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利用六甲基二硅氧烷促进扩散结合离子选择性电极法测定小鼠模型血清、骨骼和牙齿中氟化物含量

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DOI：

10.3791/71488

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2026年8月28日

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

本实验方案描述了六甲基二硅氧烷（HMDS）促进扩散皿的制备，随后采用离子选择性电极法测定小鼠血清、骨骼和牙齿中氟离子质量。该方法提供了一种基于校准的高灵敏度检测手段，用于评估氟在生物样本中的蓄积情况。

摘要

定量检测生物组织中的氟化物水平对于理解氟暴露、代谢及毒性至关重要。本方案描述了一种灵敏且可重复的方法，用于测定血清、骨骼和牙齿中氟离子质量，该方法基于六甲基二硅氧烷（HMDS）促进的扩散技术，随后采用离子选择性电极（ISE）进行分析。从接受可控氟处理的小鼠体内采集生物样本，包括血清、股骨和下颌切牙。骨和牙齿样本经灰化、研磨和水合处理，而血清则直接处理。将每份样本转移至含有超纯水的扩散皿中，并用涂有凡士林的盖子密封，盖子内表面附有氢氧化钠液滴，作为氟捕获陷阱。注入HMDS饱和的硫酸以启动氟的释放与扩散，使释放出的氟离子被定量捕获于陷阱中。经过一夜扩散后，收集所有氟陷阱液滴合并为单一样品，调节至所需pH范围，并定容至特定体积用于ISE测定。通过已知氟质量制备的校准扩散皿建立标准曲线以实现定量，同时使用质量控制样本来验证电极稳定性。来自暴露于0或125 ppm氟的青春期和成年小鼠的代表性结果表明，该方法能够检测血清、骨骼和牙齿中氟含量随年龄和剂量变化的差异。本方案提供了一种基于校准的可靠方法，适用于多种生物基质中氟的定量，特别适合在小鼠模型中开展氟暴露、组织沉积及毒理学效应的研究。该方法的一个关键优势在于其能够准确测定极微量样本中的氟含量，例如单个小鼠切牙灰化后仅得3–5 mg灰分，由于扩散过程可将所有释放的氟富集至小于100 µL的可测样液体积中，仍可实现精确测量。

引言

氟化物是一种天然存在的阴离子，适量的氟能有效预防龋齿1,2,3,4,5。在美国，以0.7 ppm的浓度实施社区饮水加氟，作为降低龋齿发病率和促进口腔健康的公共卫生策略6。然而，长期摄入过量氟化物会对多种组织产生不利影响。高氟暴露会破坏釉质形成7,8,9，改变骨形成过程10，并损害骨骼完整性11。

在细胞水平上，氟化物暴露会引起多种代谢紊乱，包括氧化应激12、内质网应激13、改变基因表达的表观遗传学修饰14，以及成釉细胞的凋亡15,16,17,18。全球范围内，地下水中氟化物浓度升高（>1.5 ppm）构成了重要的健康问题。最近一项预测性建模研究估计，全球约有1.8亿人可能受到过量氟化物暴露的影响，其中以亚洲和非洲的负担最重1。除饮用水外，氟化物暴露还可通过食物（如海产品；约1.9 ppm）、饮料（如茶；0.5–6 ppm19）以及牙科产品（如牙膏20，1,000–1,500 ppm）发生。

因此，了解氟化物的暴露、代谢及其在组织中的沉积，对于评估其治疗益处和潜在毒理学后果至关重要。准确量化生物样本（包括尿液、血清、骨骼和牙齿）中的氟化物是此项工作的关键组成部分。然而，由于氟化物的化学性质及其对富含钙基质的强亲和力，其检测在分析上具有挑战性。人体内约99%的氟化物存在于骨和牙等矿化组织中21。为应对这些挑战，已开发出多种分析技术，包括离子选择性电极（ISE）电位法、离子色谱法、比色测定法、滴定法以及基于核反应或活化的方法22。其中，六甲基二硅氧烷（HMDS）辅助扩散技术结合氟离子选择性电极检测，因其高灵敏度、良好重现性以及适用于多种样品类型，已成为生物基质分析中最可靠且应用最广泛的方法之一23,24,25,26,27,28,29。

尽管存在多种分析方法，但每种方法均有其局限性，可能限制其在实验或临床研究中的应用。离子色谱法具有高灵敏度和高选择性，但需要专用仪器和复杂的样品前处理30,31。比色法（如SPADNS法，即2-(对磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基萘-3,6-二磺酸钠法）操作简单且成本低廉，但易受浊度和内源性发色团的干扰，从而限制了其在复杂生物样品中的可靠性22,32,33。滴定法经济且操作简便，但在大多数生物样本中，其灵敏度不足以检测痕量氟离子34。基于核反应或活化的方法虽具有极高的灵敏度，但需要核反应堆或基于加速器的中子源，因此难以在常规实验室中推广应用35。相比之下，HMDS辅助扩散结合离子选择电极（ISE）测定法在灵敏度、成本和可及性之间实现了良好的平衡，同时可确保从软组织和矿化组织中完全释放氟离子。该方法在小动物研究中尤为有利，因为在这些研究中组织样本量有限，而小鼠门齿等矿化结构每颗牙齿仅能提供3–5 mg的灰化物。

