NEBM0303L去除 DNA 模板
DSPCAvanti Polar Lipids850365磷脂
动态光散射分析仪Malvern Panalytical         Zetasizer    用于 LNP 粒径、PDI、zeta 电位分析 
EasySep 缓冲液STEMCELL Technologies20144磁性分离
胎牛血清（FBS）Gibco10099-141培养补充剂
FITC 小鼠抗人 CD3BD Biosciences555332T 细胞鉴定
流式细胞仪      BD Biosciences / 等效产品FACSCelesta / LSRFortessa 用于 CAR 和活化标志物检测
GelGreen 核酸染料Biotium41005DNA 可视化
LIVE/DEAD 可固定染料InvitrogenL34955活力染色
荧光素酶检测试剂盒PromegaE1500细胞毒性读数
磁性分离架   STEMCELL Technologies / 等效产品18000用于 PBMC 和 T 细胞分离
Nanodrop 分光光度计  Thermo Fisher Scientific  NanoDrop 2000            用于 DNA/RNA 定量     
NSG 雌性小鼠（6–8 周龄）Jackson Laboratory5557体内模型
PBMCs上海赛立生物科技有限公司
PCR 热循环仪Bio-Rad / 等效产品  T100用于 DNA 扩增
PE 小鼠抗人 CD69BD Biosciences557050早期活化
青霉素-链霉素Gibco15140-122抗生素
Qsep 核酸分析仪    BiOptic Inc.  Qsep100      用于 mRNA 大小/完整性分析
Quant-iT RiboGreen RNA 检测试剂盒InvitrogenR11490包封效率
RapidSpheresSTEMCELL Technologies15061磁性标记
重组人 IL-15PeproTech200-15记忆表型支持
重组人 IL-2PeproTech200-02T 细胞扩增
重组人 IL-7PeproTech200-07T 细胞存活
冷冻离心机Eppendorf / 等效产品 5425R用于 LNP 浓缩和细胞处理 
RNA 6000 LadderThermo Fisher ScientificAM7152RNA 表征
RNA 芯片试剂盒（1 个）BiopticC105110RNA 质量控制
RNA 提取磁珠SYNTHGENE10511-005mRNA 纯化
无 RNase 水Thermo Fisher ScientificAM9937体外转录和 RNA 操作
RPMI 1640 GlutaMAXGibco61870-036T 细胞培养
SM-102MedChemExpress / 等效产品HY-112563可电离脂质
T 细胞分离混合液STEMCELL Technologies15061CD3+ T 细胞分离
T7 共转录与加帽试剂盒SYNTHGENE10111-3011体外转录 mRNA 合成
TBS 缓冲液Gibco3005LNP 储存
胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056细胞解离
紫外凝胶成像系统  Syngene / 等效产品  NuGenius/NuGenius+用于 DNA 消化验证

参考文献

  1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394-424.
  2. Saez-Ibañez AR, Upadhaya S, Partridge T, Shah M, Correa D, Campbell J. Landscape of cancer cell therapies: trends and real-world data. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(9):631-632.
  3. Dunbar CE, High KA, Joung JK, Kohn DB, Ozawa K, Sadelain M. Gene therapy comes of age. Science. 2018;359(6372):eaan4672.
  4. Jiang H, Shi Z, Wang P, Li X, Hou W, Zhang H, et al. Claudin18.2-specific chimeric antigen receptor engineered T cells for the treatmen....

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