斯佩诺伊泽尼德可改善db/db小鼠的糖尿病肾病，其作用与肾功能改善、肠道屏障完整性增强以及炎症和氧化应激减轻相关。
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斯佩诺伊泽尼德可改善db/db小鼠的糖尿病肾病，其作用与肾功能改善、肠道屏障完整性增强以及炎症和氧化应激减轻相关。
糖尿病肾病（DN）的发病机制是多因素的，涉及炎症、氧化应激以及肠-肾轴的作用。穗花杉苷元是 女贞子 并表现出抗肿瘤、抗氧化和抗炎活性。然而，其对糖尿病肾病（DN）作用的分子机制仍需进一步研究。因此，本研究旨在探讨齐墩果素对DN的分子作用机制。采用db/db小鼠建立DN小鼠模型，并给予齐墩果素干预8周。通过血清葡萄糖和肾功能检测评估齐墩果素对小鼠的影响。采用苏木精-伊红染色评估组织病理学改变。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测炎症细胞因子水平。对Nrf2通路及A20/NF-κB通路进行分析 通过 蛋白质印迹（WB）检测肠道紧密连接蛋白的表达，同时结合免疫荧光法进行分析。通过高通量16S rRNA测序检测肠道微生物群的变化。与模型对照组相比，高剂量裂叶梾木苷可改善db/db小鼠的肾功能，降低血糖（从37.13 mmol/L降至28.96 mmol/L）、血尿素氮（从18.27 mmol/L降至15.15 mmol/L）和尿蛋白水平（从28.5 mg降至20.41 mg）。同时，肠道微生物群分析显示，给予裂叶梾木苷后微生物丰度增加，脂多糖水平下降。此外，裂叶梾木苷可上调肠道紧密连接蛋白的表达，从而增强肠屏障完整性。裂叶梾木苷可上调Nrf2和A20的表达，同时下调NF-κB的表达。进一步研究表明，裂叶梾木苷可通过调控Nrf2及A20/NF-κB信号通路，缓解肾脏功能损伤。
糖尿病是肾脏疾病的主要病因之一，随着糖尿病患者人数的增加，其发病率也在上升1。传统的糖尿病肾病（DN）治疗方法已被证明可延缓慢性肾脏病的进展2。然而，仍需寻找更为有效的药物用于DN的预防与治疗。DN的发病机制复杂，涉及炎症、氧化应激以及肠-肾轴等多种因素1。中医药（TCM）因其多靶点作用，在治疗慢性代谢性疾病方面已显示出显著疗效。此外，近年来关于中医药在DN防治中的研究也取得了令人瞩目的成果3。
糖尿病是一种复杂的代谢紊乱疾病，肠道通过与代谢器官的相互作用在其病理生理过程中发挥核心作用4。宿主与肠道微生物群之间的相互作用对于维持宿主内环境稳态至关重要。健康的微生物群结构遭到破坏时，可产生损害肾脏的毒素2；而肾清除功能受损也会改变微生物的代谢过程和群落组成5,6。肠道屏障兼具化学和物理防御功能，由上皮细胞间的紧密连接以及由黏蛋白构成的黏液层共同维持5。现有证据表明，糖尿病肾病（DN）与肠道屏障功能受损之间存在关联7，后者允许毒素及细菌代谢产物（如脂多糖，LPS）易位进入血液循环8,9。LPS 通过受损屏障的易位可引发适应性免疫和固有免疫反应的失调，并刺激促炎性细胞因子的产生7,10，最终导致糖尿病肾病特征性的慢性炎症状态11,12。
女贞子 临床上用于治疗糖尿病肾病（DN）13，其中鉴定出特女贞苷为关键活性成分14裂环烯醚萜苷类化合物獐牙菜苷15具有抗炎、抗氧化和免疫调节特性16,17,18,19db/db 小鼠是一种公认的自发性2型糖尿病动物模型 可重现人类糖尿病肾病关键特征的2型糖尿病模型，包括持续性高血糖、白蛋白尿和系膜基质扩张20先前一项研究报道，对羟基苯乙醇苷在糖尿病肾病大鼠中具有肾脏保护作用21；然而，其分子机制在很大程度上尚未被阐明。值得注意的是，特女贞苷的口服生物利用度较低（约1.93%）22，这使得仅通过直接吸收来解释其药理作用变得困难。新兴证据表明，特女贞苷可被肠道微生物群快速代谢，其药理活性可能通过依赖肠道微生物群的途径介导19基于上述考虑，我们提出假设：特女贞苷通过调节肠道菌群及其下游的炎症和氧化应激通路，从而缓解糖尿病肾病。为验证该假设，我们评估了特女贞苷在db/db小鼠中的剂量依赖性效应，剂量选择依据为预实验结果及既往药理学研究。