扩散-ISE法能够将所有释放的氟化物富集到一个微小且明确的体积中，从而实现对极微量样品的准确定量。这使得该方法非常适用于毒代动力学研究、剂量-反应实验以及跨发育阶段的氟化物代谢研究。小型啮齿类动物，尤其是C57BL/6J小鼠，已被广泛用作研究氟化物效应的动物模型7,9,12,29,36。

在本实验方案中，作者采用HMDS促进扩散法结合氟离子选择性电极测定法，定量分析经高浓度氟（125 ppm）暴露的小鼠血清、骨骼和牙齿中的氟含量，并与未经处理的对照组进行比较。作者进一步比较了青春期（处理开始时为6周龄）与成年期（处理开始时为18周龄）小鼠中氟的蓄积情况，以评估氟代谢及组织沉积的年龄依赖性差异。下颌切牙被选为代表性的牙体组织，因为啮齿类动物的切牙会持续萌出，并在约7周龄时达到萌出与咬合磨损之间的稳态平衡。这种持续生长的特性提供了稳定且易于观察的釉质发育梯度，使得小鼠切牙成为研究釉质形成及氟斑牙的广泛应用且经过充分验证的模型。

方案

本方案中描述的所有操作均按照诺瓦东南大学机构动物护理与使用委员会（IACUC，批准号：2023.02.MSuz1）批准的脊椎动物动物使用指南和规定进行，该委员会由国际实验动物评估和认可协会（AAALAC）认证。所有动物实验均遵守《实验动物护理与使用指南》以及美国兽医医学协会（AVMA）《动物安乐死指南》。本研究中使用的所有材料均列于材料表中。

1. 动物及氟化钠在小鼠模型中的制备与给药

  1. 动物：将雄性 C57BL/6J 小鼠分为两个年龄组：青春期组，即在治疗开始时为6周龄；成年组，即在治疗开始时为18周龄。
    1. 为每组提供不含氟化物的去离子水（0 ppm F）⁻）或添加氟化钠的饮用水（125 ppm F⁻为期6周的暴露。
    2. 每个年龄组和处理条件下包含五只动物（N = 5/组）。
    3. 暴露期结束后，采集血清、股骨和下颌切牙，并对所有收集的样本进行后续分析前的处理。
      ​注意：样本：经处理的材料，如灰化骨、灰化牙和血清。
  2. 动物饲养与饮食：在标准实验室条件下饲养小鼠 随意 食物和水的获取
    1. 在采集牙齿、骨骼和血清样本前一周开始提供无氟饮食，以尽量减少本底氟水平。
  3. 氟化钠饮用水
    1. 为制备含氟饮用水，将氟化钠（NaF）溶于去离子水中，以达到目标氟浓度（例如，125 ppm F）⁻).
    2. 将溶液通过滤器过滤 0.2 µm 真空过滤至已灭菌的瓶子中，每2天配制一次新鲜溶液。
      警告：氟化钠（NaF）若摄入具有毒性，可能引起皮肤和眼睛刺激。应在通风橱中操作，并穿戴实验室外套、丁腈手套和护目镜。
  4. 对于无氟对照水，将去离子水通过滤膜过滤 0.2 µm 使用真空滤器将溶液过滤至已灭菌的瓶子中。每2天更换一次新鲜的水。
  5. 提供含氟补充或无氟的饮用水 随意摄取 根据所需时间进行氟化物处理。每天监测水位，并每2天更换一次瓶子。
  6. 暴露期结束后，使用二氧化碳（CO₂）对动物实施安乐死₂) 吸入麻醉后断头处死。安乐死操作依据美国兽医协会（AVMA）《动物安乐死指南》进行，并作为机构动物照护与使用委员会（IACUC）方案的一部分获得批准。
    注意：CO2 是一种窒息性气体。操作应在通风良好的区域进行，并确保腔室功能正常。避免直接吸入暴露。

