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重症监护病房患者下呼吸道感染病原体的快速床旁检测

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DOI：

10.3791/71534

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2026年9月19日

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1National Infrastructures for Translational Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Institute of Clinical Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd, 3Department of Critical Care Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 4Department of Medicine, Cape Cod Hospital, 5Harvard T.H. Chan School of Public Health, 6Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Center for Inflammation Research, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于完全集成的微流控芯片LAMP方法，可在一小时内实现对重症监护室（ICU）患者下呼吸道感染相关15种病原体的即时检测。

摘要

下呼吸道感染（LRTIs）是危重症患者临床病情恶化和死亡的主要原因之一。在重症监护室（ICU）中，及时鉴定致病病原体对于合理使用抗菌治疗至关重要；然而，传统的培养方法需要3至5天，且阳性检出率不理想，尤其是对真菌的检测。分子检测方法如PCR可缩短检测周转时间，但仍依赖于人工核酸提取和热循环过程，限制了其在床旁应用的适用性。本方案描述了一种基于完全集成式圆盘状微流控芯片（CD芯片）的即时检测工作流程，该芯片将基于磁珠的核酸纯化与环介导等温扩增（LAMP）技术相结合。经过简化的手工液化和裂解步骤后，将处理后的样本与两个预封装的试剂小瓶一同加载到芯片上。仪器随后自动完成核酸提取、在65 °C下进行扩增以及实时荧光检测，在45分钟的仪器运行时间内（包括手工预处理步骤，整个样本到结果的完整工作流程约需1小时）即可获得针对15种目标病原体的定性结果，包括11种细菌、3种真菌和1种非典型病原体。我们展示了来自10份ICU样本的检测数据，样本类型包括痰液、支气管吸出物和支气管肺泡灌洗液，涵盖单一致病菌感染以及单个芯片上最多达7种病原体的多重感染。封闭式卡盒设计最大限度降低了气溶胶污染风险，且仅需一次加样操作，无需特殊培训，使该系统成为ICU团队实用的床旁诊断工具。

引言

在重症监护病房（ICU）的危重患者中，下呼吸道感染持续导致较高的发病率、机械通气时间延长以及额外的死亡率，其中以呼吸机相关性肺炎（VAP）最为突出1,2。ICU 获得性下呼吸道感染（LRTIs）的微生物学谱与社区获得性感染显著不同。多重耐药革兰阴性菌（Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter baumannii）占主导地位，常以多微生物共存的形式出现，使经验性治疗方案难以奏效3,4。机会性真菌感染进一步增加了诊断和治疗的复杂性。侵袭性肺曲霉病过去被认为是严重免疫抑制的标志，但如今在非中性粒细胞减少的 ICU 患者中也日益常见，尤其是在重症流感和 COVID-19 之后5。目前用于曲霉病的诊断流程依赖于阳性率较低的培养方法结合半乳甘露聚糖（GM）抗原检测，然而 GM 检测在非中性粒细胞减少宿主中的敏感性存在明显波动，且其诊断窗口期已知有限6。脓毒症患者每延迟一小时启动适当的抗菌治疗，死亡率即随之显著上升7。综上所述，ICU 感染的快速进展与复杂性迫切需要能够匹配临床紧急需求的诊断工具。

标准微生物培养虽然在药敏试验中不可或缺，但其检测速度从根本上受到限制：检测周转时间长达3至5天，难以检测苛养微生物，且真菌培养的阳性率仍然较低8。宏基因组高通量测序（mNGS）提供了一种无偏倚的替代方法，但其临床应用受限于成本较高、处理时间需24至48小时、依赖生物信息学分析流程，以及在即时检测场景下的可行性有限9。基于PCR的检测面板已缩短了检测时间差距，但仍需多步核酸提取、依赖热循环仪器，且对于传统形式还需进行扩增后电泳分析10。上述任何一种平台均未能完全满足重症监护病房（ICU）对检测技术的综合需求：检测时间少于一小时、操作时间最短化、可多重检测包括真菌在内的病原体，以及操作足够简便，使非实验室人员也能完成。

