为了模拟炎症信号如何影响遗传易感生物体的神经发育，我们提供了一种将IL-6微量注射到斑马鱼幼鱼库维埃管（总主静脉）的实验方案，可在结节性硬化症（TSC）背景下实现炎症的可控诱导，并评估其对发育的影响。
本文内容
摘要
摘要
结节性硬化症复合体患者（TSC1/TSC2 基因突变）表现出自闭症谱系障碍（ASD）的可变外显率，而母体免疫激活已知会增加 ASD 风险。白细胞介素-6（IL-6）是一种多效性细胞因子，在免疫调节、炎症及神经炎症过程中具有明确作用。IL-6 由多种免疫细胞在感染或组织损伤后产生，通常被视为促炎介质。值得注意的是，IL-6 可穿过血脑屏障，并已被证实参与神经炎症以及与炎症相关的神经精神疾病，包括自闭症谱系障碍（ASD）和智力障碍（ID）。本文介绍了一种通过将 IL-6 注射至库维埃管以在斑马鱼体内诱导系统性炎症信号的实验方案。该方法可实现可控且可重复的炎症反应，用于研究炎症驱动的早期发育变化。本方案详细阐述了 IL-6 制备、显微注射以及在疾病与神经炎症斑马鱼模型中后续实验应用的关键步骤，包括旨在探究基因-环境相互作用的研究。通过实现对系统性炎症信号的可控诱导，该方法为研究遗传易感性与炎症暴露如何共同影响发育结局提供了一个多功能平台。
引言
了解炎症信号如何影响早期神经发育，对于解析神经发育障碍（尤其是在遗传易感背景下）的潜在机制至关重要。本方案的主要目标是提供一种精确且可重复的方法，通过将白细胞介素-6（IL-6）直接显微注射到屈维耶管（即总主静脉）中，以在斑马鱼幼鱼体内诱导全身性炎症信号。
结节性硬化症复合体（TSC）是基因-环境相互作用的典型例子。TSC 是一种罕见的遗传性疾病，由 TSC1 或 TSC2 基因突变引起，这两个基因分别编码 hamartin 和 tuberin 蛋白，二者形成一个复合物，正常情况下可抑制 mTORC1 信号通路。该抑制作用的丧失会导致 mTORC1 通路过度激活，从而引发异常的细胞生长以及一系列临床表现，包括自闭症谱系障碍（ASD）1,2。据估计，在发达国家，约有 1.5% 的个体患有 ASD，平均诊断年龄约为 3 岁3。ASD 的特征表现为重复性行为、社交互动障碍以及认知灵活性下降4，患者常伴有其他神经行为问题，如焦虑、抑郁或智力障碍3。值得注意的是，40%–60% 的 TSC 患者表现出与 ASD 相关的特征2，但症状严重程度差异显著——即使在具有相似突变的患者之间也存在较大差异，提示环境因素可能调节由遗传因素驱动的疾病风险。
其中一个因素是炎症。尽管自闭症谱系障碍（ASD）的病因在很大程度上仍不清楚，但多个脑区的神经炎症长期以来被认为与其相关5。越来越多的临床前和临床证据表明，由母体免疫激活（MIA）引发的胎儿神经炎症以及随之升高的细胞因子信号传导可能在ASD的发病机制中起重要作用6。因此，在TSC等遗传易感系统中模拟炎症性细胞因子暴露，为研究免疫信号如何与失调的mTORC1调控相互作用进而影响早期脑发育提供了一个强有力的框架。
本方案的制定依据源于日益增多的认识：细胞因子介导的炎症（包括IL-6信号通路）可与遗传易感性相互作用，从而影响神经发育轨迹。细胞因子是一类低分子量糖蛋白，可协调免疫系统内部的通讯。在自闭症谱系障碍（ASD）中，多项研究一致报道外周血中促炎性细胞因子（包括IL-6）水平升高7,8,9,10，支持了IL-6信号失调可能参与该疾病特征性神经发育和行为表现的假说。IL-6是一种关键的免疫激活介质，由多种免疫细胞在感染或组织损伤时产生。由于IL-6能够穿过血脑屏障并直接影响神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，该细胞因子的持续升高被认为可改变神经发育通路、突触可塑性以及神经免疫稳态——这些机制在ASD病理生理学研究中正受到越来越多的关注11,12。母体免疫激活（MIA）研究进一步加强了这些关联，妊娠期间母体IL-6水平升高会干扰胎儿大脑发育，并增加ASD相关风险13。然而，现有的脊椎动物模型通常依赖于通过病原体相关分子或母体暴露范式进行全身性免疫刺激，这可能引入变异性，同时激活多条免疫通路，限制了对IL-6特异性作用的独立评估。在斑马鱼中直接进行IL-6微量注射可克服这些局限性，能够在透明且遗传操作便利的生物体中实现对单一细胞因子的靶向操控。
