长时间精液暴露过程中精子活力与DNA完整性的时变性下降

摘要

射精后精液暴露时间延长，精子DNA碎片率增加，活动力显著下降。在14份正常样本中，DNA碎片率在1小时、2小时和4小时分别增加了5.5%、11.5%和16.1%，同时精子活动力下降。这些结果提示，对于异地精液采集和处理，应尽量减少延迟。

摘要

精子DNA碎片化已知会对精子质量产生不利影响，进而对辅助生殖技术（ART）周期产生负面影响。通过在不同时间点检测精液中精子DNA碎片化（SDF），可以了解精液在长时间暴露条件下对精子DNA完整性的潜在影响。在本项初步研究中，采用精子染色质扩散法对14份正常精液样本进行了SDF检测，以模拟异地精液采集条件下的实际情况。对检测过程中各时间点的DNA碎片化百分比进行统计分析后发现，从射精到精液分析期间精液长时间静置会显著增加DNA碎片化程度。精子平均活力在采集后1小时显著下降7.4%，2小时下降14.5%，4小时下降18.7%；而平均SDF值在采集后1小时显著上升5.5%，2小时上升11.5%，4小时上升16.1%。精子质量随时间推移而下降的现象，可能为生育诊所制定ART周期中精子处理方案提供参考依据，尤其是在精液采集地点远离男科实验室的情况下。实验室可考虑建立接收异地采集精液的可接受时间阈值。

引言

世界卫生组织（WHO）指出，全球有六分之一的人口（即17.5%）在其一生中的某个阶段会经历不孕不育¹。约20%的不孕症病例仅由男性因素不育导致，另有30%至40%的病例中男性因素作为次要诊断²。即使在健康男性中，精液参数在个体之间也可能存在显著差异，包括浓度、活力、形态和存活率的波动³。因此，了解影响男性生育力的具体因素，对于在临床环境中提供恰当治疗至关重要。

一个正在发展的研究领域是精子DNA完整性对辅助生殖技术（ART）周期的影响^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}。世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》第5版指出，精子DNA碎片化（SDF）（无论是单链或双链断裂）可能影响胚胎发育、着床及妊娠结局¹⁴。Muriel 等人对SDF进行了分析，发现SDF升高会导致ART周期中的受精率、胚胎质量及着床率下降¹⁰。然而，仍需更深入地了解导致DNA碎片化的因素。

既往研究表明，氧化应激可导致精子活力下降、酶的生成与功能受损，尤其是DNA损伤⁸。此类DNA损伤可能包括但不限于基因缺失、错义翻译以及精子DNA碎片化（SDF）。目前临床上使用SDF检测来评估精子DNA的完整性。尽管已有研究将冷冻保存、处理培养基以及氧化应激与SDF相关联，但对于从射精到分析这段时间内SDF的变化仍知之甚少^4,5。考虑到辅助生殖技术（ART）周期中家庭精子采集用于精子处理的情况日益普遍，从射精到分析的这段时间在精子生命周期中尤为关键¹⁵。在COVID-19大流行期间，家庭采集精子的方式变得越来越受欢迎，因其可减少与患者的直接接触，并提高舒适性与便利性。然而，目前尚无明确指南建议家庭采集样本从射精到分析的最佳时间间隔。因此，本研究的主要目的是明确在静置的精液中，SDF是否会随时间发生变化，以及这些变化是否对ART样本的处理具有实际意义。

方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行，并获得了大学医院机构审查委员会的批准（STUDY20201371）。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。共选取了来自俄亥俄州东北部一家学术性生育中心的14份精液样本。本实验中分析的所有样本均在本机构现场采集。由经过全面培训的男科技术人员按照制造商说明书对精液样本进行精子染色质扩散检测，以尽量减少人际差异。使用该试剂盒时，将完整、未固定的鲜精精子浸入经预处理载玻片上的惰性琼脂糖微凝胶中，随后在4 °C下冷却5分钟，使微凝胶固化。首先进行酸处理，以变性DNA碎片化精子细胞中的DNA，然后加入裂解缓冲液以去除核蛋白。用蒸馏水洗涤后，载玻片经梯度乙醇溶液脱水并自然风干。使用试剂盒提供的染色液染色后，在光学显微镜下观察，无DNA碎片的精子表现为具有较大扩散晕的核小体（晕的直径大于核心直径的1/3），而有DNA碎片的精子则表现为较小的晕（晕的直径小于核心直径的1/3）或无晕。精子DNA碎片率以具有DNA碎片和退化形态的精子数量占总数的百分比表示。每张载玻片上计数总计300个精子，将其分类为具有大或中等扩散晕，或无扩散晕。该计数重复两次以评估技术变异性，最终结果取两次计数的平均值。该试剂盒的诊断敏感性和特异性均为93%，每次实验均包含阳性和阴性对照。精液样本在0、1、2和4小时（0小时定义为37 °C下液化后15分钟）进行评估，并在室温（22–25 °C）下保存。

