向早衰期人成纤维细胞递送端粒酶mRNA的优化反向转染方案

摘要

本文介绍了一种优化的反向转染方案，可高效将核苷修饰的人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA（hTERT mRNA）递送至衰老的人成纤维细胞。通过预先在培养表面包被hTERT mRNA-脂质复合物，可增强细胞对mRNA的摄取，从而实现端粒酶激活、端粒延长及部分细胞年轻化。然而，培养细胞最终会重新进入衰老状态或危机期，不会发生永生化。

摘要

细胞衰老伴随着细胞生理学的深刻变化，包括细胞膜流动性降低、内体运输受损、内吞能力减弱以及细胞外RNase活性增强，这些因素均会阻碍mRNA的有效递送。这些障碍限制了RNA技术在衰老细胞中的应用，特别是对于递送较大的治疗性转录本。本方案描述了一种优化的反向转染方法，可高效地将修饰的信使RNA（mRNA）递送至衰老的人类成纤维细胞。尽管本研究以人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA作为模型转录本，但该工作流程可广泛适用于其他mRNA。与传统转染方法不同——传统方法是在细胞贴壁后将RNA-脂质复合物加入培养基中，反向转染则是在接种细胞前先将复合物沉积于培养表面，从而使贴壁过程中的细胞与转染复合物直接接触。为最大化转染效率，本方案采用了核苷修饰的mRNA（含假尿苷和5-甲基胞苷）、延长的poly(A)尾、优化的复合物形成时间、RNase抑制剂、氯喹介导的内体pH瞬时升高、较高的细胞接种密度以及延长的孵育时间。采用该方法，在递送5 kb的hTERT mRNA转录本后，衰老成纤维细胞的转染效率可达约50%–80%。转染后24–48小时检测到端粒酶活性达到峰值。单次转染周期即可检测到端粒明显延长，而连续三次转染则导致显著但有限的端粒延伸。在转染后72–96小时内可观察到衰老相关表型的部分逆转，包括衰老相关β-半乳糖苷酶活性降低、p16和p21表达减少、细胞形态恢复以及复制性寿命延长。递送的hTERT mRNA在72–96小时内被降解，未观察到细胞永生化现象。该方案为向衰老细胞进行瞬时mRNA递送提供了一种实用方法，并可能适用于多种细胞类型和物种。

引言

逆转录转染方法是一种针对衰老细胞的关键性技术改进，可克服衰老细胞对常规转染方法所造成的基本障碍。与正向转染（即先将细胞接种并使其贴壁，再加入转染复合物）不同，逆转录转染是将悬浮状态的细胞直接接种到预先形成的hTERT mRNA-脂质复合物上。该技术通过在细胞贴壁这一关键阶段——此时细胞膜重塑最为活跃——最大限度地使细胞暴露于转染复合物中，从而显著提高衰老细胞的转染效率。

该方案的核心概念转变在于将衰老细胞视为一个独特的递送难题，而非仅仅视为难以转染的年轻细胞变体。在细胞衰老过程中，膜脂质组成发生全局性改变，包括磷脂、鞘脂和胆固醇的变化，这些改变影响了膜的流动性、曲率以及蛋白质-脂质相互作用，同时促进了衰老相关分泌表型^1,2,3。衰老细胞还表现出网格蛋白和小窝蛋白介导的受体介导内吞作用减弱，以及内吞运输路径的改变，部分原因是两亲蛋白-1（amphiphysin-1）表达下调以及小窝蛋白表达的代偿性变化，从而抑制了受体介导的摄取和信号传导^4,5,6。与此同时，Rab7调控的晚期内体-溶酶体轴以及更广泛的内体-自噬-溶酶体（EAL）网络出现功能失调，其中Rab7作为内溶酶体成熟和自噬体-溶酶体融合的主要调控因子，在衰老和神经退行性疾病中其功能受到干扰⁷。

