本方案描述了一种基于完全集成的微流控芯片LAMP方法，可在一小时内实现对重症监护室（ICU）患者下呼吸道感染相关15种病原体的即时检测。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
下呼吸道感染（LRTIs）是危重症患者临床病情恶化和死亡的主要原因之一。在重症监护室（ICU）中，及时鉴定致病病原体对于合理使用抗菌治疗至关重要；然而，传统的培养方法需要3至5天，且阳性检出率不理想，尤其是对真菌的检测。分子检测方法如PCR可缩短检测周转时间，但仍依赖于人工核酸提取和热循环过程，限制了其在床旁应用的适用性。本方案描述了一种基于完全集成式圆盘状微流控芯片（CD芯片）的即时检测工作流程，该芯片将基于磁珠的核酸纯化与环介导等温扩增（LAMP）技术相结合。经过简化的手工液化和裂解步骤后，将处理后的样本与两个预封装的试剂小瓶一同加载到芯片上。仪器随后自动完成核酸提取、在65 °C下进行扩增以及实时荧光检测，在45分钟的仪器运行时间内（包括手工预处理步骤，整个样本到结果的完整工作流程约需1小时）即可获得针对15种目标病原体的定性结果，包括11种细菌、3种真菌和1种非典型病原体。我们展示了来自10份ICU样本的检测数据，样本类型包括痰液、支气管吸出物和支气管肺泡灌洗液，涵盖单一致病菌感染以及单个芯片上最多达7种病原体的多重感染。封闭式卡盒设计最大限度降低了气溶胶污染风险，且仅需一次加样操作，无需特殊培训，使该系统成为ICU团队实用的床旁诊断工具。
引言
在重症监护病房（ICU）的危重患者中，下呼吸道感染持续导致较高的发病率、机械通气时间延长以及额外的死亡率，其中以呼吸机相关性肺炎（VAP）最为突出1,2。ICU 获得性下呼吸道感染（LRTIs）的微生物学谱与社区获得性感染显著不同。多重耐药革兰阴性菌（Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter baumannii）占主导地位，常以多微生物共存的形式出现，使经验性治疗方案难以奏效3,4。机会性真菌感染进一步增加了诊断和治疗的复杂性。侵袭性肺曲霉病过去被认为是严重免疫抑制的标志，但如今在非中性粒细胞减少的 ICU 患者中也日益常见，尤其是在重症流感和 COVID-19 之后5。目前用于曲霉病的诊断流程依赖于阳性率较低的培养方法结合半乳甘露聚糖（GM）抗原检测，然而 GM 检测在非中性粒细胞减少宿主中的敏感性存在明显波动，且其诊断窗口期已知有限6。脓毒症患者每延迟一小时启动适当的抗菌治疗，死亡率即随之显著上升7。综上所述，ICU 感染的快速进展与复杂性迫切需要能够匹配临床紧急需求的诊断工具。
标准微生物培养虽然在药敏试验中不可或缺，但其检测速度从根本上受到限制：检测周转时间长达3至5天，难以检测苛养微生物，且真菌培养的阳性率仍然较低8。宏基因组高通量测序（mNGS）提供了一种无偏倚的替代方法，但其临床应用受限于成本较高、处理时间需24至48小时、依赖生物信息学分析流程，以及在即时检测场景下的可行性有限9。基于PCR的检测面板已缩短了检测时间差距，但仍需多步核酸提取、依赖热循环仪器，且对于传统形式还需进行扩增后电泳分析10。上述任何一种平台均未能完全满足重症监护病房（ICU）对检测技术的综合需求：检测时间少于一小时、操作时间最短化、可多重检测包括真菌在内的病原体，以及操作足够简便，使非实验室人员也能完成。
环介导等温扩增（LAMP）技术可解决上述部分限制。该方法由Notomi等人首次提出，利用4至6对引物识别靶DNA上的6个不同区域，在链置换聚合酶的驱动下于恒定65 °C条件下扩增目标DNA11。反应过程中产生特征性的茎环结构和花椰菜样扩增子，可通过实时荧光检测，在跨越阈值后数分钟内呈现S型扩增曲线。该方法在模板浓度较低时仍具有高灵敏度，且多引物设计提高了特异性，从而减少假阳性结果12,13。当与微流控芯片平台结合时，LAMP可实现单次加样后对多个靶标的并行检测14。早期研究表明，LAMP芯片系统检测呼吸道病原体的周转时间远低于三小时15。然而，这些系统的一个关键局限在于依赖独立的手动DNA提取步骤，这增加了操作时间、复杂性以及污染风险。
