基于三维细胞培养的丝素蛋白海绵混合生物分析平台用于光学成像

摘要

本文介绍了一种简单、易行且可重复的丝素蛋白支架制备方法，以及在流体控制条件下培养4T1-iRFP720乳腺癌细胞以支持动态培养的实验方案。以活体光学成像仪器作为主要的非侵入性检测手段，对细胞的生长和迁移进行了评估，以验证该方法的可行性。

摘要

我们介绍一种创新的生物分析杂交平台，旨在用于细胞特性的临床前评估。该系统将生长于人工细胞外基质上的三维（3D）细胞培养与受色谱技术启发的阵列构型相结合。由结构蛋白丝素蛋白制成的海绵既作为仿生细胞外基质，又作为固定相。丝素蛋白海绵通过多步工艺在实验室自行制备，包括从天然蚕丝纤维中去除丝胶蛋白，随后溶解并透析以纯化丝素蛋白溶液，再溶于有机溶剂，最后通过盐床铸造成型，制得孔隙率/孔径可控（500–800 µm）的丝素蛋白基海绵。利用泵驱动的连续培养基流动，将基因修饰的小鼠乳腺癌细胞系4T1-iRFP720和4T1-wt（非荧光对照）在丝素蛋白支架内进行培养，并通过光学成像技术对细胞的生长行为与特性进行无创分析体内 光学成像仪器）。通过结合色谱系统的关键优势（自动化、可重复性）与先进三维细胞培养的生物学相关性，该平台能够 体外 在促进对动态细胞行为监测的同时，模拟类组织结构与形态。并行地，医学成像技术的应用可实现对细胞迁移、生长等过程的实时与长期监测。该方法在层流样系统中研究细胞行为的宏观特征方面具有重要意义。通过提升生理相关性 体外 模型，该方法可能有助于弥合转化研究的差距 体内 研究符合动物实验的减量、替代、优化（3R）原则。

引言

在活体组织中，细胞迁移和生长发生于三维、异质性的细胞外基质（ECM）环境中，并受到诸如组织间液流和细胞-细胞相互作用等生物物理和生化信号的引导。这些因素调控细胞极性、机械信号转导以及协调性运动，从而支撑组织修复和癌症侵袭等关键生物学过程^1,2,3,4。

尽管它们很重要，大多数 体外 迁移实验（如划痕实验和Transwell实验）用于评估单个细胞在平坦、静态基质上的运动能力。尽管这些2D方法操作简单且成本较低，但它们难以真实再现细胞所处环境的结构特征和动态特性 体内 微环境^5,6这一局限性在癌症转移背景下尤为关键，因为肿瘤细胞会通过力学和化学性质各异的组织基质进行集体迁移。^3,7,8尽管二维划痕实验因其操作简便而仍被广泛使用，但其无法反映细胞外基质的复杂性以及流体流动的影响。⁶基于Transwell的方法可提供定量读数，但仅限于固定的终点，无法实现对迁移过程的连续观察^6,9.

近期研究表明，间质流可增强转移潜能，而细胞外基质的硬度和成分则促进上皮-间质转化及集体迁移^4,10更高级的三维系统（如球状体和类器官）能更好地模拟天然细胞外基质环境；然而，其应用常受限于实验变异性、实验操作可及性有限以及标准化分析困难等问题^11,12微流控平台能够对力学和流体条件实现更精确的控制，但其对专用制造方法和设备的依赖限制了其广泛应用¹³因此，重现这些整合的信号 体外 以可控、可及、无创且经济有效的方式实现仍然是一个主要挑战^5,14.