环介导等温扩增（LAMP）技术可解决上述部分限制。该方法由Notomi等人首次提出，利用4至6对引物识别靶DNA上的6个不同区域，在链置换聚合酶的驱动下于恒定65 °C条件下扩增目标DNA11。反应过程中产生特征性的茎环结构和花椰菜样扩增子，可通过实时荧光检测，在跨越阈值后数分钟内呈现S型扩增曲线。该方法在模板浓度较低时仍具有高灵敏度，且多引物设计提高了特异性，从而减少假阳性结果12,13。当与微流控芯片平台结合时，LAMP可实现单次加样后对多个靶标的并行检测14。早期研究表明，LAMP芯片系统检测呼吸道病原体的周转时间远低于三小时15。然而，这些系统的一个关键局限在于依赖独立的手动DNA提取步骤，这增加了操作时间、复杂性以及污染风险。

本文所述系统消除了这一瓶颈。该系统采用一次性碟形微流控芯片（直径86 mm），将样本加载、基于磁珠的核酸纯化以及16重环介导等温扩增（LAMP）集成于一个密封的检测盒中（图1）。操作者仅需使用专用处理管进行短暂的手动液化-裂解步骤，随后将裂解液及两瓶试剂加载至芯片上（图2）。此后，仪器自动完成核酸提取、65 °C恒温扩增以及荧光信号采集，在45分钟内完成对15种临床相关病原体的定性检测，包括11种细菌、3种真菌（Aspergillus spp.、Candida albicans、Pneumocystis jirovecii）和1种非典型病原体（Mycoplasma pneumoniae）。每个检测中均包含一个神经母细胞瘤断裂点家族（NBPF）基因作为内参，用于验证样本质量及反应体系的完整性。本实验方案提供了从重症监护病房（ICU）样本采集、预处理、芯片加载、自动化检测到结果判读的完整流程的逐步操作说明，适用于临床实验室人员及ICU床旁医疗团队。

方案

所有样本均在获得中国医学科学院北京协和医院伦理审查委员会批准的方案下采集（批准号：I-24PJ1778）。在采集样本前，已从每位参与者或其法定授权代表处获得书面知情同意。目标病原体检测面板及反应孔分配详见表1，样本预处理过程中使用的耗材列于表2中。

1. 重症监护病房下呼吸道临床样本的采集

  1. 痰液采集
    1. 用清水或无菌生理盐水冲洗口腔三次，以清除食物残渣和口腔共生菌群。
    2. 指导患者进行两到三次深呼吸，然后用力咳嗽，将下呼吸道深部痰液直接咳入无菌采集杯中。
      注意： 合格的标本应为黏稠、脓性或带血丝的来自气管以下的物质；透明的唾液或鼻后滴漏物不符合要求，可能影响后续检测的准确性。
  2. 支气管吸出物（BAS）采集
    1. 对于未插管的患者，经鼻或经口插入无菌吸痰导管（10–12 Fr 导管，负压设置为 −0.0267 MPa，相当于 −200 mmHg），插入深度约为 30 cm。
    2. 在旋转导管的同时施加负压，并缓慢撤出导管。将吸出的分泌物收集至无菌标本收集装置中。
      注意： 若分泌物较少，可在吸引前经导管注入约 5 mL 无菌生理盐水。
    3. 对于机械通气的患者，应根据气管插管尺寸选择吸痰导管：7.0–7.5 mm 气管插管选用 10 Fr 导管，8.0 mm 气管插管选用 12 Fr 导管。
    4. 吸痰前以 100% 氧气预充氧 30–60 秒。断开呼吸机管路，将选定的导管经人工气道插入，直至遇到阻力。
    5. 施加 −0.0267 MPa（相当于 −200 mmHg）的负压，每次吸引时间及断开呼吸机的时间均不得超过 15 秒，以减少肺泡萎陷和低氧血症的风险；吸痰后以 100% 氧气再充氧 30–60 秒。
    6. 经导管注入 1–2 mL 无菌生理盐水，并等待 3 秒。
    7. 施加负压并撤出导管。将吸出的分泌物收集至无菌密闭容器中。采集标本后立即重新连接呼吸机管路。
      注意： 整个操作过程必须严格遵守无菌技术，以防标本发生医院内污染。
  3. 支气管肺泡灌洗液（BALF）采集
    1. 根据胸部影像学确定目标肺段。推进支气管镜并将其楔入相应的段或亚段支气管内。
    2. 快速注入 20–50 mL 无菌生理盐水，共 3–5 次（总量 60–120 mL）。每次灌注后施加轻柔负压吸引，将回收液体收集至无菌密闭容器中。
      警告： 重症监护病房（ICU）患者进行支气管肺泡灌洗期间，必须持续监测血流动力学和通气状况。对机械通气的患者应根据需要调整呼吸机参数。
      注意： 通常回收量为灌注总量的 40–60%。回收量过低时，可能需要调整支气管镜尖端的位置。