斑马鱼在研究细胞因子驱动的发育效应方面具有多种优势。其身体透明性使得能够实时观察免疫和神经反应；快速的发育过程便于进行高通量实验；而其保守的细胞因子信号通路使其成为解析炎症机制的有力脊椎动物模型14,15,16,17,18。在实验研究中，需要将外源性物质（如细菌、癌细胞、DNA、纳米颗粒等）递送至斑马鱼幼体。一种方法是将幼体暴露于含有目标物质的溶液中，使其通过皮肤、鳃或胃肠道被动吸收。第二种更为直接的方法是显微注射，即使用精细的玻璃针将外源物质注入特定的胚胎或幼体腔室19,20,21。值得注意的是，向柯氏管（duct of Cuvier）进行显微注射可实现可靠的系统性递送，确保IL‑6迅速分布至全身循环，同时避免整个生物体免疫激活带来的干扰效应。
在本实验方案中，我们详细介绍了一套从注射器制备到通过受精后2天和3天（dpf）斑马鱼幼鱼的库维叶管将IL-6注入血液循环的逐步操作流程。该方法特别适用于研究特定炎症信号如何影响早期发育过程、神经发育或免疫相关疾病模型中的基因-环境相互作用，以及细胞因子暴露所引发的细胞与分子效应的研究人员。 体内，或基因突变与炎症信号通路之间的相互作用。通过提供一种可控、细胞因子特异且发育阶段精确的方法，本方案为研究IL-6及相关免疫信号如何影响早期免疫、神经及行为结局的机制提供了一个多功能的平台。
方案
本实验所采用的斑马鱼品系为 tsc2vu242/+22,23。所有实验均依照相关法律法规进行，由于所使用的发育阶段（<5 dpf）不在强制伦理审查范围之内，因此无需额外的伦理委员会审批。图1展示了本实验方案的示意图。
1. 玻璃微电极的拉制
- 使用拉针仪按照既定操作步骤，从硼硅酸盐玻璃毛细管制备显微注射针24。
- 使用10 cm长的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.0 mm，薄壁型），并将其装入拉针仪中。
- 小心地将毛细管置于拉针仪的载具内，确保其精确对齐指定凹槽，并使用仪器夹具牢固固定，以防止拉制过程中发生移动。
- 调整毛细管位置，使其位于加热丝中央，确保待拉伸区域受热均匀，从而获得一致的针尖形态。
- 启动拉针程序，使用优化参数（例如，Sutter仪器参数设置为：加热值533，拉力50，速度60，延迟90，气压200），以制备尖端精细的显微注射针。
警告：由玻璃毛细管拉制而成的微针较为脆弱，容易破裂、堵塞或形成不规则的针尖形状，从而影响注射体积。使用前应在体视显微镜下仔细检查每根针，避免针尖接触硬质表面，一旦发现阻力增大、液体泄漏或液滴大小不一致，应立即更换针头。
注：拉制完成后，毛细管两端将形成锥形针尖。使用前应在体视显微镜下用精细镊子轻轻折断针尖，以精确控制开口大小，满足显微注射的需求。
2. 缓冲液和储备溶液的配制
- 配制 E3 胚胎培养基的 60× 储存液（见表 1）。通过高压灭菌法对溶液进行灭菌，并于 4 °C 保存。使用时，将储存液用超纯水稀释，得到 1× E3 工作液。
注意：E3 胚胎培养基的 60× 储存液可在 4 °C 长期保存。 - 按照表 1所述方法配制 20× 三卡因（MS-222）储存液。将溶液置于 4 °C 避光保存，以防降解。使用前，用 E3 培养基稀释至 1× 工作浓度。
注意：使用 1 M Tris（pH 9.0）将三卡因储存液的 pH 调整至 7.5。该溶液可分装后于 -20 °C 冷冻保存以实现长期储存，或在 4 °C 保存。三卡因在室温及光照下会降解为有毒化合物。
警告：使用三卡因（MS-222）进行麻醉时需格外小心，因为麻醉不足或过量均可能对幼鱼的生理和行为产生不利影响。过量暴露可抑制心脏功能并改变后续行为，而麻醉不足则会增加固定过程中的损伤风险。应仅使用最低有效浓度和最短持续时间，并在行为学检测前将幼鱼置于新鲜胚胎培养基中使其完全恢复。 - 将琼脂糖在 E3 培养基中加热至完全溶解，配制成 1%（w/v）的琼脂糖溶液。