因此，本研究旨在评估穗花牡荆苷在糖尿病肾病（DN）背景下的潜在作用及其机制，重点关注其减轻肾脏炎症和氧化应激的能力 通过 肠-肾轴。本研究有助于阐明穗花杉苷在糖尿病肾病预防与治疗中的作用机制。
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山西中医药大学伦理委员会批准了本研究（2022DW167）。所用试剂和设备列于材料表中。
动物实验
8–9周龄的雄性db/db小鼠购自商业来源。小鼠饲养于山西中医药大学实验管理中心的SPF级动物房，环境温度维持在25 °C ± 1 °C，相对湿度稳定在55% ± 5%，并保持12小时光照/12小时黑暗循环。 随意摄取 可自由获取食物和水。实验前，所有小鼠均适应环境7天。人道终点：出现以下症状的小鼠 >体重减轻20%、处于濒死状态或无法触及食物/饮水的小鼠，在预定实验终点前实施人道安乐死。安乐死方法：所有小鼠均按照机构批准的方案，先通过腹腔注射戊巴比妥钠，随后进行颈椎脱位处死。
db/db 小鼠是一种遗传性自发糖尿病模型（非诱导模型）。在9周龄时，通过检测空腹血糖（≥16 mmol/L）和尿微量白蛋白（阳性）确认模型构建成功。所有db/db小鼠均符合建模标准，无动物被剔除。在db/db小鼠成功建立糖尿病肾病（DN）模型后，采用计算机生成的随机序列将小鼠随机分组。实验操作者对分组情况设盲。每笼仅饲养同一处理组的小鼠，以避免交叉污染。小鼠被随机分为四组（每组n = 10）：模型对照组（MC）、伊贝沙坦组（Irb）、低剂量对羟基苯乙醇苷组（Spe-L）和高剂量对羟基苯乙醇苷组（Spe-H），并以db/m小鼠（n = 10）作为正常对照组（NC）。NC组和MC组给予蒸馏水。相比之下，Irb、Spe-L和Spe-H组分别每日灌胃给予43.75 mg/kg伊贝沙坦、57 mg/kg对羟基苯乙醇苷和114 mg/kg对羟基苯乙醇苷，连续给药8周。灌胃剂量随体重增加按比例调整。给药8周后，所有小鼠禁食过夜（12 h），自由饮水，随后实施安乐死，并立即采集血清（以约1500 x g 离心15分钟，收集上清液）、尿液（在代谢笼中收集24小时尿液）、粪便以及肠和肾组织，迅速在液氮中速冻后于-80 °C保存，待后续分析。数据采集完成后，解除盲法进行统计分析。
血液和尿液指标
根据试剂盒说明书检测血清中LPS、SCr和BUN水平。按照试剂盒说明测定24小时尿白蛋白浓度。使用自动生化分析仪检测血清葡萄糖水平。
ELISA 检测
根据制造商的说明，使用352型酶标仪测定小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度。
小鼠肾脏组织的病理学观察
肠道和肾脏组织经4%多聚甲醛溶液固定48小时后，进行洗涤、脱水和石蜡包埋。使用石蜡切片机获取4 µm厚的切片。切片经脱蜡后，采用苏木精-伊红（HE）染色，并利用数字病理切片扫描仪进行扫描。
16S rRNA 测序
使用基于磁珠的土壤DNA提取试剂盒，按照制造商的说明书从盲肠内容物中提取细菌基因组DNA。采用荧光计测量DNA浓度。