为应对这些挑战并弥合传统二维检测与复杂的体内模型之间的差距，我们开发了一种基于丝素蛋白海绵支架的简单、可通流的三维细胞培养平台。该系统采用具有可调机械性能的丝素蛋白海绵作为类似细胞外基质（ECM）的支架。选择丝素蛋白是因其多孔结构，可实现温和灌注，并支持生理相关的组织间液流动¹⁵。其良好的生物相容性以及在生物医学和组织工程中的广泛应用，使其成为该应用的理想材料。最近一项研究进一步证明了该支架在环境可持续性和可回收性方面的潜力¹⁶。在另一项研究中，我们进一步展示了该支架在不同成像模式下的适应性，例如正电子发射断层扫描¹⁷。这些前期工作为本方法学描述奠定了基础，本文在此基础上采用相同的平台概念，构建了一种简化的基于体内光学成像的配置。综上，这些研究展示了该系统在基于多模态成像评估工程化组织构建物方面的潜力，并支持其作为多功能实验平台，用于整合不同肿瘤细胞模型的体外培养与体内相关的检测读出。

作为概念验证，我们在两种低剪切应力流动条件下，将表达 iRFP720 标记的 4T1 三阴性乳腺癌细胞在支架内培养了五天。非侵入性 体内 光学成像监测显示，与静态对照相比，细胞群体动态发生了显著变化，并呈现出独特的流向性生长模式。通过强调工程设计的简洁性与可重复性，该模型为二维检测与 在 活体 研究，使研究人员能够在生理相关且易于操作的体系中，以宏观尺度和非侵入方式，检测由流体流动介导的细胞特性。与以往常依赖破坏性终点分析或缺乏标准化接种标准的方法不同，本方案提出了一套系统性框架，用于优化支架制备，继而实现细胞接种与成像。该方法增强了实验的稳健性，提供了对三维基质中细胞群体动态更全面、纵向的观察视角，相较于现有监测细胞生长与迁移的方法具有显著改进。

方案

第一部分概述了基于先前已发表研究¹⁶的丝素蛋白支架的制备方法。后续部分描述了细胞接种密度的优化，以及整合流动培养与光学成像技术以监测细胞迁移和生长的过程。本研究仅使用了已建立的小鼠乳腺癌细胞系（4T1-wt 和 4T1-iRFP720），未涉及人类受试者、患者样本、原代组织或活体动物。根据机构和国家指南，无需伦理审批。工作流程的示意图见图1。