本文所述系统消除了这一瓶颈。该系统采用一次性碟形微流控芯片（直径86 mm），将样本加载、基于磁珠的核酸纯化以及16重环介导等温扩增（LAMP）集成于一个密封的检测盒中（图1）。操作者仅需使用专用处理管进行短暂的手动液化-裂解步骤，随后将裂解液及两瓶试剂加载至芯片上（图2）。此后，仪器自动完成核酸提取、65 °C恒温扩增以及荧光信号采集，在45分钟内完成对15种临床相关病原体的定性检测，包括11种细菌、3种真菌（Aspergillus spp.、Candida albicans、Pneumocystis jirovecii）和1种非典型病原体（Mycoplasma pneumoniae）。每个检测中均包含一个神经母细胞瘤断裂点家族（NBPF）基因作为内参，用于验证样本质量及反应体系的完整性。本实验方案提供了从重症监护病房（ICU）样本采集、预处理、芯片加载、自动化检测到结果判读的完整流程的逐步操作说明，适用于临床实验室人员及ICU床旁医疗团队。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有样本均在获得中国医学科学院北京协和医院伦理审查委员会批准的方案下采集（批准号：I-24PJ1778）。在采集样本前，已从每位参与者或其法定授权代表处获得书面知情同意。目标病原体检测面板及反应孔分配详见表1，样本预处理过程中使用的耗材列于表2中。
1. 重症监护病房下呼吸道临床样本的采集
- 痰液采集
- 用清水或无菌生理盐水冲洗口腔三次，以清除食物残渣和口腔共生菌群。
- 指导患者进行两到三次深呼吸，然后用力咳嗽，将下呼吸道深部痰液直接咳入无菌采集杯中。
注意： 合格的标本应为黏稠、脓性或带血丝的来自气管以下的物质；透明的唾液或鼻后滴漏物不符合要求，可能影响后续检测的准确性。
- 支气管吸出物（BAS）采集
- 对于未插管的患者，经鼻或经口插入无菌吸痰导管（10–12 Fr 导管，负压设置为 −0.0267 MPa，相当于 −200 mmHg），插入深度约为 30 cm。
- 在旋转导管的同时施加负压，并缓慢撤出导管。将吸出的分泌物收集至无菌标本收集装置中。
注意： 若分泌物较少，可在吸引前经导管注入约 5 mL 无菌生理盐水。 - 对于机械通气的患者，应根据气管插管尺寸选择吸痰导管：7.0–7.5 mm 气管插管选用 10 Fr 导管，8.0 mm 气管插管选用 12 Fr 导管。
- 吸痰前以 100% 氧气预充氧 30–60 秒。断开呼吸机管路，将选定的导管经人工气道插入，直至遇到阻力。
- 施加 −0.0267 MPa（相当于 −200 mmHg）的负压，每次吸引时间及断开呼吸机的时间均不得超过 15 秒，以减少肺泡萎陷和低氧血症的风险；吸痰后以 100% 氧气再充氧 30–60 秒。
- 经导管注入 1–2 mL 无菌生理盐水，并等待 3 秒。
- 施加负压并撤出导管。将吸出的分泌物收集至无菌密闭容器中。采集标本后立即重新连接呼吸机管路。
注意： 整个操作过程必须严格遵守无菌技术，以防标本发生医院内污染。
- 支气管肺泡灌洗液（BALF）采集
- 根据胸部影像学确定目标肺段。推进支气管镜并将其楔入相应的段或亚段支气管内。
- 快速注入 20–50 mL 无菌生理盐水，共 3–5 次（总量 60–120 mL）。每次灌注后施加轻柔负压吸引，将回收液体收集至无菌密闭容器中。
警告： 重症监护病房（ICU）患者进行支气管肺泡灌洗期间，必须持续监测血流动力学和通气状况。对机械通气的患者应根据需要调整呼吸机参数。
注意： 通常回收量为灌注总量的 40–60%。回收量过低时，可能需要调整支气管镜尖端的位置。
2. 液化与病原体裂解
- 使用一次性 #2 移液管，将标本吸取至刻度线处（约 1 mL），并转移至裂解液化管中。反复挤压移液管胶头，以确保所有黏稠物质完全转移，然后盖紧管盖。
注意： 对于支气管肺泡灌洗液（BALF）或水样痰液，应加载两管移液管体积，以确保足够的病原体输入量。 - 用手剧烈振荡裂解液化管 1 分钟。目视检查样本，持续振荡直至无可见的黏液团块残留，且样本能通过一次性 #1 移液管顺畅流动、无阻力（呈均匀、类似水的性状）。至少振荡 1 分钟，对于黏稠度较高的样本，应根据需要延长振荡时间，直至达到上述标准。
- 打开裂解管的密封盖。
- 使用一次性 #1 移液管吸取约 0.5 mL 均质化后的样本，并将其加入裂解管中。
- 盖紧密封盖，并确认尖端盖已牢固拧紧。
- 将裂解管放入样本前处理装置（SP 装置）中，向下按压直至固定到位，然后按下开始按钮。