使用引物338F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）对16S rRNA基因的V3–V4高变区进行扩增。扩增反应在PCR Master Mix体系中进行，循环条件如下：95 °C预变性3 min；随后进行5个循环，每循环包括95 °C变性30 s、45 °C退火30 s和72 °C延伸30 s；接着进行20个循环，每循环包括95 °C变性30 s、55 °C退火30 s和72 °C延伸30 s；最后在72 °C延伸5 min。PCR扩增产物随后使用基于磁珠的DNA纯化及片段大小筛选 beads 进行纯化。
使用Illumina接头和索引构建文库，并在台式下一代测序（NGS）平台（2 × 250 bp双端测序）上进行测序。利用双端测序读段合并软件对原始读段进行拼接，经过质量过滤后，使用扩增子序列分析软件在97%相似度下聚类为操作分类单元（OTUs）。去除嵌合序列和单例OTUs。通过BLAST比对RDP数据库（用于细菌）和UNITE数据库（用于真菌）进行物种分类注释。
Alpha多样性使用Mothur v3.8.31进行计算。Beta多样性基于Bray-Curtis距离，利用R语言vegan软件包进行主坐标分析（PCoA）评估。差异丰度分析采用STAMP v2.1.3和LEfSe v1.1.0完成。功能预测使用PICRUSt v1.1.4进行。
免疫荧光染色
脱蜡后，样本在高温下使用柠檬酸钠进行抗原修复15分钟，随后用5% BSA封闭60分钟。然后将occludin和claudin-1的一抗（1:500）分别加入回肠和结肠组织，4℃孵育过夜。接着进行二抗染色，孵育60分钟。经DAPI染色10分钟后，使用抗荧光淬灭剂保存样本，并采用全自动荧光成像系统采集免疫荧光图像。
蛋白质印迹法
使用RIPA裂解液提取总蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。将样品（15 µL/孔）上样至8%–12%的分离胶，电泳约2小时。随后，在冷却条件下，采用湿转系统以100 V恒压转膜2小时，将蛋白转移至PVDF膜。用5%脱脂牛奶封闭后，膜在4 °C下与一抗孵育过夜。洗涤后加入合适的二抗，在室温下孵育1小时。最后，在暗室中使用ECL化学发光试剂显影，并用ImageJ软件进行分析。为进行归一化处理，以NC组的平均值作为参考基准，将所有实验组各样本的原始数据除以该平均值，使NC组的平均值为1，其余各组结果均表示为相对于NC组的倍数变化（fold-change）。
统计分析
统计分析使用 SPSS 26.0 软件进行，实验数据以均值 ± 标准差（SD）表示。生物学重复（n）代表每组中的单个动物（生理参数 n = 10；Western blot n = 3；16S 测序 n = 6）。所有动物或样本均未从分析中剔除。若数据满足正态分布和方差齐性的假设，则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较多个组别。当方差齐性得到确认时，组间两两比较采用最小显著差异法（LSD）检验；否则采用 Dunnett’s T3 检验。鉴于本研究具有探索性质，未对不同终点指标进行多重比较校正。当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。
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裂叶荆芥内酯给药降低了糖尿病肾病小鼠的血糖水平，改善了肾功能，并减轻了肾损伤
DN 模型小鼠在成功建模后给予毛蕊花糖苷治疗，持续 8 周。MC 组小鼠血清葡萄糖水平显著升高，而毛蕊花糖苷组小鼠则明显降低（图1B）。与NC组相比，MC组的尿白蛋白、SCr和BUN水平显著升高。经治疗后，特女贞苷组和厄贝沙坦组的尿白蛋白、SCr和BUN水平均明显降低。图1C–E).