衰老细胞通常会上调溶酶体加工与适应系统（LYPAS）的多个组分，包括由TFEB/TFE3驱动的溶酶体生成和分子伴侣介导的自噬，从而增加溶酶体数量。然而，单个溶酶体常表现出腔内pH值升高、膜损伤以及蛋白水解能力改变，导致尽管溶酶体数量增多，但仍出现功能障碍^8,9,10,11。总体而言，这些变化可更高效地将内吞物质导向降解性内溶酶体区室，从而增加递送的RNA或蛋白质在有效释放至胞质前即被降解的可能性^9,10,11。逆转录转染直接作用于细胞贴壁过程中膜结构重塑的最早时间窗口，强制细胞与mRNA-脂质复合物之间形成持续且高亲和力的接触，从而至少部分绕过完全贴壁的衰老细胞中受损的稳态内吞作用^4,5,6,12。

在RNA设计方面，本方案认为，在衰老背景下，简单的加帽加尾基础结构已不足够：必须进行完全的核苷修饰（例如，假尿苷或N1-甲基假尿苷联合5-甲基胞苷），以解偶联翻译过程与内涵体Toll样受体感知及I型干扰素的诱导。基础研究表明，将修饰核苷掺入RNA可抑制TLR3、TLR7和TLR8的活化，并显著降低树突状细胞的细胞因子产生，从而为当前核苷修饰mRNA平台降低的固有免疫原性提供了机制依据¹³近期关于mRNA-LNP疫苗和mRNA药物的综述强调，通过协同优化5′帽、非翻译区（UTRs）、编码序列和poly(A)尾，可提高mRNA的稳定性和翻译效率 体内 同时最大限度地减少先天免疫激活¹⁴特别是，poly(A) 尾巴的长度和结构已成为决定性因素 体外 转录mRNA的稳定性与翻译效率，推动了治疗性mRNA中延长或工程化设计poly(A)尾的研究¹⁵.

在此基础上，该方案在复合物形成和摄取过程中明确引入了针对胞外和内体RNase的保护措施，并利用氯喹等瞬时溶酶体趋向性试剂，实现了明确的内体逃逸窗口^16,17。氯喹长期以来被用作内体屏障的功能探针，可通过促进内体膜的破坏，使核酸货物逃逸至胞质，从而显著增强siRNA或反义寡核苷酸的靶点结合与沉默效果¹⁸。同时，对LNP递送的mRNA进行的活细胞和超分辨率成像研究表明，有效递送的关键瓶颈在于早期内体/再循环内体中极为罕见的逃逸事件，而非初始摄取本身，这凸显了为mRNA治疗药物主动设计内体逃逸步骤的重要性¹⁹。

总体而言，与衰老相关的膜动力学、内吞运输、溶酶体加工以及天然免疫激活等方面的改变，为高效的mRNA递送造成了显著障碍。本文所述的反向转染策略旨在克服这些局限性，通过结合优化的mRNA工程设计、RNase保护、增强的内体逃逸能力，以及使贴壁细胞直接接触预先形成的mRNA-脂质复合物来实现。尽管本研究以hTERT mRNA作为模型货物，但该工作流程可广泛适用于将其他大型治疗性mRNA转录本递送至衰老细胞及难转染细胞群体^20,21,22。