2. 液化与病原体裂解

  1. 使用一次性 #2 移液管，将标本吸取至刻度线处（约 1 mL），并转移至裂解液化管中。反复挤压移液管胶头，以确保所有黏稠物质完全转移，然后盖紧管盖。
    注意： 对于支气管肺泡灌洗液（BALF）或水样痰液，应加载两管移液管体积，以确保足够的病原体输入量。
  2. 用手剧烈振荡裂解液化管 1 分钟。目视检查样本，持续振荡直至无可见的黏液团块残留，且样本能通过一次性 #1 移液管顺畅流动、无阻力（呈均匀、类似水的性状）。至少振荡 1 分钟，对于黏稠度较高的样本，应根据需要延长振荡时间，直至达到上述标准。
  3. 打开裂解管的密封盖。
  4. 使用一次性 #1 移液管吸取约 0.5 mL 均质化后的样本，并将其加入裂解管中。
  5. 盖紧密封盖，并确认尖端盖已牢固拧紧。
  6. 将裂解管放入样本前处理装置（SP 装置）中，向下按压直至固定到位，然后按下开始按钮。
  7. 让 SP 装置自动完成液化-裂解循环（参数见表 3），过程持续约 15 分钟。
    注意： 处理过程中不得打开或取出试管。

3. 芯片加载与自动检测

  1. 试剂与样本加载
    1. 将CD芯片从4 °C冰箱中取出，在室温（约25 °C）下平衡10分钟。
      ​注意：试剂瓶O和B以及预处理后的裂解液均在室温下使用；芯片上的LAMP扩增在65 °C下进行（见步骤3.2.3和表3）。
    2. 打开铝箔袋，将芯片放置在平坦表面上。
    3. 逆时针旋转盖子以打开芯片。
    4. 轻弹试剂瓶O，使液体聚集在瓶底。
    5. 取下试剂瓶O的盖子，将喷嘴插入O端口，并将全部内容物注入端口内。
    6. 丢弃试剂瓶O。使用试剂瓶B和B端口重复上述操作。
    7. 从SP设备中取出已处理的裂解管，移除管尖盖帽。
    8. 将裂解管管尖对准S端口，将全部裂解液体积注入芯片中。
    9. 丢弃使用过的裂解管。
    10. 顺时针旋转芯片盖子，直至听到两次清晰的咔哒声，表明已完全密封。
      注意：任一端口加载不完全可能导致个别通道失败。密封前应确认所有试剂已完全注入。为避免密封不完全及污染风险，密封盖子时请勿佩戴PE手套；建议使用乳胶或丁腈手套。
  2. 仪器操作
    1. 开启全自动核酸分析仪。点击检测，扫描芯片铝箔袋上的条形码，并输入患者人口统计信息和样本编号。
    2. 将芯片安装到旋转主轴上，并向下按压，直至听到咔哒声表示已卡紧。
    3. 点击开始。仪器将自动完成离心式试剂分配、磁珠提取、65 °C下的LAMP扩增以及荧光信号采集。运行时间约为45分钟（试剂/样本加载及仪器工作流程详见图3）。
      注意： 运行过程中请勿打开仪器盖。
  3. 结果判读
    1. 软件通过二阶导数最大值分析法识别每条S型扩增曲线的拐点，并报告相应的TP值（阳性出现时间）。
    2. 将每个TP值与表4中列出的相应阈值进行比较。将TP值等于或低于阈值的通道判为阳性，TP值高于阈值的通道判为阴性。
    3. 确认内参通道（孔16）显示出S型扩增曲线，且其TP值低于12分钟。
    4. 若内参检测失败，则整次运行结果无效。应使用新的芯片重新检测，或重新采集标本。

结果

有效运行完成后，仪器显示了全部16个通道的实时荧光扩增曲线。阳性通道呈现预期的S型扩增动力学曲线，并自动标注了TP值，而阴性通道则保持在基线水平。IC通道（第16孔）产生了具有TP值的S型曲线。 < 所有有效运行中均为 12 分钟。

作为该方案的初步概念验证演示，选择了10个代表性样本，以说明重症监护室（ICU）临床实践中遇到的各种临床情况，包括6份支气管吸出物（BAS）、2份支气管肺泡灌洗液（BALF）样本和2份深部痰液（Spt）样本。这些样本被有意识地选择以涵盖单一致病菌和复杂的多重致病菌病例，而非用于估计病原体的流行率；10个样本中有8个为多重感染（每个样本检出2至7种目标病原体），2个为单一感染。完整的真阳性（TP）数据见表5，代表性扩增曲线如图4所示。