注意：若提前配制，可于 4 °C 保存，并在使用前重新加热。实验当天，应将琼脂糖维持在 55–60 °C 的液态，以防提前凝固。 - 配制 0.9%（w/v）的 NaCl 溶液，可在室温下保存最多 1 周，或于 4 °C 长期保存。使用前，将溶液平衡至室温，或在 28.5 °C 孵育，以匹配胚胎的生理条件。
- 用 0.9% NaCl 溶液配制 2 pg/nL 的 IL-6 溶液。分装保存以避免反复冻融，并于 -20 °C 储存。使用前将其解冻并恢复至室温。
- 用超纯水配制 20 mg/mL 的蛋白酶原液，再用 E3 培养基稀释配制成 0.5 mg/mL 的工作液。
3. 获取胚胎并培育至受精后2天
- 通过将多条 tsc2vu242/vu242 成年斑马鱼放入产卵缸中，建立群体产卵体系。
注意：可使用隔板在夜间将雄鱼和雌鱼分隔，以防止过早产卵；次日早晨移除隔板，诱导同步交配。或者，也可将斑马鱼饲养在光照可控的环境中，利用黑暗（夜间）到光照（早晨）的转换作为产卵信号，无需使用隔板。 - 次日，移除隔板（如使用），并让产卵过程持续约 1 小时。
- 及时收集受精胚胎，并转移至含有 40 mL E3 胚胎培养基的 100 mm 培养皿中，每皿胚胎密度不超过约 60 枚，以确保最佳发育条件。
- 将胚胎在 28.5 °C 下孵育，维持每日 14 小时光照和 10 小时黑暗的可控光周期。
- 在受精后 1 天（1 dpf）和 2 天（2 dpf），于体视显微镜下检查胚胎，移除死亡胚胎、未受精卵及碎片，以维持培养质量。
- 更换为新鲜的 E3 培养基，以减少代谢废物积累，支持胚胎正常发育。
4. 制备用于显微注射和去壳的琼脂糖平板
- 在 E3 培养基中配制 1% (w/v) 琼脂糖溶液，加热至琼脂糖完全溶解，溶液变为透明。
- 让溶液短暂冷却，然后将约 30 mL 倒入 100 mm 培养皿中，确保表面形成均匀的一层。
- 在琼脂糖仍为液态但开始凝固时，将硅胶模具轻轻放置于表面，以形成均匀的凹槽。
注意：此处使用具有锥形图案的硅胶模具（图 2），用于制备可容纳显微注射过程中多余 E3 培养基的孔穴。这些孔穴设计用于在操作和注射期间提供短暂的稳定性，通过保持足够的湿度防止胚胎干燥，从而在标准培养条件之外维持胚胎活力数分钟。 - 通过倒入约 5 mL 熔融的 1% (w/v) 琼脂糖溶液，并轻轻旋转 50 mm 直径的培养皿以均匀覆盖表面，制备用于酶法去壳的琼脂糖包被培养皿。
- 去除多余的琼脂糖。
- 在室温下静置 10–15 分钟，使琼脂糖完全凝固。凝固后，培养皿即可用于胚胎的酶法去壳处理。
5. 对 2 天龄幼鱼进行酶法去膜
- 将约100个处于绒毛膜中的2 dpf胚胎转移至一个小型（50 mm）琼脂糖包被的培养皿中。
- 尽可能去除E3培养基，以最大限度减少对酶溶液的稀释，确保去绒毛膜效率。
- 向培养皿中加入4 mL新配制的蛋白酶K溶液（储备浓度：20 mg/mL [溶于超纯水]，工作浓度：0.5 mg/mL [用E3稀释]），确保胚胎完全浸没。
注意：必须严格控制蛋白酶K处理时间，过度消化可能损伤幼鱼组织，导致操作过程中脆弱性增加，并可能影响存活率或行为表现。应仅使用最低有效暴露时间，处理后彻底清洗胚胎，以防止酶活性持续作用。 - 在室温下孵育3–5分钟，并在体视显微镜下观察胚胎从绒毛膜中释放的情况。
- 间歇性轻轻旋转或晃动培养皿，以促进酶解去除绒毛膜。持续操作直至大多数胚胎脱离绒毛膜。
注意：确保裸露的胚胎始终浸没在溶液中；否则卵黄囊可能破裂，导致胚胎死亡。 - 完成去绒毛膜后，通过将胚胎转移至5–6次新鲜E3培养基中进行充分洗涤。
注意：确保裸露的胚胎始终浸没在溶液中；否则卵黄囊可能破裂，导致胚胎死亡。 - 确保彻底清除所有绒毛膜残余和蛋白酶K残留，以防止对幼鱼造成损伤，并维持最佳培养条件。