2. 氟化物测定的样品制备

  1. 血液采集
    1. 通过吸入 CO₂ 处死小鼠，并立即使用 1 mL 结核菌素注射器经心脏穿刺采集血液。将血液转移至 1.5 mL 微量离心管中。所有使用过的针头和注射器应丢弃至机构批准的锐器废物容器中。
      注意：注射器针头锋利，可能导致刺伤；操作时需小心谨慎。
    2. 将血液在室温下静置 30 分钟，然后以 2,000 × g 离心 10 分钟。
    3. 将上清液（血清）转移至微量离心管中，并于 −80 °C 保存。
      注意：超低温冰箱存在冻伤风险。操作试管时应佩戴隔热手套，避免皮肤长时间接触低温表面。
  2. 骨骼
    1. 股骨提取：处死后，从髋关节处解剖后肢。
    2. 小心去除股骨上的所有软组织。用去离子水清洗组织三次。将骨骼在 -80 °C 保存，直至进一步处理。移除的软组织及任何受污染材料应丢弃至机构的生物废物流中。
      注：组织可用含 2% 蔗糖的 4% 多聚甲醛固定 12–16 小时，随后在 70% 乙醇中长期保存。此固定程序不会影响后续氟含量测定的准确性。
    3. 用去离子水彻底冲洗骨骼。用无绒纸巾吸去多余水分。
    4. 将骨骼转移至带开放管盖的 1.5 mL 微量离心管中以允许蒸发，并置于 60 °C 烘箱中干燥 12–16 小时。
      注意：干燥烘箱可能导致烫伤。操作样品时应使用耐热手套。
    5. 骨骼灰化：将干燥后的骨骼转移至氧化铝坩埚中。将坩埚放入马弗炉，以 150 °C/h 的升温速率加热至 600 °C，保持 6 小时。待炉温降至 200 °C 以下后取出坩埚。任何残留的骨碎片或受污染耗材应丢弃至机构的生物废物流中。
      注意：马弗炉和坩埚温度极高，存在严重烫伤风险。操作前务必确保炉体充分冷却。取出坩埚时，应穿戴实验服、护目镜和耐热手套，并使用长柄镊子，避免直接接触高温表面。
      关键步骤：灰化不完全将影响后续分析。在继续操作前，需确认骨材料已完全氧化；任何残留碳质将干扰后续测量。
      ​注：充分灰化的骨骼应呈均匀浅灰色至白色。较深颗粒（尤其是黑色或类似木炭的残留物）表明燃烧不完全。若存在变色，应延长灰化时间以彻底去除有机物质。
    6. 灰化骨骼的保存：灰化后立即转移骨骼至 1.5 mL 微量离心管中。用 Parafilm 密封管口，并将管子置于真空干燥器中保存，直至使用。
  3. 牙齿
    1. 下颌门齿提取：在颞下颌关节水平处做水平切口，将下颌骨与上颌骨分离。
    2. 进行正中矢状切口，将上颌骨和下颌骨各分为左右两半。
    3. 用去离子水清洗组织三次，并小心取出下颌门齿。将取出的门齿在 -80 °C 保存，直至进一步使用。移除的软组织及任何受污染耗材应丢弃至机构的生物废物流中。
      注意：在颞下颌关节和正中矢状面进行切割时，应小心使用锋利的解剖器械，以防人身伤害。操作时应穿戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。
      注：组织可用含 2% 蔗糖的 4% 多聚甲醛固定 12–16 小时，随后在 70% 乙醇中长期保存。此固定程序不会影响后续氟含量测定的准确性。
    4. 牙齿灰化前处理：用去离子水彻底冲洗牙齿，并将其置于 1% 过氧化氢（H₂O₂）中 12–16 小时。使用后的过氧化氢溶液应作为危险化学废物处理。
    5. 再次用去离子水冲洗，用无绒纸巾短暂吸干，然后转移至带开放管盖的 1.5 mL 微量离心管中。将管子置于 60 °C 烘箱中干燥 12–16 小时。
      注意：过氧化氢为氧化剂，可能引起皮肤和眼睛刺激。应在通风橱中操作，并穿戴实验服、腈类手套和护目镜。避免与可燃物接触。
    6. 牙齿灰化：将干燥后的牙齿转移至氧化铝坩埚中，在马弗炉中以 150 °C/h 的升温速率升至 600 °C 并保持 20 小时进行灰化。
    7. 仅在马弗炉温度降至 200 °C 以下后取出坩埚。
      注意：马弗炉和坩埚温度极高，存在严重烫伤风险。操作前务必确保炉体充分冷却至 200 °C 以下。取出坩埚时，应穿戴实验服、护目镜和耐热手套，并使用长柄镊子，避免直接接触高温表面。
      关键步骤：确保完全氧化；残留碳质将干扰后续分析。
      注：灰化后的牙齿材料应呈均匀浅灰色至白色。若仍有黑色残留物，需重新灰化。
    8. 灰化牙齿样本的保存：灰化后立即转移牙齿至 2 mL 圆底微量离心管中。
    9. 用 Parafilm 密封管口，并将管子置于真空干燥器中保存，直至使用。