1. 丝素蛋白海绵的制备

1. 蚕茧的清洗与脱胶。
   1. 使用安全手术刀切开家蚕 Bombyx mori L. 的蚕茧。
   2. 去除蚕蛹，并用标准解剖针提取最内层的蚕茧（紧贴幼虫腔的致密层）。
   3. 用1.6 L的双蒸水（ddH₂O）装满烧杯。
   4. 加入磁力搅拌子，边搅拌边加热至沸腾；用铝箔覆盖烧杯以加快加热速度并减少水分蒸发。
   5. 当水温达到约70 °C时，加入3.4 g的Na₂CO₃。
   6. 当混合液开始沸腾时，将4 g预处理好的蚕茧放入溶液中，并用玻璃棒搅拌。
   7. 将蚕茧煮沸30分钟，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，以确保充分暴露。
   8. 将丝素从溶液中取出，用自来水多次冲洗以去除残留的丝胶。
   9. 挤去多余的水分，并将丝纤维铺展在预先准备好的铝箔盘上。
   10. 在预热至50 °C的烘箱中干燥丝纤维，直至完全干燥（约18小时）。
2. 溶解与透析
   1. 后续步骤使用无水乙醇和无水CaCl₂。溶解体系由1份CaCl₂、2份乙醇和8份ddH₂O组成。脱胶干燥丝与溶解体系的质量比为1:10 [w/w]。
   2. 称取干燥丝素，并据此计算溶解体系各组分的正确用量。
   3. 将相应量的CaCl₂加入配有搅拌子的圆底烧瓶中。
   4. 量取所需量的乙醇和ddH₂O并混合。
   5. 在搅拌条件下，将乙醇-ddH₂O混合液加入CaCl₂中。
   6. 搭建回流装置，将混合物置于油浴中加热至100 °C，使CaCl₂溶解并使混合液沸腾。
   7. 当混合液开始沸腾时，加入干燥丝素，在回流条件下加热45分钟。
   8. 取15 cm长的3.5 kDa纤维素透析管，用水多次冲洗以重新水化，然后将一端套在玻璃棒上并用密封夹固定。
   9. 煮沸后，将热的丝素溶液转移至透析管中，用夹子密封另一端，液体与夹子之间留出2–3 cm空隙，不得含有气泡。
   10. 将装有溶液的透析管放入盛有2 L ddH₂O的烧杯中，在室温下透析72小时，每天换水两次，以确保有效纯化。
   11. 在室温下以4500 × g 离心10分钟。
   12. 小心倾倒上清液至离心管中，避免扰动沉淀，并将离心管储存于-20 °C。
       注意：离心管填充量不得超过其容量的一半，并应水平放置冷冻。
3. 冷冻干燥
   1. 预热真空泵20分钟，并按照制造商说明操作冷冻干燥机。
   2. 将从冷冻箱中直接取出的冷冻离心管放入圆底烧瓶中。
   3. 将烧瓶连接至冷冻干燥机，冷冻干燥24小时。
   4. 在进一步使用前，将冻干的丝素蛋白储存在室温下的干燥环境中。
4. 溶剂浇铸与颗粒沥滤
   1. 在通风橱中，向尿液样品容器中加入所需量的冻干丝素和1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP），配制成终体积为30 mL、浓度为16 % [w/v]的溶液，盖上容器盖。
      警告：HFIP具有腐蚀性，吸入、摄入或经皮肤吸收均有害；操作时应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备（PPE），避免接触皮肤、眼睛和蒸气。若发生泄漏，使用吸附材料收集液体并清洁污染区域。将受污染材料转移至指定的危险废物容器中。
   2. 将容器密封后置于轨道摇床上，70 rpm振荡18小时，使丝素充分溶解。
   3. 使用不同孔径的筛网对NaCl进行筛分，保留500–800 µm的颗粒组分。
   4. 将100 g筛分后的盐（500–800 µm组分）填入培养皿（直径9 cm，底部直径8.5 cm），使其高度达到1.2 cm。确保表面平整均匀。
   5. 将25.5 mL制备好的丝素溶液轻轻倒入盐床（作为海绵孔隙形成的致孔剂）上。
   6. 盖上培养皿盖，置于轨道摇床上，70 rpm振荡10分钟，使丝素溶液均匀渗透入盐床中。
   7. 将培养皿在37 °C下闭盖孵育1小时，随后在37 °C下敞盖继续孵育18小时。
   8. 为诱导β-折叠结构形成，将丝素复合材料浸入盛有甲醇的烧杯中20分钟，然后取出并在50 °C烘箱中干燥（约1小时）。
      警告：甲醇具有高毒性；操作时应在通风橱中佩戴适当的PPE，避免皮肤接触和蒸气暴露。若发生泄漏，使用吸附材料收集液体并清洁污染区域。将受污染材料转移至指定的有毒废物容器中。
   9. 通过将丝素复合材料浸入盛有温自来水的烧杯中至少3小时（每20–30分钟更换一次水），以去除致孔剂NaCl，直至材料呈现柔软、海绵状质地且无硬块残留。
   10. 将丝素海绵储存在70%乙醇中，用于消毒和短期保存（4 °C）。
       注意：含HFIP的溶液按卤代溶剂废物收集，甲醇废液则根据机构化学品安全指南作为非卤代有机溶剂废物单独处理。使用后的去污过程中，接触过HFIP或甲醇的容器和工作表面需用相容溶剂冲洗，并用洗涤剂溶液清洁。初始冲洗液和受污染耗材应作为化学危险废物收集。