方案

1. 体外 hTERT mRNA的转录

1. 体外转录（IVT），使用 ARCA 和 ΨUTP
   1. 根据表1配制20 µL的IVT反应体系。若需要更高的产量，可按线性比例放大反应体系。
   2. 除T7 RNA聚合酶外，将所有反应组分加入无RNase的离心管中。最后加入T7 RNA聚合酶，轻轻混匀，并短暂离心。
   3. 在37 °C孵育0.5–4小时。
      注意：根据模板长度调整孵育时间。对于较短的模板（约500 bp），孵育约30分钟；对于较大的模板（约4 kb），孵育3–4小时。
2. DNase处理
   1. 直接向IVT反应混合物中加入1 µL无RNase的DNase I。
   2. 在37 °C孵育15分钟。
      注意：应在IVT反应完成后直接进行DNase处理，无需事先纯化合成的mRNA。
3. mRNA纯化
   1. 加入115 µL无核酸酶的H₂O稀释反应混合物。
   2. 按照试剂盒说明书，使用RNA纯化试剂盒对mRNA进行纯化。
   3. 用20–30 µL无核酸酶的H₂O洗脱纯化的mRNA。
   4. 通过分光光度法测定mRNA纯度，并在1.0–1.5%变性琼脂糖凝胶或低浓度聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以验证RNA完整性。
4. 加poly(A)尾
   1. 根据表2配制50 µL的poly(A)加尾反应体系。轻轻混匀反应组分，在37 °C孵育30–60分钟。
      注意：根据输入RNA的量调整孵育时间。
   2. 加入2 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）终止反应。
5. 最终纯化与质量控制
   1. 按照试剂盒说明书，使用RNA纯化试剂盒对加poly(A)尾的mRNA进行纯化。
   2. 用20–30 µL无核酸酶的H₂O洗脱纯化的mRNA。
   3. 在进行转染前评估mRNA质量
      1. 在260 nm处测定mRNA浓度，并通过A260/A280和A260/A230比值确定纯度。选择A260/A280比值约为2.0、A260/A230比值大于2.0的mRNA样品。
      2. 使用凝胶电泳或RNA分析系统，按照说明书评估mRNA完整性。
      3. 通过RT-PCR或Bioanalyzer分析确认poly(A)尾长度，确保其长度在120至200个核苷酸之间。
      4. 将纯化的mRNA分装，于−80 °C保存，以尽量减少冻融循环次数。

2. 反向转染

1. 第 −1 天：转染前准备
   1. 验证衰老表型
      1. 对代表性细胞样本进行衰老相关性 β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色。确认超过 70% 的细胞呈阳性。
      2. 通过定量逆转录 PCR（qRT-PCR）或免疫荧光法确认衰老标志物（p16 和 p21）的表达。
      3. 测定细胞活力，并确认活力超过 90%。
   2. 准备试剂
      1. 将完全培养基预热至 37 °C。
      2. 将磷酸盐缓冲液（PBS）预热至 37 °C。
      3. 配制新鲜的 Opti-MEM I 培养基。
         注意：使用前请勿向 Opti-MEM I 中添加 RNase 抑制剂。
2. 第 0 天：转染日
   注意：从试剂准备到转染细胞孵育，预计耗时约 3 小时。
   1. hTERT mRNA 的准备
      1. 将 hTERT mRNA 在冰上解冻。测定 mRNA 浓度，使用浓度在 0.5 至 1.0 µg/µL 之间的样品。
      2. 根据所用培养体系，用 Opti-MEM I 稀释所需量的 hTERT mRNA（表 3）。加入 RNase 抑制剂至终浓度为 0.5–1.0 U/µL，并轻轻混匀。
      3. 稀释后的 mRNA 在形成复合物前应保持在冰上。
         注意：应在使用前立即加入 RNase 抑制剂。请勿将 mRNA 与 RNase 抑制剂共同储存，因其在冻融后活性会下降。
   2. 转染试剂的准备
      1. 在无菌、无 RNase 的离心管中，将 6.0 µL 转染试剂与 100 µL Opti-MEM I 混合。通过移液轻轻混匀。
      2. 室温孵育 5 分钟。
         注意：对于较大的 hTERT mRNA 构建体（约 5 kb），建议优化转染试剂与 mRNA 的比例，推荐范围为每 100 ng mRNA 使用 0.4 至 0.6 µL 转染试剂。
   3. mRNA-脂质复合物的形成
      1. 将稀释后的 hTERT mRNA 溶液（100 µL）加入稀释后的转染试剂溶液（106 µL）中。通过移液轻轻吹打 5–6 次混匀。
      2. 室温孵育 15–20 分钟。
      3. 复合物形成时间不得超过 30 分钟。
      4. 通过观察溶液是否呈现轻微浑浊来确认复合物成功形成。
         注意：在复合物形成期间，同步进行细胞准备。
   4. 反向转染的细胞准备
      1. 吸除衰老细胞培养物中的培养基。
      2. 用预热的 PBS（每孔 6 孔板加 2 mL）洗涤细胞一次。
      3. 每孔加入 500 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。
      4. 在 37 °C 下孵育 3–5 分钟。
      5. 用含血清的 3 mL 完全培养基中和胰蛋白酶。
      6. 轻轻吹打细胞，获得单细胞悬液。
      7. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。
      8. 用完全培养基配制每孔含 2.0–2.5 × 10⁵ 个细胞的悬液。
         注意：避免长时间胰蛋白酶消化，因为衰老细胞对机械应力高度敏感。细胞应保持在悬液状态，反向转染前不得预先铺板。
   5. 反向转染
      1. 培养板的准备
         1. 向 6 孔板的每孔加入 500 µL 0.01% 多聚-L-赖氨酸，室温孵育 30 分钟。
         2. 使用前立即吸除包被液。
         3. 将 200 µL hTERT mRNA-脂质复合物加至每孔中央。
         4. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
            注意：包被操作应与复合物形成和细胞准备同步进行。
      2. 细胞悬液的准备
         1. 将 2.0–2.5 × 10⁵ 个细胞悬浮于 1800 µL 无抗生素的完全培养基中。
         2. 轻轻重悬细胞，获得均匀的单细胞悬液。
            注意：转染期间应使用无抗生素的培养基。
      3. 将细胞悬液接种至复合物上
         1. 将 1800 µL 细胞悬液直接加至预先形成的 hTERT mRNA-脂质复合物上。
         2. 轻轻倾斜培养板，每个方向倾斜 2–3 次，使细胞均匀分布。
            注意：加细胞后请勿再次移液吹打，以免破坏 mRNA-脂质复合物。
      4. 细胞孵育
         1. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润化培养箱中孵育 6–8 小时。
         2. 转染后 2–3 小时，通过光学显微镜观察细胞贴壁情况。
         3. 确认细胞均匀分布并开始贴附于培养表面。
            注意：若漂浮细胞或细胞碎片过多，可能提示转染相关的细胞毒性。