在复杂性谱的一端，样本 S1（BAS）仅对Aspergillus spp. 产生单一阳性信号（TP = 8 分钟），而所有细菌通道均呈阴性。该结果模式与孤立性侵袭性曲霉病一致，而此类诊断常因传统培养方法难以及时检出。样本 S10（Spt）同样仅对Streptococcus pneumoniae 检出单一阳性结果（TP = 5.5 分钟）。这些发现表明，该检测方法能够在包含 15 种病原体靶标的背景下识别单一致病微生物感染。

在其余标本中观察到多微生物感染，这与重症监护病房（ICU）患者呼吸道感染的流行病学特征一致。样本 S2–S5 均含有Aspergillus spp.，并同时检出一种或多种细菌病原体，其中两个样本还检出Candida albicans。最复杂的样本 S5（支气管肺泡灌洗液，BALF）同时检出七种病原体，包括Aspergillus spp.、Burkholderia cepacia、Corynebacterium striatum、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus 和 Stenotrophomonas maltophilia。这些结果表明，16通道微流控芯片在临床检测条件下具备多重病原体同步检测能力。

样本 S6–S9 含有细菌共感染但无真菌参与，检测到的病原体数量从双病原体（S6：B. cepacia 和 E. coli）到四重病原体（S8：Acinetobacter baumannii、B. cepacia、Klebsiella pneumoniae 和 S. maltophilia）不等。在全部 10 个样本中，阳性通道的 TP 值范围为 3.5–9 分钟，所有内参通道均满足预设的有效性标准，即 TP < 12 分钟。

在本项初步研究中，芯片检测结果与两种参考方法在相同10份标本上平行进行的检测结果进行了比较：靶向宏基因组高通量测序（tNGS）和传统痰培养。15种病原体检测通道的逐项一致性结果总结于表6。相对于tNGS，本检测在所有靶标中均表现出100%阳性符合率（PPA）和100%阴性符合率（NPA）。相对于痰培养，每个培养阳性靶标均达到100%的PPA，而NPA范围为44.4%至100%；较低的NPA值反映了芯片（以及tNGS）检测到但培养未检出的靶标，这与核酸扩增技术相对于培养法具有更高的分析灵敏度一致，而非由假阳性所致。由于样本量较小且为有意选择的样本，上述数据仅为该初步队列的描述性一致性估计值，不作为正式的诊断准确性评估指标。由于tNGS本身也是一种基于核酸的检测方法，其与芯片的一致性仅能证实核酸水平的一致，而无法确定每种微生物的临床感染状态；两种方法均无法单独区分真正感染与定植状态。

figure-results-1
图 1：微流控芯片结构及配套耗材。（A）直径为 86 mm 的圆盘形芯片示意图，显示三个同心区域：加样区、中间磁珠纯化区和外周扩增与检测区。（B）外周扩增环，包含 16 个反应孔（标示出第 1、4、8、12 和 16 位）。（C）裂解管组件（尖端盖、密封盖和管体）。（D）单剂量试剂瓶“O”和“B”。（E）加样区，显示样本孔“S”以及试剂孔“O”和“B”。缩写：O = 试剂 O；B = 试剂 B；S = 样本。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：样本预处理试剂盒及样本预处理工作流程。（A）将样本转移至液化管中，并通过手动振荡进行均质化。（B）将均质化后的样本从液化管转移至裂解管中。（C）将裂解管放入样本预处理（SP）装置中，进行自动化的液化-裂解循环。（D）预处理耗材：#1 和 #2 一次性移液管（红色箭头指示样本加载标记）、裂解管和液化管。缩写：SP = 样本预处理。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：芯片加载与自动化检测工作流程。（A）将试剂瓶O、试剂瓶B以及处理后的样本分别加载至芯片对应的端口（O、B和S）。（B）芯片完成组装并密封。（C）将芯片安装至自动化核酸分析仪上，并扫描条形码。（D）通过触摸屏启动运行，随后核酸提取、扩增及荧光检测将自动进行。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：从重症监护病房患者采集的10份下呼吸道标本获得的代表性扩增曲线。每个图示代表一份标本（S1–S10）。S形扩增曲线表示检测阳性，其标注的TP值为目标物浓度，而平坦曲线表示检测阴性。标本S1仅含有Aspergillus spp.；标本S2–S5含有Aspergillus spp. 以及细菌病原体和/或Candida albicans；标本S6–S9含有多种细菌混合感染；标本S10仅含有Streptococcus pneumoniae。相应的TP值见表5。缩写：Aba = Acinetobacter baumannii；Asp = Aspergillus spp.；Bcc = Burkholderia cepacia；Cal = Candida albicans；Cst = Corynebacterium striatum；Eco = Escherichia coli；Hin = Haemophilus influenzae；IC = 内部对照；Kpn = Klebsiella pneumoniae；Lpn = Legionella pneumophila；Mpn = Mycoplasma pneumoniae；Pae = Pseudomonas aeruginosa；Pji = Pneumocystis jirovecii；Sau = Staphylococcus aureus；Sma = Stenotrophomonas maltophilia；Spn = Streptococcus pneumoniae。 请点击此处查看该图的放大版本。