在0、1、2和4小时对每个样本进行额外的活动力分析。活动力评估由经验丰富的男科医师通过一次性计数板采用计数法完成。每个网格计数300个活动精子，重复计数两次。根据两次重复计数结果计算活动精子的平均浓度。

采用重复测量方差分析（ANOVA）对各个时间组进行比较。当检测到显著的总体效应时，采用Tukey的诚实显著性差异（HSD）检验进行事后两两比较。以 p 值 < 0.05 为具有统计学显著性。材料的详细信息汇总于材料表中。

结果

为了评估精液长时间暴露对精子活力和DNA碎片化的影响，共采集了14份精液参数正常的患者样本，并在采集后的四个时间点进行分析。根据世界卫生组织第五版^th edition¹⁴的精液分析标准，所分析的样本均属于“正常”范围。所有样本均在本生育中心现场采集，以确保各时间点分析参数的准确性。患者的平均年龄为35.4岁（24–45岁）。该组样本的初始精液参数结果显示，平均精液体积为3.7 mL，平均浓度为42.2百万/mL，平均活力为46.9%，平均正常形态率为4%，所有样本经定性检测均未检出白细胞（表1）。

随着时间的推移，精子活力呈进行性下降。与基线水平（0 h）相比，1 h时平均精子活力下降了7.4%（范围为3–16%），2 h时下降了14.5%（范围为4–31%），4 h时下降了18.7%（范围为8–37%）。精子活力随时间呈持续下降趋势，从基线时的58.6%降至暴露4 h后的42.5%（图1）。总体而言，不同时间点之间的活力下降具有统计学显著性（p = 0.0001585）。同时，精子DNA碎片率（SDF）在精浆中随着孵育时间延长而显著升高。SDF均值从基线时的15.6%上升至1 h时的21.1%、2 h时的27.1%以及4 h时的31.7%。相对于基线水平，SDF在1 h时升高了5.5个百分点（范围为4–8个百分点），2 h时升高了11.5个百分点（范围为8–16个百分点），4 h时升高了16.1个百分点（范围为13–22个百分点）。与基线相比，所有后续时间点的SDF升高均具有统计学显著性，包括1 h（p = 0.021129）、2 h（p < 0.00001）和4 h（p = 0.000018）（Table 2）。

数据可用性
用于分析的个体患者活动力和SDF数据见补充表S1。

图1。射精后随时间变化的精子活力改变。 在基线以及精液暴露后1 h、2 h和4 h时评估精子活力。随着暴露时间的延长，精子活力呈进行性下降。请点击此处查看该图的放大版本。

参数	平均值	标准差
患者年龄	35.4（范围，24–45 岁）	6.22
精液量	3.7 mL	2.18
浓度	42.2 百万/mL	33.45
活动力	46.9%	18.77
白细胞	阴性（全部）	—
形态学	4.0%	0.77

表1：研究样本的基线精液特征。 精液参数在精液液化后、进行时间依赖性精子DNA碎片率和精子活力评估前记录。

时间	0 h	1 h	2 h	4 h
0 h 后平均精子活动力下降值*	—	-7.4%	-14.5%	-18.7%
平均精子DNA碎片率（SDF）	15.6%	21.1%	27.1%	31.7%
标准差	5.28%	5.27%	5.31%	4.80%
与 0 h 比较的 P 值	—	p = 0.021129	p < 0.00001	p = 0.000018
*采用Tukey HSD事后检验的重复测量方差分析。

表2： 精子DNA碎片率和活力的时间依赖性变化。 在基线以及精液暴露后1 h、2 h和4 h时评估精子DNA碎片率和活力。数值以作者报告的形式呈现，统计学比较均相对于基线进行。

补充表 S1. 患者水平的精子活动力差异和精子DNA碎片化指数值。 数值以比例形式表示；乘以100可转换为百分比。请点击此处下载该文件。

讨论

在本实验所包含的样本中，SDF 随时间推移而升高，而精子活力在同一时期内下降。这表明，在射精与分析或处理之间的时间间隔较长时，精液处于停滞状态可能会导致精子DNA完整性降低。样本在分析前停滞时间的延长可能增加了暴露于氧化应激相关环境的风险。如前所述，氧化应激可能对精子DNA质量产生不利影响，导致高水平的DNA片段化^6,8,13。本研究的结果可能为辅助生殖技术（ART）周期中的精液处理提供参考依据。

首先，临床机构或许值得将该检测加入传统精液分析参数中，以确保在辅助生殖技术（ART）周期中使用精子前的精子DNA质量。优化精子质量可能与改善的临床结局相关，例如冷冻胚胎数量增加、整倍体率提高以及临床妊娠率和活产率上升，既往研究已报道过此类结果¹⁶。