- 让 SP 装置自动完成液化-裂解循环（参数见表 3），过程持续约 15 分钟。
注意： 处理过程中不得打开或取出试管。
3. 芯片加载与自动检测
- 试剂与样本加载
- 将CD芯片从4 °C冰箱中取出，在室温（约25 °C）下平衡10分钟。
注意：试剂瓶O和B以及预处理后的裂解液均在室温下使用；芯片上的LAMP扩增在65 °C下进行（见步骤3.2.3和表3）。 - 打开铝箔袋，将芯片放置在平坦表面上。
- 逆时针旋转盖子以打开芯片。
- 轻弹试剂瓶O，使液体聚集在瓶底。
- 取下试剂瓶O的盖子，将喷嘴插入O端口，并将全部内容物注入端口内。
- 丢弃试剂瓶O。使用试剂瓶B和B端口重复上述操作。
- 从SP设备中取出已处理的裂解管，移除管尖盖帽。
- 将裂解管管尖对准S端口，将全部裂解液体积注入芯片中。
- 丢弃使用过的裂解管。
- 顺时针旋转芯片盖子，直至听到两次清晰的咔哒声，表明已完全密封。
注意：任一端口加载不完全可能导致个别通道失败。密封前应确认所有试剂已完全注入。为避免密封不完全及污染风险，密封盖子时请勿佩戴PE手套；建议使用乳胶或丁腈手套。
- 将CD芯片从4 °C冰箱中取出，在室温（约25 °C）下平衡10分钟。
- 仪器操作
- 开启全自动核酸分析仪。点击检测，扫描芯片铝箔袋上的条形码，并输入患者人口统计信息和样本编号。
- 将芯片安装到旋转主轴上，并向下按压，直至听到咔哒声表示已卡紧。
- 点击开始。仪器将自动完成离心式试剂分配、磁珠提取、65 °C下的LAMP扩增以及荧光信号采集。运行时间约为45分钟（试剂/样本加载及仪器工作流程详见图3）。
注意： 运行过程中请勿打开仪器盖。
- 结果判读
- 软件通过二阶导数最大值分析法识别每条S型扩增曲线的拐点，并报告相应的TP值（阳性出现时间）。
- 将每个TP值与表4中列出的相应阈值进行比较。将TP值等于或低于阈值的通道判为阳性，TP值高于阈值的通道判为阴性。
- 确认内参通道（孔16）显示出S型扩增曲线，且其TP值低于12分钟。
- 若内参检测失败，则整次运行结果无效。应使用新的芯片重新检测，或重新采集标本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
有效运行完成后，仪器显示了全部16个通道的实时荧光扩增曲线。阳性通道呈现预期的S型扩增动力学曲线，并自动标注了TP值，而阴性通道则保持在基线水平。IC通道（第16孔）产生了具有TP值的S型曲线。 < 所有有效运行中均为 12 分钟。
作为该方案的初步概念验证演示，选择了10个代表性样本，以说明重症监护室（ICU）临床实践中遇到的各种临床情况，包括6份支气管吸出物（BAS）、2份支气管肺泡灌洗液（BALF）样本和2份深部痰液（Spt）样本。这些样本被有意识地选择以涵盖单一致病菌和复杂的多重致病菌病例，而非用于估计病原体的流行率；10个样本中有8个为多重感染（每个样本检出2至7种目标病原体），2个为单一感染。完整的真阳性（TP）数据见表5，代表性扩增曲线如图4所示。
在复杂性谱的一端，样本 S1（BAS）仅对Aspergillus spp. 产生单一阳性信号（TP = 8 分钟），而所有细菌通道均呈阴性。该结果模...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
快速病原体鉴定在重症监护室感染管理中至关重要。本文所述系统将病原体鉴定时间从传统培养所需的3至5天缩短至1小时以内，这一时间窗口正是临床常需作出一线抗微生物药物决策的关键时期7。通过在单一密闭芯片内整合核酸提取、纯化及16重LAMP扩增步骤，该工作流程消除了手动DNA提取环节，而该环节一直是早期LAMP芯片平台主要的操作瓶颈15。最终实现仅需一次加样操作，且可由无需接受专门分子生物学培训的人员完成。
有几个操作步骤需要特别注意。标本质量至关重要。对于接受机械通气的患者，深部呼吸道样本（如支气管吸出物或支气管肺泡灌洗液）优于咳出的痰液，因为后者可能受到口咽部污染，从而掩盖真正的病原体信号。样本液化不完全是最常见的裂解不充分原因，因此应持续手动振荡，直至样本明显呈现水样状态。在芯片加样过程中，若试剂瓶或裂解管中的液体未完全排空，可能导致下游反应孔得不到足够的样本输入，从而引起特定通道的失败，此类情况可能被误判为阴性结果。此外，芯片盖的“两步扣合”关闭方式不仅仅是一个机械结构设计；它对于维持等...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