孔靶标缩写类别类型
1Acinetobacter baumanniiAba细菌细菌
2Aspergillus spp.Asp真菌真菌
3Burkholderia cepaciaBcc细菌细菌
4Candida albicansCal真菌真菌
5Corynebacterium striatumCst细菌细菌
6Escherichia coliEco细菌细菌
7Haemophilus influenzaeHin细菌细菌
8Klebsiella pneumoniaeKpn细菌细菌
9Legionella pneumophilaLpn细菌细菌
10Mycoplasma pneumoniaeMpn非典型非典型细菌
11Pseudomonas aeruginosaPae细菌细菌
12Pneumocystis jiroveciiPji真菌真菌
13Staphylococcus aureusSau细菌细菌
14Stenotrophomonas maltophiliaSma细菌细菌
15Streptococcus pneumoniaeSpn细菌细菌
16NBPF (internal control)IC内参内参

表1：靶向病原体检测面板及反应孔分配。

耗材规格 / 体积功能
Liquefaction tube2 mL/管接收样本；用于手动均质化
Lysis tube0.5 mL/管带有可压缩硅胶体和200 µm滤膜；预装裂解试剂
#1 一次性移液管0.5 mL将均质化后的样本转移至裂解管中
#2 一次性移液管2 mL将样本吸至刻度线并转移至液化管中

表2：样品预处理过程中所用耗材的规格。

步骤温度持续时间
液化50 °C10 min
病原体裂解95 °C5 min
总循环时间—~15 min

表3：样品预处理（SP）装置循环的操作参数。

靶标TP 阈值（分钟）判读规则
Acinetobacter baumannii13TP ≤ 阈值 = 阳性
Aspergillus spp.15.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Burkholderia cepacia12.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Candida albicans13.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Corynebacterium striatum13TP ≤ 阈值 = 阳性
Escherichia coli12TP ≤ 阈值 = 阳性
Haemophilus influenzae13.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Klebsiella pneumoniae15.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Legionella pneumophila14.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Mycoplasma pneumoniae14TP ≤ 阈值 = 阳性
Pseudomonas aeruginosa12TP ≤ 阈值 = 阳性
Pneumocystis jirovecii14.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Staphylococcus aureus15.5TP ≤ 阈值 = 阳性
Stenotrophomonas maltophilia12TP ≤ 阈值 = 阳性
Streptococcus pneumoniae14.5TP ≤ 阈值 = 阳性
NBPF（内参对照）12若 TP < 12 分钟，则运行有效

表4：用于目标分类的TP阈值

标本类型检出目标TP（分钟）培养 / tNGS（读数）
S1BASAspergillus spp.8+ / 1,253
S2BASAspergillus spp.7.5– / 3,877
Pseudomonas aeruginosa4+ / 55,039
Stenotrophomonas maltophilia6.5– / 3,087
S3BASAspergillus spp.5.5+ / 6,145
Burkholderia cepacia6– / 3,221
Candida albicans7.5– / 3,280
Stenotrophomonas maltophilia6+ / 13,189
S4BALFAcinetobacter baumannii6.5+ / 10,485
Aspergillus spp.7.5– / 4,432
Burkholderia cepacia5.5– / 1,676
Candida albicans8.5– / 576
S5BALFAspergillus spp.7.5+ / 2,869
Burkholderia cepacia4– / 6,532
Corynebacterium striatum5.5– / 71,839
Escherichia coli7– / 1,891
Pseudomonas aeruginosa4+ / 31,386
Staphylococcus aureus6.5– / 26,683
Stenotrophomonas maltophilia4+ / 21,467
S6BASBurkholderia cepacia5.5– / 1,984
Escherichia coli5.5+ / 8,005
S7BASAcinetobacter baumannii5.5+ / 28,007
Burkholderia cepacia4+ / 3,585
Haemophilus influenzae6.5– / 8,912
Stenotrophomonas maltophilia6– / 8,865
S8BASAcinetobacter baumannii5.5– / 43,721
Burkholderia cepacia4– / 53,796
Klebsiella pneumoniae3.5+ / 23,757
Stenotrophomonas maltophilia4– / 26,898
S9SptHaemophilus influenzae9– / 3,636
Staphylococcus aureus8.5+ / 1,918
Stenotrophomonas maltophilia8.5– / 872
S10SptStreptococcus pneumoniae5.5– / 29,893