其次，这些结果揭示了在家采集精液对辅助生殖技术（ART）结局的影响。在新冠疫情期间，许多诊所开始采用家庭精液采集作为对患者更安全的选择^15,17。随着这一实践的推广，患者不仅有机会减少新冠病毒的暴露风险，还能在自己家中私密地完成采样。然而，我们的研究结果表明，这种临床实践的转变可能伴随着精子质量以及潜在ART结局方面的权衡。

先前关于居家精液采集套件的研究表明，对于患有不同男性因素不育症且通常产生“正常”精液样本的男性，其精液分析结果存在较大波动。¹⁸这种波动可能是由于精子从家中运送至诊所过程中出现停滞所致，尤其是在某些情况下隔夜运输精液样本时。其他研究也支持我们的结果，即在精子制备后（无论是冻融精子）于37°C、5% CO2条件下孵育的最初3–4小时内，精子DNA碎片率（SDF）会迅速升高¹⁹ 或新鲜精子²⁰，提示在辅助生殖技术中，精子样本在制备后应尽快使用。

Kerdtawee 等人对精子采集地点对精液参数和生育结局的影响进行了荟萃分析。尽管他们未发现家庭采集样本与诊所采集样本之间存在显著差异，但注意到所纳入研究之间存在显著的异质性，而这些研究大多为观察性研究¹⁶。重要的是，这些研究并未对家庭采集的样本应在何时送回诊所并进行分析设定统一的控制时间线。然而，本研究中分析的数据使得能够在多个时间点对DNA片段化进行受控分析，从而提高了实验结果的精确性和一致性。

尽管在家采集对某些患者可能是一种选择，但了解SDF的发生率有助于制定指南，以识别那些在家采集可能对辅助生殖技术（ART）结局产生不利影响的患者。Christoforaki等人进行的一项系统综述和荟萃分析发现，精液中的氧化还原电位对男性不育具有负面影响²¹。所分析的参数包括精子浓度、数量、活力和形态，这些指标均受到较高氧化还原电位的不利影响，表明精子质量可能受氧化应激的影响。

本研究的优势在于其新颖性，因为很少有研究评估长时间暴露于精液中时精子DNA碎片率（SDF）的时变情况。此外，本研究在受控条件下进行，研究对象为一组相对同质且无潜在精液病理的男性。然而，本研究的局限性在于样本量较小，仅包含14名患者。未来还需开展更多实验，以提高对所收集数据点及结论性论述的信心。

未来的研究还应探讨可能影响精子DNA碎片率（SDF）的各种变量，以更深入地理解维持精子质量的相关因素。需要考虑的因素包括但不限于精子制备过程中使用的处理培养基、从家庭到诊所运输过程中的温度条件、冷冻保存方法以及男性患者的潜在健康状况。全面了解影响SDF的因素，最终将有助于医疗机构优化其操作指南，并在制定辅助生殖技术（ART）患者治疗方案时做出更科学的决策。

观察到的精子质量下降呈现出明显的时间依赖性模式，表现为在精液中长时间暴露后，精子活力下降，DNA碎片率上升。值得注意的是，在储存2–4小时后，精子DNA碎片率（SDF）超过30%，活力较基线水平下降近五分之一，此时退化最为显著。这些结果表明，射精与精液处理之间的时间延迟可能对精子功能完整性产生负面影响，支持应尽量减少辅助生殖技术（ART）中异地采集样本的运输和处理时间。男科实验室可考虑为患者建立并传达一个可接受的样本送达时间阈值，特别是在准备进行宫腔内人工授精（IUI）或体外受精（IVF）的情况下。在ART中，若精液样本在男科实验室以外地点采集，应将射精至精液分析和/或处理的时间纳入SDF评估的考虑因素。

由于本研究样本量较小，存在一定的局限性，未来的研究应评估长期精液暴露对不同精液质量类别（包括精液参数异常男性的样本）中精子DNA碎片率（SDF）的影响。此外，还需要开展前瞻性随机对照试验，以明确SDF是否随时间推移而升高，并进而导致辅助生殖技术（ART）临床结局的显著差异，包括受精率、胚胎发育、着床率、妊娠率、流产率和活产率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
方差分析计算器	Statistics Kingdom		统计分析 https://www.statskingdom.com/anova_manova.html
Halosperm G2	Halotech	HT-HSG2	用于检测精子DNA碎片化的体外诊断试剂盒 https://halotechdna.com/en/producto/halosperm-g2/
Microcell	Vitrolife	15423	用于精液分析的一次性计数室 https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
白细胞/pH试纸质控品	Medical Electronic Systems	A-CA-01752-00	QwikCheck白细胞检测试纸的阳性和阴性质控品 https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/
QwikCheck 白细胞/pH检测试剂条	Medical Electronic Systems	0700	用于测定精液中的白细胞（WBC） https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/