2. 蚕丝支架的制备与平衡

1. 使用直径为 6 mm 的活检打孔器切割丝素蛋白海绵，制备直径为 6 mm、高度为 12 mm 的圆柱形支架。
   注意：制备好的丝素蛋白海绵支架可在 70% 乙醇中 4 °C 条件下保存长达 4 个月；如需长期储存，建议定期更换新鲜乙醇。平衡后的支架可在细胞培养基中 4 °C 条件下保存最多 1 个月。
2. 将样品放入含有 70% 乙醇的离心管中进行消毒。
3. 在经认证的生物安全柜中进行后续操作，以防止污染。
4. 用移液器吸除乙醇，同时用镊子轻压海绵以帮助液体排出。
5. 将海绵置于含有 10–20 mL 添加补充物的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基的培养皿中，确保完全浸没。
6. 每次更换培养基时轻轻振荡，共更换三次。
7. 第三次洗涤后，加入新鲜培养基，盖紧盖子，并用封口膜密封包裹。
8. 使用前，将海绵在 4 °C 冰箱中至少储存一周。在此期间，更换培养基 4–5 次。
   注意：务必彻底去除乙醇，因为残留乙醇具有细胞毒性，会损害细胞贴附和存活率。

3. 背景测量与成像优化

1. 将未接种丝素蛋白支架的光学透明过滤管及空的光学透明过滤管转移至 体内 光学成像
   注意：成像使用以下设备进行 体内 在2D落射荧光模式下进行光学成像。
2. 使用不同的滤光片组合（激发光：675 nm，745 nm；发射光：720 nm，800 nm）、曝光时间（4–60 s）、光圈值（1–8）、视野范围（13.5–22.5 cm）以及不同的光源强度（低和高）进行成像。
3. 在使用接种细胞的支架之前，需在相同条件下对两种平台进行成像以评估自发荧光。
4. 将雄性鲁尔锁紧接头替换为截短的雌性鲁尔锁紧连接器，用于仅成像的装置，以消除雄性鲁尔锁紧接头产生的高强度自发荧光伪影。若所有实验所用材料相同，此步骤仅需执行一次。
    

4. 细胞悬液的制备及在丝素蛋白支架上的接种

注意：由于这些操作涉及活细胞和含细胞样本的处理，所有后续步骤均须在生物安全柜内的无菌条件下进行。

1. 定期监测4T1野生型（4T1-wt）和4T1-iRFP720小鼠三阴性乳腺癌细胞是否存在污染，并检测iRFP720表达的稳定性。
2. 将4T1-wt和4T1-iRFP720小鼠三阴性乳腺癌细胞培养于添加了10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中维持培养。
3. 按照标准无菌细胞培养操作，当细胞融合度达到约80%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行传代。
4. 在所有比较实验中，4T1-wt和4T1-iRFP720细胞应使用相同的传代次数和培养条件。
5. 制备细胞接种密度范围为5 × 10⁴至5 × 10⁷ 个细胞/mL（相当于每200 μL含1 × 10⁴至1 × 10⁷个细胞）。为进行成像分析，评估不同细胞密度下的信号强度并确定最佳浓度，需准备以下浓度：5 × 10⁴、3.38 × 10⁵、6.25 × 10⁵、1.25 × 10⁶、2.5 × 10⁶、3.75 × 10⁶、5 × 10⁶、1.25 × 10⁷、2.5 × 10⁷和5 × 10⁷ 个细胞/mL。
6. 将4T1-wt细胞配制成与4T1-iRFP720细胞相同的浓度梯度，作为非荧光对照组。
7. 将各支架（第2节中制备）置于无菌、未处理的培养皿中。
   注意：使用未处理的培养皿可尽量减少细胞在塑料表面的贴附，促进细胞向丝素蛋白支架的贴附。
8. 用移液器小心吸除支架周围及支架表面的多余培养基，注意避免破坏支架结构。
9. 将200 µL适当浓度的细胞悬液直接滴加至每个支架的上表面，确保全部液体被支架吸收。
10. 将支架置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育4小时，期间避免扰动培养皿，以促进细胞贴附。
11. 4小时后，将每个接种了细胞的支架小心转移至24孔板的孔中，每孔含1 mL预热的完全培养基。
12. 将支架在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育过夜（16–24小时）。