3. HMDS 辅助扩散培养皿的制备

  1. 试剂和材料
    1. 6 N 硫酸：在制备扩散皿前至少两天，配制一批 6 N 硫酸储备液。
      注：扩散皿：一种密封容器，用于创建受控的封闭环境，使处理后的生物材料释放的组分可被固定在盖子上的化学捕获剂收集。密封设计可防止与外界空气交换，确保释放的分析物定向进入捕获剂以供后续测定。
    2. 将一个 1 L 塑料烧杯置于磁力搅拌器上，加入磁力搅拌子，并加入 416 mL 超纯水。
    3. 使用 50 mL 移液管，边持续搅拌边缓慢将 84 mL 的 36 N H₂SO₄ 加入水中。溶液将变热；待其冷却至室温。 未使用或废弃的硫酸溶液应作为危险化学品废物，按机构化学废物流程处理。
      注意：硫酸具有强腐蚀性。应在通风橱中操作，并佩戴耐酸手套、实验服和护目镜。若发生接触，立即用大量水冲洗。
    4. HMDS 饱和的 6 N 硫酸：将 6 N 硫酸转移至 2 L 分液漏斗中，加入 15 mL 六甲基二硅氧烷（HMDS）。
    5. 确保塞子和活塞紧密关闭，将分液漏斗侧向持握，剧烈振荡，直至可见微小的 HMDS 液滴。
    6. 打开塞子释放产生的气体，并重复此过程两次。
    7. 将塞子略微打开数小时。将装有 6 N HMDS 饱和硫酸的分液漏斗置于通风橱内的支架上储存。含 HMDS 的硫酸及受污染材料应作为危险化学品废物处理。
      注意：HMDS 易燃，吸入有毒。应在通风橱中操作，并穿戴实验服、手套和护目镜。远离点火源。
    8. 0.05 N 氢氧化钠：将 1 g NaOH 颗粒溶于 25 mL 超纯水中，配制 1 N 储备液。
    9. 取 2 mL 1 N NaOH 储备液与 38 mL 超纯水混合，得到 0.05 N NaOH 溶液。
    10. 将 0.05 N NaOH 分装至 1.5 mL 微量离心管中，每管单次使用，用 Parafilm 封口，并将管子置于真空干燥器中储存，以减少 CO₂ 吸收。未使用或废弃的氢氧化钠溶液应作为危险化学品废物处理。
      注意：氢氧化钠具有强腐蚀性，可导致严重灼伤。穿戴实验服、手套和护目镜。小心操作，避免溅出。
    11. 0.2 N 乙酸：将 575 µL 冰乙酸加入超纯水中，并定容至 50 mL，配制 0.2 N 乙酸。乙酸溶液应作为危险化学品废物处理。
      注意：乙酸具有腐蚀性，可能刺激皮肤、眼睛和呼吸道。应在化学通风橱中操作，并穿戴实验服、手套和护目镜。
    12. 凡士林：在 60 °C 烘箱中熔化约 100 g 凡士林。用 10 mL 注射器吸取液态凡士林，待其冷却固化。凡士林填充的注射器可在室温下储存数周。
    13. 培养皿：使用 60 × 15 mm 未处理的培养皿制备扩散皿。
    14. 用加热的 18 号注射器针头在培养皿盖上熔出一个小孔。
    15. 使用装有钝头 14 G 针头的 10 mL 注射器，在盖子的内缘均匀涂抹凡士林密封圈。所有使用过的针头应弃置于机构批准的锐器废物容器中。
      注意：注射器针头锋利，可能造成刺伤。应小心操作，并弃置于批准的锐器容器中。加热针头时，应佩戴耐热手套和眼部防护装置，以防烫伤。
    16. 用于校准扩散皿的 NaF 储备液。将 4.19 g NaF 溶于 1 L 超纯水中，配制 100 mM 储备液。通过将 100 mM 溶液连续 1:10 稀释，配制 10 mM、100 µM 和 10 µM 储备液。
      注：1 摩尔 NaF 提供 19 g F⁻；因此，1 µL 的 10 µM NaF 含有 0.19 ng F⁻，1 µL 的 10 mM NaF 含有 190 ng F⁻。
      ​注：校准扩散皿：专门用于以已知质量的氟离子（F¯）进行校准的扩散皿。
  2. 特定样本的扩散皿制备
    1. 血清扩散皿：向培养皿底部加入 3 mL 超纯水，再加入 75 µL 血清。将受血清污染的材料弃置于机构的生物废物流中。继续进行步骤 3.4。
    2. 骨扩散皿
      1. 骨灰的粉碎：使用微型刮刀在 1.5 mL 微量离心管内将灰化的骨组织研磨成细粉。立即进行后续处理。将受骨灰污染的耗材弃置于机构的化学废物流中。
      2. 骨灰的称重与水合
        1. 将培养皿的底部置于分析天平的称量盘上，天平读数精度至少为 0.1 mg。
        2. 将 2 mL 微量离心管中的骨灰转移至小瓷皿中，以减少静电并防止粉末扩散。
        3. 使用微型刮刀向培养皿中加入约 5 mg 骨灰，并在将培养皿从天平上取下前立即加入 3 mL 超纯水覆盖粉末，以避免骨灰扩散。
        4. 记录每份骨灰样本的精确重量。继续进行步骤 3.4。
    3. 牙齿扩散皿
      1. 灰化牙齿的研磨
        1. 将灰化的门齿转移至 2 mL 圆底微量离心管中，每管加入一个直径 5 mm 的不锈钢珠。盖紧管盖，并用 Parafilm 封口。
        2. 在珠磨机中以 2,500 rpm 研磨 10 s。立即进行后续处理。
      2. 灰化牙齿的称重与水合
        1. 将管内全部内容物（包括不锈钢珠）倒入置于分析天平称量盘上的扩散皿底部。将受牙灰污染的耗材弃置于机构的化学废物流中。
        2. 从培养皿中取出不锈钢珠，并记录牙灰的精确重量（通常每颗下颌门齿为 3–4 mg）。
        3. 在将培养皿从天平上取下前，立即加入 3 mL 超纯水覆盖牙灰，以防止因静电放电导致的灰分扩散。继续进行步骤 3.4。
  3. 校准与质量控制扩散皿
    1. 与样本扩散皿并行制备两组校准扩散皿（用于 5–6 点校准）和一组相同的质量控制扩散皿（包括空白样）。
      注：质量控制扩散皿：制备方法与校准扩散皿相同，但用于定期验证电极稳定性，确保测量性能一致。
    2. 向 11 或 13 个培养皿中各加入 3 mL 超纯水，并加入 NaF 储备液，使其覆盖样本样品中预期的 F¯ 质量范围。继续进行步骤 3.4 以完成扩散皿的组装37。
  4. 完成扩散皿组装
    1. 为构建氟离子捕获剂，将 50 µL 0.05 N NaOH 分三次滴加至培养皿盖内表面，远离盖缘。
      注：氟离子捕获剂（F¯ 捕获剂）：扩散皿的组成部分，用于捕获 F¯，具体为氢氧化钠（NaOH）。
    2. 将盖子倒置，避免扰动 NaOH 液滴，并用凡士林将其与培养皿底部紧密密封。
    3. 为配制 3 N HMDS 饱和硫酸溶液，将等体积的 6 N HMDS 饱和硫酸与超纯水混合。现用现配，不可储存。
    4. 使用装有 20 G 针头的 10 mL 注射器，将 3 mL 新配制的 3 N HMDS 饱和硫酸通过盖子上的孔注入扩散皿底部的水中。插入或拔出注射器针头时，注意避免酸液溅到盖子内表面。
    5. HMDS 辅助的氟离子扩散：立即用凡士林密封注射孔，确保完全覆盖开口，并将扩散皿置于可调速摇床上，调至低速。在室温下孵育过夜（图 1）。