表5：从重症监护室患者采集的10份代表性下呼吸道标本的检测结果及TP值。

靶标tNGS +POCT +tNGS −POCT −PPANPA(SC) PPA/NPA
Acinetobacter baumannii3377100%100%100% / 87.5%
Aspergillus spp.5555100%100%100% / 71.4%
Burkholderia cepacia6644100%100%100% / 44.4%
Candida albicans2288100%100%– / 80.0%
Corynebacterium striatum1199100%100%100% / 100%
Escherichia coli2288100%100%100% / 88.9%
Haemophilus influenzae2288100%100%– / 80.0%
Klebsiella pneumoniae1199100%100%100% / 100%
Legionella pneumophila001010–100%– / 100%
Mycoplasma pneumoniae001010–100%– / 100%
Pseudomonas aeruginosa2288100%100%100% / 100%
Pneumocystis jirovecii001010–100%– / 100%
Staphylococcus aureus2288100%100%100% / 88.9%
Stenotrophomonas maltophilia6644100%100%100% / 50.0%
Streptococcus pneumoniae1199100%100%– / 90.0%

表6：本检测方法与靶向宏基因组高通量测序（tNGS）及传统痰培养对10份代表性样本中各靶标检测的一致性结果。 针对15种病原体靶标，分别列出每种方法检测出的阳性与阴性结果数量，以及相应的阳性百分比一致性（PPA）和阴性百分比一致性（NPA）。缩写：PPA = 阳性百分比一致性；NPA = 阴性百分比一致性；tNGS = 靶向宏基因组高通量测序；当无阳性（或阴性）参考结果时，PPA/NPA以“/”表示。

编号病原体检测下限（拷贝/mL）
1Acinetobacter baumannii1,000
2Aspergillus spp.2,000
3Burkholderia cepacia2,000
4Candida albicans1,000
5Corynebacterium striatum1,000
6Escherichia coli4,000
7Haemophilus influenzae2,000
8Klebsiella pneumoniae4,000
9Legionella pneumophila2,000
10Mycoplasma pneumoniae1,000
11Pseudomonas aeruginosa2,000
12Pneumocystis jirovecii1,000
13Staphylococcus aureus2,000
14Stenotrophomonas maltophilia2,000
15Streptococcus pneumoniae4,000
16内标（NBPF）不适用（内标）

表7：各检测面板靶标的分析检测下限（LoD）。 LoD通过将经数字PCR定量的基因组核酸加入至阴性支气管肺泡灌洗液基质中，进行系列稀释后以三复孔检测确定，定义为在至少95%的重复样本中可检测到的最低浓度。数值以拷贝数/mL表示。缩写：LoD = 检测下限。

维度即时检测（本检测）痰培养常规PCRmNGS
周转时间约1 h2–5 天4–8 h> 24 h
操作人员技能要求低高高高
实验室要求低；可在床旁进行高；需细菌学实验室高；需PCR实验室高；需专门设施
设备投入成本低至中等低中等高
单次检测成本中等低中等高
分析灵敏度高低高高
主要优势完全集成化，样本进、结果出，无需专业操作参考标准；可提供药敏结果高灵敏度；可定量无偏倚；可检测罕见或意外病原体；适用于疑难病例

表8：当前即时检测方法与痰培养、常规PCR及宏基因组测序的定性比较。 各方法在周转时间、操作人员技能要求、实验室基础设施需求、设备投入、单次检测成本、分析灵敏度以及主要优势方面进行比较。缩写：POCT = 即时检测；PCR = 聚合酶链式反应；mNGS = 宏基因组高通量测序。