5. 带烧结片的校准平台组装

注意：所有组装步骤均须在生物安全柜中使用无菌手套、无菌镊子和无菌工具进行。

1. 使用无菌镊子从24孔板中取出接种细胞的丝素蛋白支架，操作时应轻柔支撑每个支架，避免受压变形。
2. 使用无菌柱推杆将一个接种细胞的支架插入光学透明的固相萃取管的下部。
3. 使用推杆将一个无菌聚乙烯筛板直接放置在支架上方。
   注意：仅在信号优化过程中使用聚乙烯筛板，因其孔径小于细胞直径，可阻止细胞迁移或任何细胞间接触。这也有助于实现清晰的信号分离，从而确定每个信号对应的确切细胞浓度。
4. 重复上述堆叠顺序，依次放置一个支架和一个筛板，直至共插入五个接种细胞的支架和五个筛板。
5. 使用无菌雌性鲁尔锁接头封闭过滤管底部。
6. 使用无菌雄性鲁尔锁接头封闭萃取管顶部。

6. 信号优化方法 体内 使用带有烧结片的校准平台的光学成像仪器（仅用于系统验证一次）

1. 将接种细胞的平台转移至避光暗箱内的活体光学成像室进行校准，以保护荧光标记细胞免受光漂白。
2. 制备 体内 根据机构的安全和操作规程进行光学成像。
3. 将接种细胞的组装平台置于成像载物台上。
4. 使用675 nm激发光和720 nm发射光获取二维落射荧光图像，并优化成像参数（包括曝光时间、像素合并因子和f值），以在线性检测范围内获得最大信号强度（参见 补充图1 和 补充图2).
5. 至少包含一根含有接种了4T1-wt细胞且细胞密度一致的支架的光学透明提取管，作为非荧光参比对照。
6. 使用相同的成像参数对所有样品进行成像，以实现荧光强度的定量比较（参见 补充图3 和 补充图4).
7. 使用荧光信号定量分析 在体 光学成像分析软件，并确定最佳的细胞接种密度（即 5 × 10⁶ 每个支架的细胞数）以提供最大信号且不产生饱和（参见 补充图5).
   注意：最终 体内 光学成像系统参数根据优化实验进行选择，以确保信号采集处于系统的线性动态范围内，避免支架容量饱和，并在实验组与对照组条件下维持稳定的信噪比。根据优化后的参数设置，将5 × 10⁶ 细胞/支架。在2D落射荧光模式下进行成像，设置如下：激发波长：675 nm（带宽30 nm）；发射波长：720 nm（带宽20 nm）；曝光时间：10 s；像素合并因子：8；光圈值：8。

7. 实验平台组装（无烧结片）

1. 信号优化后，使用确定的最佳细胞密度接种实验支架（即 5 × 10⁶ 个细胞/200 µL，参见第4节）。
2. 组装实验平台，共使用五个丝素蛋白海绵：一个接种细胞的支架和四个无聚乙烯滤芯的空支架，以实现细胞间通讯。
3. 使用无菌公型鲁尔锁接头密封过滤管顶部。
4. 配置静态或动态培养条件的培养系统
   1. 静态培养：用无菌母型鲁尔锁接头封闭底部接口。然后将系统置于带有松盖的离心管中。
      注：由于公型鲁尔锁接头具有通气孔，该配置可在最小化污染风险的同时允许气体交换。在此设置下，每天在生物安全柜中手动更换培养基。
   2. 动态培养：将底部接口连接至无菌管路，并将进液管连接至顶部接口的公型鲁尔锁接头，以实现灌注培养。使用蠕动泵系统持续供给和移除培养基（补充图6）。

8. 平台中的动态培养

1. 以最大流速用70%乙醇冲洗泵及相连管路10分钟，开始消毒。
2. 用无菌完全培养基冲洗泵和管路至少10分钟，以去除残留的乙醇。更换新鲜培养基，继续灌注额外10分钟，以确保系统在使用前完全平衡。
   注意：接种细胞前，须确保所有组件均已完全充满培养基且无气泡。
3. 将组装好的反应器的雄性鲁尔锁接头（顶部）通过无菌管路和鲁尔锁接头连接至泵的出口管路。
4. 将泵的进液口连接至含有完全培养基的无菌储液器。
5. 将反应器出口（底部）连接至培养基储液器，以建立循环灌注回路。该配置可实现培养基持续流经支架，同时维持封闭的循环系统。
   注意：本方案中采用循环灌注模式，即培养基在储液槽与反应器之间持续循环。该方法可在维持连续流动的同时，最大限度减少培养基消耗。
6. 将泵的流速设定为达到目标名义壁面剪切应力（例如，1 dyn/cm）² 和 4 dyn/cm²），使用通道内半径（  = 3 mm）基于泊肃叶流的假设¹⁹:
   