- 使用玻璃巴斯德吸管将约50个去绒毛膜的幼鱼转移至含有40 mL E3培养基的100 mm培养皿中。
- 在微注射前，将幼鱼维持在此条件下培养。
6. 注射斑马鱼胚胎
- 在体视显微镜下（放大倍数 ≥150×），使用精细镊子小心折断拉制好的玻璃毛细管尖端（第1节），制备出直径约为 3 µm 的微吸管开口。
注意：合适的微吸管应具备细小的开口，尖端无明显压扁或大面积开放。若尖端断裂过宽，则难以有效穿透鱼体皮肤，可能导致注射效果差或不一致。因此，应在高倍体视显微镜下仔细操作，确保仅在毛细管最末端产生微小且可控的断裂。 - 配制注射溶液：0.9% (w/v) NaCl（对照组）或含 IL-6（2 pg/nL）的 0.9% NaCl 溶液，并在每 10 µL 溶液中加入 1 µL 0.1% 台盼蓝，以便在注射过程中便于观察。
- 使用微量加样吸头将约 3 µL 注射溶液从后端填充至已制备的微吸管中，确保不引入气泡。
- 将装有溶液的微吸管固定于连接至显微注射系统的毛细管夹持器中（图2）。
- 在校准载玻片上滴加少量矿物油。
- 通过将液滴排出至矿物油中，并使用带 0.01 mm 刻度的校准载玻片（图2）测量其直径来校准注射体积。调节注射压力（300–500 hPa 之间），使液滴体积达到约 1 nL。
- 向含有幼鱼的 E3 培养基中加入三卡因（MS-222），终浓度为 1×，用于麻醉。为减少应激并确保镇静效果一致，建议分小批量处理幼鱼。
- 将单个 2 dpf 幼鱼转移至凝固的琼脂糖注射板上。根据操作能力，每个培养皿可放置多条幼鱼（例如最多 10 条）。
- 将培养皿置于体视显微镜下，用玻璃移液管轻轻调整每条幼鱼的方向，使其Cuvier管清晰可见且易于接近。
注意：处理多条幼鱼时，应定期滴加含三卡因（1×）的 E3 培养基，以保持琼脂糖表面湿润，防止干燥。 - 将微吸管尖端定位至 Cuvier 管的入口处（如 图3 所示），可通过在体视显微镜下追踪流向心脏的血细胞运动来识别该位置。
- 向 Cuvier 管内连续注射两滴（每滴约 1 nL）预先配制的溶液，两次注射间隔约 20 秒，以确保溶液充分分布。
- 注射完成后，轻柔地将幼鱼从琼脂糖板转移至含有 40 mL E3 培养基的新鲜 100 mm 培养皿中。转移过程中应尽量减少机械应力。
- 将幼鱼放回 28.5 °C 的培养箱中恢复。
- 次日（3 dpf），按照步骤 6.8–6.13 所述重复显微注射操作。
注意：单次注射仅产生短暂的信号激活，且无稳定的行为反应；而第二次注射可确保在与神经发育相关的早期幼体发育窗口期内持续激活炎症通路，并引发如代表性结果部分所述的行为变化。 - 在 5 dpf 时，将幼鱼用于后续实验，包括行为学检测、脑成像或免疫荧光分析。
结果
为了评估IL‑6微量注射对幼鱼生理和行为的影响，我们比较了注射IL‑6的幼鱼与注射NaCl的对照组在存活率以及两种常用于评估斑马鱼类似焦虑和重复性行为的行为指标上的表现。图4A显示，与注射NaCl相比，IL‑6微量注射对幼鱼存活率无显著影响。在5 dpf时，IL‑6注射组与NaCl注射组的存活率无显著差异，表明该给药方案耐受性良好，未引起非特异性毒性。与未注射的同胞相比，微量注射操作本身轻微降低了存活率，提示该操作对幼鱼存在一定程度的处理相关影响，但与IL‑6暴露无关。上述结果证实该实验方案适用于后续的行为学分析。
为了验证IL-6微量注射范式在5 dpf时可诱导可测量的炎症反应，我们定量分析了前列腺素E2（PGE2），这是一种细胞因子驱动的炎症信号通路的下游介质25。tsc2-/-纯合突变体即使未注射IL-6，其基础PGE2水平也升高，显著高于野生型（WT）tsc2+/+同胞（图4B）。tsc2+/-杂合突变体与WT幼鱼相比，其基础PGE2水平仅有轻微但无统计学意义的升高；但重要的是，在IL-6微量注射后，其PGE2水平显著上升。该模式符合我们对基因×环境相互作用建模的目标：野生型幼鱼对轻度、短暂的IL-6暴露基本不受影响，而具有遗传易感性的tsc2+/-突变体则表现出明显的炎症反应。