与NC组相比，HE染色的肾组织切片病理学检查显示，模型组出现炎性细胞浸润。给予特女贞苷后，糖尿病肾病小鼠的肾小球损伤明显减轻，尤其是炎性细胞浸润显著减少。这些结果表明，特女贞苷通过减轻肾脏炎症来缓解肾组织损伤（图1F）。
梭曼诺泽内酯给药可降低糖尿病肾病小...
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糖尿病肾病（DN）是一种持续性的糖尿病微血管并发症，其特征是尿白蛋白排泄增加和肾功能受损24。蛋白尿是临床上常用于评估DN进展的早期指标25。DN患者可能出现肾功能异常，表现为血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平显著升高26。本研究中，特女贞苷组显示出尿白蛋白显著降低，同时血清SCr和BUN水平明显下降。病理学检查表明，特女贞苷通过减轻炎症细胞浸润，减少了db/db小鼠的肾损伤。因此，特女贞苷可能在糖尿病肾病治疗中具有潜在益处。
大量研究表明，糖尿病肾病（DN）的发展与肠道轴密切相关，肠道菌群失调与糖尿病进展相关27。肠道微生物及其代谢产物在DN的发病机制中发挥关键作用28。Maria等人在DN患者肠道微生物组中鉴定出四种革兰氏阴性菌门（Bacteroidota、Proteobacteria、Fusobacteria和Verrucomicro...
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作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。
本研究由国家自然科学基金（编号：81973486 和 82173974）、山西省中医药管理局科研项目（编号：2024ZYYA021）以及山西中医药大学学科建设项目（编号：2026XK24）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Albustix | 广州花都高尔博生物科技有限公司 | 20211203 | |
| 分析天平 | 北京赛多利斯仪器系统有限公司 | CPA | |
| 抗体 A20 | Cell Signalling Technology | 5630s | (1:1000) |
| 抗体 Bax | Cell Signalling Technology | 2772s | (1:1000) |
| 抗体 Bcl-2 | Cell Signalling Technology | 3498s | (1:1000) |
| 抗体 claudin 1 | Abcam | EPR25359-48 | (1:1000) |
| 抗体 COX2 | Proteintech Group | 12375-1-AP | (1:2000) |
| 抗体 GAPDH | Abcam | EPR16891 | (1:10000) |
| 抗体 GCLC | Proteintech Group | 12601-1-AP | (1:10000) |
| 抗体 HO-1 | Proteintech Group | 10701-1-AP | (1:10000) |
| 抗体 IκBα | Cell Signalling Technology | 4812s | (1:1000) |
| 抗体 Myd88 | Abcam | EPR21824 | (1:1000) |
| 抗体 NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 8242s | (1:1000) |
| 抗体 NLRP3 | Proteintech Group | 68102-1-Ig | (1:5000) |
| 抗体 NQO1 | Proteintech Group | 11451-1-AP | (1:5000) |
| 抗体 Nrf2 | Proteintech Group | 16396-1-AP | (1:5000) |
| 抗体 occludin | Cell Signalling Technology | 91131S | (1:1000) |
| 抗体 p-IκBα | Cell Signalling Technology | 2859s | (1:1000) |
| 抗体 p-NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 3033s | (1:1000) |
| 抗体 TAX1BP1 | Proteintech Group | 14424-1-AP | (1:2000) |
| 抗体 TLR4 | GeneTex | GTX75742 | (1:1000) |
| 抗体 TRAF6 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8409 | (1:1000) |
| 抗体 ZO-1 | Proteintech Group | 21773-1-AP | (1:10000) |
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