   其中 τ 为壁面剪切应力（dyn/cm）²），Q 为体积流量（cm³/s  RPMI-1640 培养基的流体黏度（0.958 × 10⁻³ Pa·s）^-3 N·s/m² 在 37 °C 下²⁰尽管实际系统包含多孔丝素蛋白支架，因而偏离了这种理想化的几何结构，但计算所得的数值仍被用作标准化的操作基准，以实现不同流动条件之间的可重复比较。相应的流速分别为 0.133 mL/min 和 0.531 mL/min，并被用作培养过程中的灌注条件。
7. 开始灌注，并监测系统是否存在泄漏、气泡形成以及流量是否稳定。
8. 开始灌注迁移抑制剂或待测化合物（例如，完全培养基中含 0.05 µmol/L 木鳖果素 E (CuE)），或不添加（对照组），并将整个装置置于含 5% CO₂ 的湿润培养箱中，于 37 °C 维持培养₂ 最长可达五天。因此，将泵的入口连接至含有完全培养基（包括相应测试化合物）的无菌储液器，并使用与之前相同的设置启动泵。
   注意：通过执行规定的培养基冲洗步骤，确保从泵和管路中完全去除乙醇。在将系统连接至接种细胞的反应器之前，弃去冲洗后的初始部分培养基，并确保系统已完全充满新鲜培养基且无气泡。

9. 实验平台的荧光成像

1. 停止泵运行，在保持无菌条件的情况下断开所有管路。
2. 使用雌性鲁尔锁接头密封固相萃取管底部，将整个系统放入无菌的50 mL离心管中，并牢固盖紧管盖。
3. 将系统转移至生物安全柜中，以继续后续所有步骤。在通风橱内，将雄性鲁尔锁接头更换为截断的雌性鲁尔锁接头，以完全封闭系统。
4. 将密封系统放回无菌的50 mL离心管中，并拧紧管盖以确保运输安全。
   注意：根据实验室条件，当系统密封性良好时，成像过程中无需停止流体流动。然而，在本实验设定条件下，此操作无法实现。
5. 将密封反应器运送至 体内 光学成像系统房间置于避光暗箱内，以保护荧光细胞免受光漂白。
6. 将反应器放置到 在体内 将光学成像系统载物台置于合适的支架中。
7. 使用先前优化的参数获取二维落射荧光图像（即激发光波长 675 nm，发射光波长 720 nm，曝光时间 10 s，像素合并 8，光圈值 8）。
8. 每次成像实验均需设置接种4T1-wt细胞的支架、未接种细胞的支架以及空反应器对照。
9. 使用荧光信号定量分析 体内 光学成像分析
10. 绘制对照组和处理组的定量结果，并生成对比图以直观展示测试化合物对测定结果的影响。

10. 实验平台的图像分析

1. 在第0天、第3天和第5天获取荧光图像，并使用图像分析软件进行分析。
2. 对每幅图像，在分析前进行空间校准。使用直线工具测量实验平台已知的物理长度（以像素为单位），并输入对应的实际距离（85 mm） 分析 > 设定比例尺 定义像素与长度的换算关系。
3. 校准后，使用手绘选择工具手动勾勒出感兴趣区域（ROI），以量化荧光面积。
4. 为尽量减少人为偏差，应根据荧光信号强度相对于背景的一致性视觉标准来划定感兴趣区域（ROI）。所有分析均需在相同设置下进行，若条件允许，应由同一名经过培训的操作人员完成分析。
5. 将荧光信号识别为在暗背景下清晰可辨的明亮区域 体内 光学成像分析软件图像，并利用这些信号指导一致的手动分割。
6. 使用选定区域进行测量 分析 > 测量并记录每个时间点的面积值。对所有实验组的全部图像重复此操作。
7. 使用电子表格软件将每个样本的面积测量值归一化为其对应的第0天数值，以校正初始尺寸的差异，并将结果表示为相对于基线的倍数变化（第0天 = 1）。