与这些基因型依赖性的炎症状态差异一致，我们接下来探讨了IL-6诱导的信号传导是否在开放场实验中转化为可测量的行为变化。如前所述22，在5 dpf时进行的开放场实验显示，与野生型（WT）同胞相比，tsc2突变型幼鱼表现出更明显的类似焦虑行为（图4C）；然而，IL6的微量注射并未影响该行为。具体而言，tsc2+/-和tsc2-/-幼鱼在开放场外周区域停留的时间显著更长，且对中心区域的探索减少，与斑马鱼幼鱼中已确立的焦虑相关表型一致。
IL-6 注射增加了重复性、刻板的游泳模式，尤其是在 tsc2+/- 突变型幼鱼中（图 4D–E），这种行为特征在斑马鱼模型中常被用作与自闭症谱系障碍（ASD）相关的表型读数26。对重复性环形游动（定义为三次或以上连续的环形游泳）进行的详细量化分析显示，与注射 NaCl 的对照组相比，注射 IL-6 的 tsc2+/- 突变体表现出该行为的比例显著增加。这种在遗传易感性幼鱼中重复性游泳行为的选择性增强进一步支持了基因与环境的相互作用，即轻度炎症刺激特异性地在 tsc2+/- 突变背景下揭示或放大了类似 ASD 的行为倾向。
图1：实验方案示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：显微注射工作站设置。用于斑马鱼幼体注射的显微注射工作站示意图。（1）安装在注射器固定架上的玻璃微量移液管；（2）带有琼脂糖涂层并模制有定位凹槽的培养皿，用于固定幼体；（3）用于校准的矿物油；（4）台盼蓝溶液；（5）拉制的玻璃针；（6）校准载玻片；（7）延长型移液管吸头；（8）巴斯德移液管；（9）硅胶模具。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：向库瓦氏管注射。（A）幼年斑马鱼库瓦氏管（即前主静脉）注射位点的示意图，以及5天龄幼鱼在开放环境中的典型运动轨迹。（B）对照组（未注射）、NaCl注射组和IL-6注射组的代表性图像。比例尺：250 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：利用 tsc2 突变品系展示基因与环境相互作用的代表性结果。 （A）在实验过程中，tsc2vu242 幼鱼在对照组（未注射）、NaCl 注射组和 IL-6 注射组中的存活率（%）。数据以均值 ± 标准误表示（5 dpf，n = 4 次独立实验重复，每种基因型 × 处理组合包含 60–70 条鱼）。采用单因素方差分析（ANOVA），并结合 Tukey 事后检验进行两两比较。对照组与 IL-6 注射组之间存在显著差异（p = 0.00150），对照组与 NaCl 注射组之间也存在显著差异（p = 0.00243）。（B）通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒按照制造商说明书测定 tsc2 突变体及其同胞在 5 dpf 时的 PGE2 水平，结果以箱形图表示（基因型的双因素方差分析：F = 7.4503；P = 0.01234）。每个样本包含 20 个头部（尾部用于基因分型）。箱形图中的圆点代表生物学重复。（C）tsc2 突变鱼在开放场实验中的结果箱形图，显示在 NaCl 和 IL-6 注射后以及未注射对照组中，各基因型个体在墙边停留的相对时间（基因型的双因素方差分析：F = 7.021；P = 0.00106）。开放场实验使用自动化分析室（材料表）并依据先前报道的方案进行22。（D）示例图显示 NaCl 注射后呈现随机探索行为，而 IL-6 注射后出现重复性环形游动行为。（E）注射 NaCl 或 IL-6 后以及未注射对照组中，不同 tsc2 基因型个体表现出正常行为和重复性环形游动行为的数量分布箱形图（基因型的双因素方差分析：F = 5.7615；P = 0.005849）。本实验共使用三次独立重复实验，每种基因型 × 处理组合包含 60–70 条鱼。请点击此处查看该图的放大版本。