3. 细胞毒性的缓解

1. 如果细胞损失超过20%，则将转染暴露时间缩短至48小时。
2. 在转染期间，向培养物中添加10 µM ROCK抑制剂Y-27632，以提高细胞存活率。
3. 转染6–8小时后，小心吸除转染培养基，尽量减少对部分贴壁细胞的扰动。每孔保留约100 µL残留培养基。
4. 向每孔中加入1 mL新鲜预热的完全生长培养基，并补充15% FBS。
5. 换液后立即加入氯喹，使其终浓度为10–20 µM。
6. 将培养物置于含5% CO₂的湿润化培养箱中，在37 °C下继续孵育2小时。
7. 用新鲜的完全生长培养基替换含氯喹的培养基。
8. 将培养物放回培养箱中继续培养。
   注意：在整个恢复期间应监测细胞形态和活力。细胞大量脱落或出现过多碎片可能提示转染相关的细胞毒性。

4. 转染后分析

1. 转染后24–48小时评估TERT蛋白表达。
2. 根据标准实验室操作，通过蛋白质印迹法或免疫荧光染色检测TERT蛋白水平。
3. 在相同时间区间内，使用适当的端粒酶活性检测方法测定端粒酶活性。
   注意：由于瞬时递送的hTERT mRNA发生降解，端粒酶活性通常在48小时后下降。
4. 转染后48–72小时，采用单色多重定量PCR（MMqPCR）或等效的端粒长度分析方法评估端粒长度。
   注意：成功递送hTERT mRNA后，可能观察到可检测的端粒延长现象。
5. 转染后7天评估衰老相关和 rejuvenation（再生）相关的表型
   1. 检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性。
   2. 检测p16和p21的表达水平。
   3. 评估Ki67的表达。
   4. 通过光学显微镜观察细胞形态。
      注意：将处理组培养物与未处理或模拟转染的衰老对照组进行比较，以评估衰老相关表型及增殖特性的变化。