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图1：用于氟化物提取与捕获的骨扩散皿示意图。 图 1 展示了在60 × 15 mm未处理的培养皿中组装的骨扩散皿结构。皿盖上设有一个小的注射孔，用凡士林珠密封。在皿盖内表面悬挂三滴氢氧化钠（NaOH），作为氟离子（F⁻）的捕获剂，在扩散过程中悬垂于盖内。皿盖通过凡士林与培养皿底部严密密封，形成密闭环境。培养皿底部含有超纯水、六甲基二硅氧烷（HMDS）饱和的硫酸以及骨灰，共同构成氟化物释放及后续捕获的反应环境。本图由作者使用Biorender绘制，采用CC BY许可授权。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 使用离子选择电极法测定氟化物

  1. 安装离子选择性电极（ISE）
    1. 用适当的填充液填充双通道氟离子选择性电极，将其连接至电位计，并将电极固定在电极架上。
    2. 将一个未处理的培养皿置于电极感应面下方的剪式升降台之上，确保感应面与培养皿底部平行，并升高剪式升降台，使培养皿几乎接触电极（图2）。
  2. 测量样品的制备
    注意：样品定义：本方案中所称“样品”仅指使用离子选择性电极（ISE）测量的最终产物，即扩散后收集的F¯捕集液，随后与乙酸和水混合的溶液。 
    1. 为将样品pH调节至5，在孵育期结束后从摇床取下扩散皿，小心揭开盖子，打破凡士林密封。将盖子倒置在平坦表面上，确保三个F¯捕集液滴保持不动。
    2. 使用P20移液器向其中一个液滴加入15–20 µL的0.2 N乙酸，然后不更换吸头，将三个液滴合并为一个液滴。
      注意：F¯浓度较高的样品初始pH通常较低，因此与F¯含量较低的样品相比，调节pH至5所需的0.2 N乙酸量较少。由于在记录电极电位（步骤 5.3）后剩余样品体积极小，可利用残留样品通过指示试纸验证pH值。
    3. 为调节样品体积，将P100移液器调至75 µL，完全吸取F¯捕集液，避免引入气泡，并用超纯水将样品体积准确调整至75 µL。
    4. 此步骤需谨慎操作，以确保氟浓度计算的准确性。将样品保留在移液器吸头中，并立即进入步骤4.3。
  3. 样品、校准标准品及质控样品的测量
    1. 为测量样品的电极电位，将样品滴加至氟离子选择性电极的感应面与培养皿之间。确保电极的整个感应面完全浸入液体中，且不直接接触培养皿。待电位计读数稳定后，记录ISE显示的电位（mV）。
    2. 通过依次测量第一组校准标准品（从最低F¯浓度开始，逐步至最高浓度）确定校准标准曲线。
      1. 以电极电位（mV）对F¯含量的对数（ng）作图，绘制校准曲线（图3）。采用指数回归拟合，获得标准曲线方程及决定系数（R2）。仅当R2 ≥ 0.99时，方可接受该校准曲线。
    3. 测量每个待测样品并记录其电极电位（mV）。
    4. 为监测电极稳定性并检测可能的分析漂移，在每次分析运行过程中间歇性测量质控样品。
      1. 将质控样品的测量值与相应校准样品直接比较，确认其差异在约5%以内，以验证电极性能的长期稳定性。
      2. 定期测量空白扩散皿，以确认样品处理和扩散过程中无氟污染。
  4. 根据标准曲线方程计算每个待测样品中F¯的质量（ng），然后将该质量除以扩散皿中加入的血清体积（µL）或骨/牙灰分质量（mg）。
    1. 骨灰中F¯浓度计算示例（ng/mg）
      1. 加入扩散皿的骨灰质量：5.1 mg；75 µL待测样品的电极电位：–31.6 mV
      2. 步骤1：使用校准方程计算氟质量
        1. F⁻质量（ng）= 3505.4 × e(-0.043×-31.6)
        2. F⁻质量（ng）= 13,641 ng
      3. 步骤2：计算骨灰中氟浓度
        1. F⁻浓度 =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. F⁻浓度 =  2,675 ng / mg（ppm）

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图2：离子选择性电极（ISE）测量装置示意图。图 2展示了使用双通道离子选择性电极（ISE）进行氟离子测量的实验配置。一个培养皿放置在剪式升降台上，以便精确调节其相对于电极的高度。ISE连接至电位计，并调整方向，使其感应表面与培养皿平面平行，两者间距保持在约1–2 mm。设定间距后，用移液器将少量样品（75 µL）注入感应表面与培养皿之间的间隙中，确保样品在测量过程中完全覆盖电极的感应区域。本图由作者使用Biorender绘制，采用CC BY许可授权。请点击此处查看该图的高清版本。