| 60 x E3 储存液 | ||
| 试剂 | 终浓度 | 用量 |
| NaCl | 297 mM | 17.4 g |
| KCl | 10.7 mM | 0.8 g |
| CaCl2 | 19.6 mM | 2.18 g |
| MgCl2·6H2O | 24 mM | 4.89 g |
| 超纯 H2O | N/A | 加水定容至 1 L |
| 总计 | N/A | 1 L |
| Tricaine 储存液 | ||
| 试剂 | 终浓度 | 用量 |
| Tricaine | 15.3 mM | 1 g |
| 1 M Tris-HCl pH 9 | 21 mM | 5.25 mL |
| 超纯 H2O | N/A | 244.75 mL |
| 总计 | N/A | 250 mL |
表1：E3溶液和Tricaine溶液的组成。
讨论
与预期一致，tsc2 纯合突变体表现出较高的基线水平焦虑样行为，这与先前报道的表型一致22,27。由于这些幼虫已表现出严重的行为异常，IL‑6 注射并未进一步加剧其表型。相比之下，tsc2 杂合子则表现出明显的 IL‑6 诱导变化。这种选择性敏感性凸显了本方案在探究基因 × 环境相互作用方面的实用性，即轻度但持续的炎症信号与潜在的遗传易感性相互作用，共同影响神经行为结局。
LPS暴露仍是斑马鱼中最广泛使用的诱导炎症的范式，能够可靠地引发广泛的、强烈的免疫反应，其特征是促炎性细胞因子显著上调、先天免疫细胞被募集以及剂量依赖性的死亡率28。尽管LPS作用强大，但它会同时激活多个Toll样受体通路28,29,30，使得难以单独分离出单个细胞因子对下游神经发育效应的贡献。相比之下，本文所述的IL-6微量注射方案通过特异性升高一种已知在母体免疫激活中起核心作用的细胞因子，提供了一种靶向且可控的研究方法。重要的是，与NaCl注射对照组相比，IL-6注射不会增加死亡率，从而可在无毒性干扰的情况下检测行为学和分子表型。此外，IL-6微量注射可引发特异性的下游炎症信号通路激活，表现为PGE2水平升高，并诱导可测量的行为改变——特别是在tsc2杂合型幼鱼中出现重复游泳行为增加，提示遗传易感性与细胞因子暴露之间存在相互作用。综上所述，这些差异表明：LPS模型模拟的是整体性免疫激活，而IL-6微量注射则可用于精确解析与神经发育风险相关的细胞因子特异性机制。
本文展示的代表性结果说明了IL‑6在tsc2突变背景下的作用，但该方案本身具有广泛的适用性。该方法可直接应用于野生型幼虫或其他遗传模型，以研究明确的炎症刺激如何在早期神经发育过程中与不同的遗传背景相互作用。对于tsc2模型以外的应用，我们建议通过实验确定最佳IL‑6剂量，因为不同基因型和实验目的之间的细胞因子敏感性及炎症阈值可能存在差异。
本方案中的一个关键技术要点是注射体积的一致性，因为IL-6的生物学效应依赖于每次注射准确递送约1 nL的体积。液滴大小的差异通常源于针头孔径或注射压力的不同。如果液滴过小，通常可在高倍镜下逐渐增加压力或略微扩大针尖，以恢复正常的液体流动。相反，若液滴体积超过预期，通常表明针头开口过宽，此时需降低压力或制备针尖更细的新针头。保持精确的注射体积至关重要，因为体积偏差可能改变炎症负荷并影响实验的可重复性。有时，使用者可能会遇到无溶液从针头排出的情况，这通常是由于针尖存在气泡、碎屑或堵塞所致。在体视显微镜下检查针头，并检查注射系统是否存在泄漏或连接松动，通常可解决此问题。确保针头尖端清洁且无阻塞，对于实现稳定递送以及防止压力积聚导致幼虫损伤至关重要。
另一个重要因素是幼虫对注射体积的生理耐受性。幼虫通常能良好耐受约1 nL的体积，但较大体积可能增加死亡率，尤其是在连续数天进行多次注射的情况下。对于需要重复给药的实验，至关重要的是尽量减少机械损伤，两次注射之间留出足够的恢复时间，并通过调整IL‑6浓度而非注射体积来达到所需剂量。这些注意事项有助于确保所观察到的表型反映的是细胞因子暴露效应，而非注射相关损伤。