11. 统计学分析

1. 所有实验至少重复三次。
2. 所有实验至少重复三次（n = 3），计算平均值及标准差（SD）。
3. 采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计学显著性检验，随后进行Tukey多重比较检验，显著性水平α = 0.05。

结果

本方案描述了一种用户友好、低成本的平台，可用于在生理相关的三维环境中对细胞生长和运动进行宏观观察。该方法采用丝素蛋白海绵作为细胞外基质（ECM）模拟物，并引入可控的组织液流动，以模拟动态的组织环境。从丝素蛋白海绵与支架的制备到细胞接种及实验平台组装的逐步操作流程示意图见图1。

最初，需要制备丝素蛋白支架，并可长期保存在乙醇中。丝素，尤其是丝素蛋白，在组织工程领域发挥着重要作用²¹。由于其具有高强度、优异的生物相容性、可调节的生物降解性以及较低的炎症反应风险等独特性质，丝素蛋白已被广泛应用于科研与医学领域^21,22,23,24。作为细胞培养平台，已有报道表明丝素蛋白有助于细胞的黏附与生长^2...

讨论

本方案中所述的丝素蛋白海绵制备工艺已实现标准化，可确保支架材料的可重复制备，如先前研究报道所示。¹⁶在完全标准化的条件下制备海绵体，例如盐床高度/用量、丝素蛋白溶液体积以及甲醇孵育条件，对于获得均匀且具有可比性的海绵体至关重要。所制备的海绵体需符合此前发表的质量控制协议标准。¹⁶简而言之，海绵需要满足诸如12的高度床层等标准 毫米，孔径介于500–800 µm，干重为 6 直径在10–15 mm之间的样品 mg，无硬质表层，以及通过扫描电镜（SEM）测定的均匀多孔结构。为标准化海绵的孔径，根据《欧洲药典》规定，采用尺寸排阻筛网对致孔剂进行筛分，仅保留500–800 µm粒径范围的组分。为验证孔径，对SEM图像进行处理，并依据先前发表的研究，使用图像分析软件测量孔径大小。¹⁶优化了丝素溶液的体积，以尽量减少硬质表层的形成，从而避免产生无法使用的海绵状材料。¹⁶盐床高度等参数可通过直接测量进行验证，而丝素溶液的体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）	Sigma-Aldrich	8.04515	注意：具有危险性。用于溶解冻干丝素蛋白
24孔板	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	孵育期间用于承载细胞的支架储存
4T1-iRFP720 小鼠三阴性乳腺癌细胞	维也纳大学大分子癌症治疗实验室（MMCT）	N/A	细胞培养实验；4T1-iRFP720 由实验室内部从亲本细胞 4T1（ATCC: CRL-2539）衍生而来
4T1-wt 小鼠三阴性乳腺癌细胞	维也纳大学大分子癌症治疗实验室（MMCT）	ATCC: CRL-2539	细胞培养实验
Bruker Alpha Compact 傅里叶变换红外光谱仪，配备 Platinum-ATR 采样模块	Bruker	A220/D-01	傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析
氯化钙，无水，≥93% 分析纯	Sigma-Aldrich	902179	用于制备溶解基质
细胞培养瓶，T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	耗材；用于细胞培养
细胞培养瓶，T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	耗材；用于细胞培养
Centrifuge 5804 R 离心机	Eppendorf	5805000010	用于样品的离心分离
组合塞（雌性鲁尔锁接头）	Braun Melsungen AG	4495101	用于平台组装
葫芦素 E	Sigma-Aldrich	SML0577	细胞迁移抑制剂
皮肤活检打孔器，ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	用于获取圆柱形海绵支架
透析管（3.5 kDa，纤维素）	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	用于丝素蛋白溶液的透析
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）	Sigma-Aldrich	D8537	用于细胞维持
乙醇，绝对纯	Merck	1.07017	用于制备溶解基质
Excel	Microsoft	v2604	数据整理、基础计算与绘图
胎牛血清（FCS），热灭活	Biowest	S181H-500	细胞培养基的补充剂