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图3：牙体样本中氟离子质量定量的校准曲线及相应校准表。上图：用于测定牙体样本中氟离子质量的校准曲线示例。横轴表示电极电位（mV，线性刻度），纵轴表示相应的氟离子质量（ng F⁻，对数刻度）。实测校准点以实线表示，拟合的指数回归曲线以虚线表示。插图框内显示标准曲线方程及决定系数（R2 = 0.99）。下图：生成校准曲线所用数值的表格。第一行为校准样品记录的五个电极电位值（mV）。第二行为各校准样品对应的氟离子质量（ng F⁻）。第三行为加入校准扩散皿中的10 mM NaF储备溶液的体积（µL）；该添加的氟离子质量等同于扩散后各校准样品中截留的氟离子质量。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

为了展示本方案在测定生物材料中氟化物（F-）浓度方面的应用，样品来源于接受可控氟化物处理的小鼠的血清、骨骼和下颌切牙标本。雄性C57BL/6J小鼠被分为两个年龄组：青春期（6周龄）和成年期（18周龄），每组分别提供无氟去离子水（0 ppm F⁻）或含氟化钠的饮用水（125 ppm F⁻），持续暴露6周。每个年龄组和处理条件下均包含5只动物。在暴露期结束后，采集血清、股骨和下颌切牙，按照本方案制备并分析样品。下文总结了在血清、骨骼和牙齿中测得的代表性氟浓度。

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图4：血清、股骨和下颌切牙中测得的氟化物浓度。 雄性C57BL/6J小鼠分为两个年龄组：青春期（6周龄，空心柱）和成年期（18周龄，实心柱），分别给予无氟去离子水（0 ppm F⁻）或含氟化钠的饮用水（125 ppm F⁻），暴露期为6周。在暴露期结束时，测定同一处理组中（A）血清、（B）股骨和（C）下颌切牙的氟含量。低于检测限（<0.02 ppm）的血清数值为便于可视化而绘制，但未纳入统计分析。数据以均值±标准差表示。青春期组与成年组之间的比较采用Mann–Whitney U检验，并对多重比较进行Bonferroni–Dunn校正。 *p < 0.05，**p < 0.01（N = 每组5只）。请点击此处查看本图的放大版本。

血清中的氟化物浓度
在给予0 ppm氟化物处理的青少年组和成熟组中，血清氟化物浓度均低于离子选择性电极的检测限（<0.02 ppm）。在125 ppm处理组中，青少年组的血清氟化物浓度升高至0.3 ± 0.2 ppm，成熟组则升高至0.7 ± 0.2 ppm（p = 0.06）。采用Mann–Whitney U检验对125 ppm处理的青少年组与成熟组进行比较，并通过Bonferroni–Dunn校正法对多重比较进行校正。 *p < 0.05，**p < 0.01（N = 5/组）。0 ppm处理组未纳入统计分析。（图4A，表1）。

股骨中氟化物浓度
在0 ppm处理组中，青少年动物的股骨氟化物浓度（292 ± 39 ppm）显著低于成年动物（896 ± 55 ppm）（p < 0.01）。相反，在125 ppm处理组中，青少年动物的氟化物浓度（4,108 ± 482 ppm）显著高于成年动物（2,966 ± 612 ppm）（p = 0.04）。青少年组与成年组之间的比较采用Mann–Whitney U检验，并对多重比较进行Bonferroni–Dunn校正。 *p < 0.05，**p < 0.01（N = 5/组）。（图4B，表1）。图5A显示了每个年龄组在0 ppm与125 ppm处理之间股骨氟化物的倍数变化。在125 ppm剂量下，青少年动物的氟化物水平增加了14倍，而成年小鼠仅增加了3倍。

下颌切牙中的氟化物浓度
在0 ppm组中，青少年组下颌切牙的氟化物浓度（35 ± 4 ppm）显著低于成年动物（123 ± 23 ppm）（p = 0.03）。在125 ppm处理组中，青少年动物切牙氟化物浓度升高至5641 ± 955 ppm，成年动物则为4392 ± 1694 ppm。青少年组与成年组之间的比较采用Mann–Whitney U检验，并对多重比较进行Bonferroni–Dunn校正。 *p < 0.05，**p < 0.01（N = 5/组）。（图4C、表1）。尽管在125 ppm条件下，不同年龄组之间的绝对氟化物浓度差异无统计学意义，但从0 ppm到125 ppm的倍数变化在青少年小鼠中（增加161倍）显著高于成年小鼠（增加36倍）（图5B）。

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图5：青少年期小鼠骨组织和门齿中氟化物的累积倍数增加幅度大于成年小鼠。 青少年期（空心柱）和成年（实心柱）小鼠在0 ppm与125 ppm氟化物处理下氟浓度的倍数变化。（A）股骨骨组织和（B）同一处理组的下颌门齿。数据以均值±标准差表示。青少年组与成年组之间的比较采用非配对t检验。*p ＜ 0.05（N = 5/组）。请点击此处查看此图的放大版本。

样本血清股骨下颌中切牙
年龄组青春期成熟期青春期成熟期青春期成熟期
处理组0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
均值< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
标准差NA0.2NA0.239482556123955231694

表1：血清、股骨和下颌门齿中氟化物的个体测量值。 表1列出了在暴露于0 ppm或125 ppm氟化物的青少年期和成年期小鼠中，血清、股骨和下颌门齿样本中测得的个体氟浓度（ppm F⁻）。对于每种组织类型，数据按四组处理组分别以列呈现：青少年期0 ppm组、青少年期125 ppm组、成年期0 ppm组和成年期125 ppm组。每列包含五个个体记录值（N = 5），后接计算所得的均值和标准差（SD）。在青少年期0 ppm血清组中，所有记录值均低于离子选择性电极的检测限（<0.02 ppm）。该表提供了图4中所示汇总值及统计比较所依据的原始数值数据。