非传染性慢性疾病-国家科技重大专项（编号：2023ZD0516500）、国家高水平医院临床研究基金（编号：2026-PUMCH-A-103）、CMB开放竞争项目（编号：24-561）以及北京协和医院人才培养项目（编号：UGG11571）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全自动核酸分析仪 | 北京泰浩生物技术有限公司 | THE-T80-01 | TurboFlow T；执行离心式试剂分配、磁珠提取、LAMP 65 °C以及实时荧光检测（运行时间约45分钟） |
| #1 一次性巴斯德吸管 | 中国台湾海门中泰实验设备厂 | 定制 | 一次性耗材；0.5 mL；用于将匀浆后的样本转移至裂解管 |
| #2 一次性巴斯德吸管 | 中国台湾海门中泰实验设备厂 | 定制 | 一次性耗材；2 mL；将样本吸取至液化管的标记线处 |
| CD芯片 | 北京宏阳辰晟科技有限公司 | 定制 | 一次性耗材；直径86 mm的圆盘，带有中央加样区（O、B、S端口）、磁珠纯化区，以及外圈含16个反应孔的环形区（15个病原体检测靶标 + NBPF内参对照） |
| LAMP反应试剂 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 16730ES80 | CD芯片中预存的冻干LAMP反应试剂珠 |
| 液化管 | 北京泰浩生物技术有限公司 | 定制 | 一次性耗材；2 mL/管；用于接收待手动均质化的样本 |
| 裂解管 | 北京泰浩生物科技有限公司 | 定制 | 一次性耗材；0.5 mL/管；可压缩硅胶材质管体 200 µm 滤膜；预装裂解试剂 |
| 引物 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | 定制 | CD芯片反应腔中嵌入的引物混合物 |
| 样品预处理装置 | 北京泰浩生物技术有限公司 | THE-R10-02 | TS-2000；自动液化–裂解周期（约15 min） |
| 单剂量小瓶 “B” | 中国广州瑞孚生物科技有限公司 | 定制 | 一次性耗材；预封装的芯片试剂，每次检测使用一个；储存于 4 °C 并平衡至室温（~25 °C) 上样前 |
| 单剂量小瓶 “O” | 广州锐非生物科技有限公司 | 定制 | 一次性耗材；预封装在芯片上的试剂；每次检测使用一个；储存于 4 °C 并平衡至室温（~25 °C) 上样前 |
参考文献
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
- Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
- Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
- Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
- Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
- Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
- Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
- Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
- Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
- Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
- Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
- Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
- Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