5. 重复给药方案（可选）

1. 按照第2–4节所述进行初次转染。
2. 根据以下时间表重复转染：第0天：第一次转染；第5天：第二次转染；第10–12天：第三次转染。
3. 将细胞维持为贴壁培养状态，在后续转染前不要进行胰酶消化。
4. 按照第2.2.1–2.2.3节所述制备新鲜的hTERT mRNA–脂质复合物。
5. 吸去每个孔中的培养基。
6. 直接向每个孔中加入200 µL hTERT mRNA–脂质复合物。
7. 加入复合物后立即向每孔加入800 µL新鲜完全F-10培养基。
8. 将细胞置于含5% CO₂的湿润化培养箱中，在37 °C下孵育4–6小时。
9. 用新鲜完全培养基替换转染培养基。
   注意：为尽量减少累积性转染相关细胞毒性，处理次数最多不超过三个转染周期。

6. 正向转染方案（2 µg/mL，6 孔板格式）

1. 第 −1 天：细胞接种
   1. 使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化衰老或早期衰老的成纤维细胞。
   2. 用完全培养基中和胰蛋白酶。
   3. 测定细胞数量和活力。
   4. 以每孔 2.0–2.5 × 10⁵ 个细胞的密度将细胞接种至 6 孔板中。
   5. 将细胞在含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中于 37 °C 培养过夜，直至细胞汇合度达到约 60–80%。
2. 第 0 天：hTERT mRNA–试剂复合物的制备
   1. 将一份核苷酸修饰的 hTERT mRNA 在冰上解冻。
   2. 在无 RNase 的无菌离心管（A 管）中，用 Opti-MEM 将 hTERT mRNA 稀释至终浓度为 2 µg/mL。
   3. 向 A 管中加入 RNase 抑制剂，终浓度为 0.5–1.0 U/µL，并轻轻混匀。
   4. 在另一支无 RNase 的离心管（B 管）中，用 Opti-MEM 稀释转染试剂，每 100 ng mRNA 使用 0.4–0.6 µL 试剂。
   5. 在轻柔混匀的同时，将 B 管中的溶液逐滴加入 A 管中。
   6. 将混合液在室温下孵育 15–20 分钟。
3. 第 0 天：正向转染
   1. 确认细胞汇合度为 60–80%，且形态健康。
   2. 吸除培养基。
   3. 用 1–2 mL 预热的 PBS 洗涤细胞一次。
   4. 向每孔中加入 0.5 mL 预热的完全培养基或减血清培养基。
   5. 可选：加入氯喹至终浓度为 10–20 µM。
   6. 向每孔中加入 0.5 mL 在步骤 6.2.6 中制备的 hTERT mRNA–试剂复合物。
   7. 轻轻摇动培养板，使复合物均匀分布。
   8. 将细胞在含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中于 37 °C 孵育 4–6 小时。
      ​注意：如有必要，衰老细胞的孵育时间可延长至 6–8 小时。
   9. 吸除转染液。
   10. 向每孔中加入 2.0 mL 新鲜完全培养基。
   11. 按照第 4 节所述进行转染后分析。
       注意：比较正向与反向转染条件时，应使用同一批次的 hTERT mRNA、相同的转染试剂和相同的标称剂量。

结果

d2EGFP-T2A-hTERT modRNA 被设计为一个杂合开放阅读框，其中通过自剪切T2A肽将不稳定型EGFP（d2EGFP）报告基因与人TERT连接。所有构建体的完整核苷酸序列和蛋白质序列均提供于 补充文件 1。编码序列两侧为合成的5'端′ 非翻译区（UTR）和3′ 人类UTR β-珠蛋白以增强翻译效率和mRNA稳定性（图1A）。表达盒还包含一个合成的酶稳定序列（Es）和一个合成的转录增强序列（TEs），旨在提高T7聚合酶的持续合成能力并减少转录提前终止。在克隆至T7启动子下游后， 体外 使用抗反向帽类似物（ARCA）和修饰核苷酸（m5CTP 和 ΨUTP），随后通过酶法添加多聚A尾（约120–200 nt），以生成具有帽子结构、多聚腺苷酸化、高完整性的d2EGFP-T2A-hTERT修饰RNA（modRNA）图1A).