讨论

使用掺杂氟化镧（LaF₃）的氟离子选择性电极（ISE）进行氟化物浓度测定。₃晶体膜38,39该膜可形成高度稳定的La–F键，从而对氟离子的选择性显著高于其他卤素离子。根据已建立的电化学文献及制造商的技术参数，LaF₃ 膜对氯离子的选择性系数极低，表明在本方案所用条件下，氯离子不会产生可测量的干扰。尽管氯离子天然存在于牙齿和骨骼中，其活度不会影响电极电位，所记录的信号特异性地反映氟离子的活度。0.02 ppm 的检测下限对应于 Orion 氟离子选择性电极经制造商验证的最低可定量浓度。该限值反映了电极仍能保持稳定的能斯特响应并与校准曲线呈线性关系的最低氟离子浓度。由于检测下限由电极膜的特性决定并已由制造商验证，本方案无需额外进行实验测定；然而，关于检测上限，作者观察到当氟的质量超过约 38,000 ng 在 50 µL NaOH捕获导致电极响应呈非线性，表明在氟化物负荷极高时，校准曲线已不再可靠。这种非线性很可能是由于在给定实验条件下超出了电极的最佳离子强度和活度范围，而非反映了离子选择性电极（ISE）本身固有的上限。 对于预计氟化物含量高于该阈值的样品，建议增加氢氧化钠捕集液的体积，以确保测量值处于电极的线性动态范围内。

当将本方案应用于氟含量异常高的样品时，应考虑这一因素。由于扩散步骤会消耗全部样品体积，因此无法对生物样品进行重复测量或加标回收实验。为确保分析的准确性和精密度，每次测量系列中均包含已知氟浓度的质量控制（QC）标准品。这些QC标准品的处理和测定方式与实验样品完全相同。在所有运行中，QC标准品测得的氟浓度始终在其预期值的5%范围内。 对于每批10–20个待测样品，均平行制备两组独立的5–6个校准样品，并在校准样品与待测样品处理完成后、每次测量前记录校准曲线。每次运行的校准范围均根据待测样品预期的氟质量进行调整，该预期值取决于样品类型、加入扩散皿中的材料质量以及动物的处理组别和年龄。对于血清测定，校准标准品对应的样品中氟浓度约为0.06–1.20 ppm；对于骨和牙齿测定，校准标准品对应的样品中氟浓度约为19–7,600 ppm。

本方案提供了一种灵敏且可重复的方法，用于定量血清、骨骼和牙齿中氟离子质量，其通过六甲基二硅氧烷促进扩散并结合离子选择性电极（ISE）分析实现。该方法可稳定捕获从多种生物基质中释放的氟离子，从而在受控暴露条件下实现对氟蓄积的定量评估。来自青少年期与成年小鼠的代表性结果表明，不同组织中的氟沉积存在明显的年龄依赖性和剂量依赖性差异，凸显了该方法在研究氟代谢及毒物动力学方面的实用性。 关键词：氟离子定量，血清，骨骼，牙齿，六甲基二硅氧烷，扩散法，离子选择性电极，氟代谢，毒物动力学，生物基质，氟蓄积，年龄依赖性，剂量依赖性 体内.

本方案的一个关键优势在于使用了扩散皿，可将释放氟离子的反应与捕获氟离子的环境在物理上分隔开来。石蜡油密封的设计最大限度地减少了与大气的交换，确保盖内氢氧化钠液滴能够高效捕获释放出的氟离子。六甲基二硅氮烷（HMDS）饱和的硫酸为从矿化组织（包括骨和牙齿等高度钙化的结构）中释放氟离子提供了强大且稳定的驱动力。随后通过离子选择性电极（ISE）进行检测，并采用与扩散条件匹配的标准品进行校准，可在较宽的动态范围内实现准确的定量。该方法的另一优势在于能够对极微量的生物样品中的氟进行定量。小鼠的矿化组织，特别是下颌门齿，每颗牙齿仅能产生3–5 mg的灰分。传统的分析方法通常需要更大的样品量或更高的氟含量才能实现可靠的检测。相比之下，基于扩散的设计可将整个样品中释放出的全部氟离子富集到一个微小且固定的体积中，从而即使在绝对氟含量极低的微小样品中也能实现精确的定量。这一特性对于涉及小型动物、组织样本有限或经显微解剖获得的矿化结构的研究尤为重要。

该方法的一个主要局限性在于本研究中所用离子选择性电极（ISE）的检测限（0.02 ppm）。无氟对照组动物的血清样本中氟浓度常低于此阈值，导致极低浓度的氟无法被定量。当测量接近或低于检测限的痕量氟浓度时，若条件允许，可增加加入扩散皿的样本质量或体积，或需采用其他分析技术。此外，该方法需要过夜扩散，并需谨慎操作腐蚀性试剂，这可能限制高通量研究中的样本处理能力。尽管ISE能够对总体氟含量进行高灵敏度定量，但无法评估氟在组织内的空间分布。可结合使用其他补充性方法，如扫描电子显微镜联用能谱仪（SEM-EDX）或质子激发伽马射线发射分析（PIGE），以在微米至宏观尺度上可视化并绘制氟的分布图谱。这些基于成像的技术可评估氟在矿化组织或软组织中的局部蓄积情况，从而与ISE测定结果相互补充，更全面地评估组织中氟的含量。