最后，与注射相关的死亡率可能因操作者的经验而有很大差异。熟练的操作者通常可将死亡率控制在5%左右，而缺乏经验的操作者可能观察到高达50%的死亡率。大多数损失源于固定过程中的机械损伤、针头位置不正确，或意外刺破卵黄囊及周围组织。在开始实验性注射之前，先在野生型幼鱼上练习该操作，可显著提高操作的一致性并降低死亡率。将幼鱼正确摆放以清晰观察居维叶管，结合固定和恢复过程中的轻柔操作，可进一步将操作损伤降至最低。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢范德比尔特大学的 Kevin Ess 和 Lilianna Solnica-Krezel 提供 tsc2vu242/+ 斑马鱼，以及 IIMCB ZCF 在成年斑马鱼方面的协助。本工作由波兰国家科学中心授予 JZ 的 SONATA BIS 项目基金（编号 2023/50/E/NZ3/00252）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm / 内径 0.75 mm） | Sutter Instrument | BF150-75-10 | |
| CaCl2 （氯化钙） | Chempur | 118748703 | |
| 校准载玻片（1/100 mm） | Bresser | 5916710 | |
| 毛细管夹持器（Grip head set 4，尺寸 0） | Fertilart Sp. z o.o | 5196082001 | |
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P-1000 | |
| HCl | Chempur | 115752837 | |
| 人 IL6 | Thermo Fischer Scientific | 200-06-20UG | 储备浓度：10 µg/mL，工作浓度：2 pg/nL（用 0.9% NaCl 稀释） |
| 注射泵 FemtoJet 4i | Eppendorf | E5252000021 | |
| KCl（氯化钾） | Chempur | 117397402 | |
| MgCl2·6H2O（六水合氯化镁） | Chempur | 116120500 | |
| Femtotips 微注射器加样头（用于 Femtojet 微注射系统） | Eppendorf | EPE 5242956003 | |
| Leica M165 FC 显微镜，1983 倍放大 | Leica Microsysytems | https://www.leica-microsystems.com/products/ light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/ | |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| NaCl（氯化钠） | Chempur | 117941206 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147-1G | 储备浓度：20 mg/mL（用超纯水配制），工作浓度：0.5 mg/mL（用 E3 稀释） |
| Tricaine | Sigma-Aldrich/Merck | A-5040 | |
| Tris 碱 | Carl Roth | 4855.3 | |
| 台盼蓝 | Thermo Fischer Scientific | 15250061 | |
| UltraPure 低熔点琼脂糖 | Thermo Fischer Scientific | 16520050 | |
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参考文献
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