讨论

快速病原体鉴定在重症监护室感染管理中至关重要。本文所述系统将病原体鉴定时间从传统培养所需的3至5天缩短至1小时以内，这一时间窗口正是临床常需作出一线抗微生物药物决策的关键时期7。通过在单一密闭芯片内整合核酸提取、纯化及16重LAMP扩增步骤，该工作流程消除了手动DNA提取环节，而该环节一直是早期LAMP芯片平台主要的操作瓶颈15。最终实现仅需一次加样操作，且可由无需接受专门分子生物学培训的人员完成。

有几个操作步骤需要特别注意。标本质量至关重要。对于接受机械通气的患者，深部呼吸道样本（如支气管吸出物或支气管肺泡灌洗液）优于咳出的痰液，因为后者可能受到口咽部污染，从而掩盖真正的病原体信号。样本液化不完全是最常见的裂解不充分原因，因此应持续手动振荡，直至样本明显呈现水样状态。在芯片加样过程中，若试剂瓶或裂解管中的液体未完全排空，可能导致下游反应孔得不到足够的样本输入，从而引起特定通道的失败，此类情况可能被误判为阴性结果。此外，芯片盖的“两步扣合”关闭方式不仅仅是一个机械结构设计；它对于维持等温扩增所需的密闭顶空环境、防止蒸发损失具有必要作用。

故障排除相对简单。黏稠度较高的重症监护病房（ICU）痰液可能需要手动振荡超过推荐的1分钟。稀释样本（尤其是支气管肺泡灌洗液）可能需要加载两倍于标准移液体积的样本量，以补偿病原体密度较低的情况。若内参失败，定义为未出现S型扩增曲线或TP值大于12分钟，则提示样本细胞含量不足或芯片内流路系统出现故障。在此情况下，应采取的适当措施是采集新的样本，或使用新的芯片重复检测，而非对单个通道的结果进行重新解读。

该方法也存在重要的局限性。检测面板仅限于15种预定义的目标，无法检测列表之外的生物体，包括许多抗菌素耐药决定因子。每对引物针对目标生物体中一个保守的、物种特异性的区域，但属水平的Aspergillus检测除外；因此，未包含在该面板中的物种或菌株无法被检测到，且该面板无法捕获种内菌株水平的变异。由于16个孔中的每一个都含有专用的冻干引物组，该面板具有模块化特性，可在未来版本中重新配置以增加检测目标。

该检测的输出结果为定性结果。尽管检测值（TP值）可能与病原体负荷存在粗略的相关性，但不能替代定量培养结果或基于循环阈值的PCR定量估计。与所有在呼吸道标本上进行的核酸扩增检测一样，该检测本身无法区分定植与真正感染。因此，临床解读必须将芯片检测结果与炎症标志物（如C反应蛋白和降钙素原）、影像学发现、真菌生物标志物（包括半乳甘露聚糖和(1,3)-β-D-葡聚糖）以及患者的整体临床病程相结合。此外，该系统不提供抗菌药物敏感性数据，对于药敏检测，传统培养仍不可或缺。

最后，本研究中包含的所有标本均来自同一家三级重症监护病房（ICU），而不同医疗机构和患者群体之间的病原体流行情况及共感染模式可能存在差异。因此，本研究应被视为一项初步的概念验证性研究，旨在一小批经过刻意选择的代表性标本上验证该方案的可行性，而非用于评估诊断准确性。针对每个目标病原体的临床敏感性和特异性，以及与传统培养法和宏基因组高通量测序（mNGS）的一致性，将在一项计划中的前瞻性、连续入组、多中心研究中加以确立。

作为分析性能的初步评估，通过将经数字PCR定量的基因组核酸加入至阴性支气管肺泡灌洗液基质中，估算每个靶标的检测下限（LoD）。样品进行系列稀释后，每份样本重复检测三次。LoD定义为在至少95%的重复样本中可检测到的最低浓度。最终得到的LoD值在整套检测 panel 中介于1,000至4,000拷贝/mL之间（表7）。由于本初步研究中尚无法获得基于菌落计数的各生物体定量数据，后续工作将采用经正式定量的标准菌株进一步优化这些LoD估计值。

与现有诊断方法的比较进一步明确了该平台的定位。传统培养法虽然耗时较长，但仍是参考标准，可提供药物敏感性信息。宏基因组高通量测序可覆盖更广泛的病原体，但成本显著更高，周转时间更长（通常为24–48小时），且需要生物信息学分析支持，而许多重症监护病房无法在本地提供此类支持。9标准多重PCR检测 panels 缩短了获得结果的时间，但仍通常需要单独的核酸提取步骤，并且根据所用平台的不同，可能需要批量处理，从而引入额外的延迟10.