在本实验方案中，多个反复出现的技术因素可能影响氟化物扩散与测定的准确性和可靠性。我们的观察表明，校准液的配制、扩散皿的密封、pH 控制、电极性能以及样品处理共同决定了数据质量。校准曲线非线性（R2 ＜ 0.99）或组织样品读数超出预期范围的可能原因，包括向扩散皿中加入的 NaF 储备液体积计算错误，或在配制校准标准品时发生移液误差。建议措施：每次运行至少制备两套独立的校准样品，以便在某条校准曲线超出预期范围时可使用备用校准组。扩散皿密封不完全也可能导致扩散过程中氟化物损失，从而产生人为偏低的读数。这种情况通常发生在扩散皿盖边缘涂抹的凡士林不足时。建议措施：在扩散皿盖边缘均匀涂抹足量凡士林软膏，并用力压紧以确保完全密封。向 NaOH 捕获液中添加乙酸溶液时若发生移液误差，可能导致样品 pH 偏离最佳范围（pH 5.0），从而影响氟化物回收的准确性。建议措施：使用 pH 试纸检测每个样品的 pH，并弃用任何 pH 超出 5.0 范围的样品。校准样品的浓度也可能超出氟离子选择性电极的有效检测范围。浓度低于 0.02 ppm 的样品低于电极的检测限。建议措施：不得使用含氟浓度低于 0.02 ppm 的校准样品。相反，氟浓度过高的校准样品可能改变溶液的离子强度，导致电极响应非线性。建议措施：在项目开始时，配制覆盖较宽氟浓度范围的校准溶液，以确定所用电极的线性工作范围。若组织样品超出该线性范围，应减少组织质量或增加 NaOH 捕获液体积，并相应调整乙酸的加入量，以维持 pH 为 5.0。在 0.02–1 ppm 范围内难以获得线性校准曲线的常见原因是电极老化。较旧的氟离子选择性电极在极低氟浓度下灵敏度下降。建议措施：更换氟离子选择性电极。电位计读数不稳定（信号漂移或跳动）通常发生在电极感应表面未完全浸入样品溶液中时。建议措施：将电极下移，确保其感应表面完全被液体样品覆盖。

总体而言，本方案提供了一种基于校准的可靠方法，用于定量多种生物基质中的氟化物，非常适合用于研究小鼠模型中氟化物的暴露、组织沉积及毒理学效应。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究的资助来自日本促进科学协会；JSPS海外研究奖学金202560528（S.Y.），圣保罗研究基金会（FAPESP）；2024/07452-9（J.S.T.），以及美国国立卫生研究院牙科与颅面研究所；R01DE027648（M.S.）和K02DE029531（M.S.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冰乙酸Sigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
氧化铝坩埚Advalue Technology12 mm 外径 × 25 mm 高，AL-6212AL-6212
分析天平VWRVWR 124B2，d = 0.1 mg—
珠磨机BenchmarkBeadBug 6—
钝头注射器针头Amazon工业用钝头针，14 G × 0.5 英寸X001TT8KX1
二氧化碳AirGas——
化学通风橱Mott Manufacturing型号 7421040—
D(+)-蔗糖Thermo Scientific生化级，纯度 99.7%177142500
电极填充液Thermo ScientificOrion IonPlus 填充液900061
乙醇溶液Koptec140 证明度2401
冷冻柜，−80 °CThermo ScientificRevco RDE 系列—
耐热手套Fisher ScientificBel-Art Clavies 生物危害高压灭菌手套H13201
六甲基二硅氧烷（HMDS）Fisher ScientificTCI H0091，>98%H0091
过氧化氢VWRJ.T. Baker，30%2204-01
离子选择性电极Thermo ScientificOrion 氟离子选择性电极，双通道9609BNWP
磁力搅拌器VWR360 搅拌器—
微型刮勺Amazon蜡雕刮勺 #7A，不锈钢—
微量离心机Eppendorf5427R5404000131
马弗炉Thermo ScientificThermolyne 小型台式马弗炉，1.3 L，FB1315MFB1315M
烘箱Boekel ScientificBoekel RapidFISH240200
PBS 中的多聚甲醛溶液Thermo Scientific4% 多聚甲醛 PBS 溶液J19943-K2
培养皿VWR60 × 15 mm，未处理25384-092
凡士林Thermo Scientific白色纯净凡士林417090010
pH 指示试纸Fisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
瓷皿Fisher ScientificFisherbrand 坩埚，5 mL，20 mm 高，高型FB-965-B
电位计Thermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE 测量仪2115102
带夹铁架台VWR环形夹，15 cm470104-526
啮齿类动物饲料Bio-ServF1515，AIN-76A，½ 颗粒F1515
剪式千斤顶Amazon实验室用剪式千斤顶—
分液漏斗Fisher ScientificEisco，硼硅酸盐玻璃，2 LS89285
氯化钠Fisher ScientificACS 认证，结晶状S271-1
氟化钠Fisher ScientificACS 认证，粉末状S299-100
氢氧化钠Fisher Scientific白色颗粒BP359-500
不锈钢珠Fisher ScientificScientific Industries，5 mm，100 个SI-CS05
硫酸Fisher ScientificACS 级A300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus 应用溶液940909
真空干燥器Fisher ScientificBel-Art Space Saver 真空干燥器，10 英寸F42010-0000
真空滤器Fisher ScientificFlow 瓶顶滤器，PES，90 mm，0.2 µm597-4520
可调摇床MidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

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