Fiji（原 ImageJ）	开源软件（https://imagej.net/software/fiji/）	N/A	图像处理与分析
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	统计分析与图表生成
日立 L-7120 LaChrom 高效液相色谱泵	Merck	K-5244	用于组装平台中的动态培养条件
IVIS 200 Spectrum CT 系统	PerkinElmer	128201	具备 CT 功能的光学成像系统
IVIS Living Image 软件	PerkinElmer	v4.5.2	用于 IVIS 成像数据的采集、可视化与定量分析的软件
JEOL JSM-6510 扫描电子显微镜	JEOL GmbH	JSM-6510	扫描电镜（SEM）图像
L-谷氨酰胺，200 mM 溶液，适用于细胞培养（L-Glu）	Sigma-Aldrich	G7513	细胞培养基的补充剂
Alpha 2-4 LD Plus 冷冻干燥机	Martin Christ	101542	用于丝素蛋白的冷冻干燥
雄性鲁尔锁接头	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	样品储液器的适配器
甲醇，≥99.9%，HPLC 梯度级	Carl Roth	7342.1	注意：有毒。用于诱导丝复合材料中 β-折叠结构的形成
无筛板的光学透明固相萃取（SPE）管	Sigma Aldrich	57240-U	用于平台组装
OPUS 光谱软件	Bruker	v7.5	傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析
轨道与线性摇床 MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	均匀分布/混合
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	用于密封/包裹培养板和容器以进行储存（例如冷藏）
青霉素-链霉素溶液，液体，适用于细胞培养（P/S）	Sigma-Aldrich	P0781	细胞培养基的补充剂
培养皿，9 cm	VWR	391-0598	用于盐床海绵浇铸；用于在丝素支架上接种细胞
适用于 1 mL SPE 管的聚乙烯筛板	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	用于平台组装
RPMI-1640 培养基，适用于细胞培养	Sigma-Aldrich	R0883	添加补充剂的培养基用于丝素海绵的平衡、细胞培养维持及相关实验
移液管，10 mL	Sarstedt	86.1254.025	耗材；用于细胞维持
移液管，25 mL	Sarstedt	86.1685.020	耗材；用于细胞维持
移液管，5 mL	Sarstedt	86.1253.025	耗材；用于细胞维持
家蚕（Bombyx mori L.）蚕茧	保加利亚瓦尔纳蚕业与农业实验站	N/A	丝素蛋白海绵制备的原材料
碳酸钠，无水，≥99.5%，ACS 级	VWR	11552.A3	用于化学脱胶，即去除丝胶蛋白
氯化钠，≥98%，工业级	VWR	27788.366	用于盐床海绵浇铸
SPE 柱推杆	Carl ROTH	36P9.1	用于平台组装
不锈钢分析筛，500 µm（ISO 3310-1）	ATECHNIK GmbH	200.050.222-046	用于氯化钠筛分
不锈钢分析筛，800 µm（ISO 3310-1）	ATECHNIK GmbH	200.050.222-051	用于氯化钠筛分
无菌输液管路（管道），150 cm，聚乙烯（PE）	Fresenius Kabi	9004132	用于动态培养条件
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T3924	用于细胞维持
超高速离心管，15 mL，无菌	VWR	525-0605	耗材；用于离心、冷冻和储存
超高速离心管，15 mL，非无菌	VWR	525-1083	耗材；用于离心、冷冻和储存
超高速离心管，50 mL，无菌	VWR	525-0609	耗材；用于离心、冷冻和储存
超高速离心管，50 mL，非无菌	VWR	525-1098	耗材；用于离心、冷冻和储存
尿液样本杯	Brand	758905	用于丝素溶液制备的容器
LaboStar 10 RO DI 纯水系统	Evoqua Water Technologies LLC	W3T324493	去离子水（ddH2O）来源