从成本角度来看，尽管正式的成本效益分析超出了本项初步研究的范围，但该平台解决了重症监护病房（ICU）中主要的实际成本驱动因素，包括培养以及传统或多重PCR（文中提供了不同方法间的定性比较） 表8）。其检测结果约需1小时，相比之下，痰培养需2–5天，常规PCR需4–8小时（通常需要批量处理）， >24小时即可完成宏基因组测序。由于该工作流程完全整合（样本进，结果出），仅需一次手动加样，无需单独的核酸提取步骤，可在床旁操作，无需专门的细菌学或分子生物学实验室及专业分子生物学技术人员，且采用封闭式一次性使用 cartridge，可降低因污染导致的重复检测。设备成本也较为适中，无需配备实时定量PCR仪或测序平台。对于重症监护病房（ICU）的危重患者，这种快速周转时间可能缩短不恰当经验性治疗的持续时间，并减少住院天数，从而带来间接但潜在显著的经济效益。

当前系统占据着独特的定位，其特点在于快速周转、操作简便以及封闭式检测 cartridge 的生物安全性，这些特性共同使其适用于床旁应用。包含三种真菌检测靶标是一项尤为重要的功能。 曲霉属 在10份标本中，有5份检测到spp.（TP范围：5.5–8分钟）。鉴于培养法已知的局限性以及半乳甘露聚糖检测诊断窗口期较短， 曲霉属5,6一种可在45分钟内获得的分子信号可能有助于更早地考虑靶向抗真菌治疗，但该早期信号的临床价值尚需通过前瞻性研究加以证实。

未来的研究方向十分明确。至少将关键耐药决定因素（如碳青霉烯酶基因和mecA）纳入检测面板，将有助于弥合病原体鉴定与经验性抗菌药物选择之间的差距。此外，随着真实世界（TP）数据集的不断扩大，基于配对扩增谱和临床元数据训练的机器学习模型，最终可能有助于区分定植与真正感染，但此类应用需要经过严谨的前瞻性验证。更广泛而言，在该检测平台的诊断性能被认为具有可推广性之前，有必要在地理上分布多样的重症监护病房（ICU）人群中进行多中心评估。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

非传染性慢性疾病-国家科技重大专项（编号：2023ZD0516500）、国家高水平医院临床研究基金（编号：2026-PUMCH-A-103）、CMB开放竞争项目（编号：24-561）以及北京协和医院人才培养项目（编号：UGG11571）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全自动核酸分析仪北京泰浩生物技术有限公司THE-T80-01TurboFlow T；执行离心式试剂分配、磁珠提取、LAMP 65 °C以及实时荧光检测（运行时间约45分钟）
#1 一次性巴斯德吸管中国台湾海门中泰实验设备厂定制一次性耗材；0.5 mL；用于将匀浆后的样本转移至裂解管
#2 一次性巴斯德吸管中国台湾海门中泰实验设备厂定制一次性耗材；2 mL；将样本吸取至液化管的标记线处
CD芯片北京宏阳辰晟科技有限公司定制一次性耗材；直径86 mm的圆盘，带有中央加样区（O、B、S端口）、磁珠纯化区，以及外圈含16个反应孔的环形区（15个病原体检测靶标 + NBPF内参对照）
LAMP反应试剂翌圣生物科技（上海）有限公司16730ES80CD芯片中预存的冻干LAMP反应试剂珠
液化管北京泰浩生物技术有限公司定制一次性耗材；2 mL/管；用于接收待手动均质化的样本
裂解管北京泰浩生物科技有限公司定制一次性耗材；0.5 mL/管；可压缩硅胶材质管体 200 µm 滤膜；预装裂解试剂
引物Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd定制CD芯片反应腔中嵌入的引物混合物
样品预处理装置北京泰浩生物技术有限公司THE-R10-02TS-2000；自动液化–裂解周期（约15 min）
单剂量小瓶 “B”中国广州瑞孚生物科技有限公司定制一次性耗材；预封装的芯片试剂，每次检测使用一个；储存于 4 °C 并平衡至室温（~25 °C) 上样前
单剂量小瓶 “O”广州锐非生物科技有限公司定制一次性耗材；预封装在芯片上的试剂；每次检测使用一个；储存于 4 °C 并平衡至室温（~25 °C) 上样前

参考文献

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