自动化电泳RNA分析证实了转录本的高效合成，结果显示在多种输入量下均存在预期大小的主要RNA条带，且降解产物极少，符合全长修饰RNA（modRNA）成功生成的特征（图1B）。将2 µg/mL的d2EGFP-T2A-hTERT modRNA转染至早期衰老的LF1成纤维细胞后，24小时内即可检测到hTERT蛋白表达，并在48–96小时内维持较高水平，表明合成转录本实现了持续翻译（图1C）。对共表达的d2EGFP报告基因的分析显示，反向转染后荧光信号强烈，而正向转染后的荧光信号明显较弱（图1D、E）。这些结果表明，在早期衰老的LF1成纤维细胞中，采用反向转染策略可显著提高hTERT modRNA的递送效率与表达水平。

每隔5天对早期衰老的LF1成纤维细胞进行多次正向转染（FT），使用d2EGFP-T2A-hTERT modRNA，结果显示其平均端粒长度（rT/S）相较于模拟转染对照组逐步增加，该结果通过单色多重定量PCR（MMqPCR）测定（图2A）。每次FT循环后，rT/S比值均有所上升，统计学显著性从*P < 0.05提升至**P < 0.01。

采用相同的给药方案进行逆转录转染（RT），端粒长度的增加更为显著。每次RT循环后，rT/S比值均有所上升，并与模拟转染对照组相比达到极显著差异（*P < 0.05 至 ****P < 0.0001）（图2B）。在经过三个处理周期后，对FT和RT进行直接比较表明，两种方法均能显著提高rT/S值，与模拟转染对照组相比差异显著；然而，在相同的给药剂量和时间条件下，RT引起的增幅大于FT（*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001）（图2C）。

长期生长分析进一步表明，重复递送hTERT modRNA可延长细胞的复制寿命（图2D）。接受一次、两次或三次处理周期的细胞，其累积群体倍增数逐步高于模拟转染对照组。在接受三轮hTERT modRNA处理的细胞培养物中，尤其是通过RT方法处理的样本，在约250天内其生长曲线与对照组相比表现出最显著的差异（最高达****P < 0.0001）。群体倍增数的计算结果见补充文件2。

转染了d2EGFP-T2A-hTERT modRNA的早衰期LF1成纤维细胞在转染后48小时显示出强烈的TRAP梯状条带，而对照组及转染eGFP-modRNA的细胞仅表现出背景信号，表明端粒酶活性来源于外源性hTERT的表达（图3A）。加热预处理消除了梯状条带模式，证实了该检测的特异性（图3B）。

时间过程分析表明，端粒酶活性在转染后24至48小时达到峰值，随后逐渐下降，在72至96小时恢复至接近基础水平（图3C）。将hTERT modRNA浓度从50 ng/mL增加至3,000 ng/mL，TRAP信号强度相应增强，表明端粒酶激活具有剂量依赖性（图3D）。

利用野生型、催化失活型（CI）和缺乏核定位信号（ΔNLS）的hTERT构建体进行的功能分析表明，只有野生型hTERT能够产生显著的端粒酶活性。尽管递送条件相似，CI和ΔNLS两种突变体均未能诱导出可比的活性（图3E）。与这些结果一致，MMqPCR分析显示，仅在接受野生型hTERT modRNA的细胞中，平均端粒长度显著增加（rT/S ≈ 1.4）；而接受CI-hTERT、ΔNLS-hTERT或模拟处理的细胞，其端粒长度仍接近基线水平（rT/S ≈ 0.3；****P < 0.0001）（图3F）。

每隔5天进行一次hTERT modRNA的反向转染，连续进行三轮，可显著降低衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例。在最后一次转染后15天，对照组培养物中阳性细胞的比例约为85%，而hTERT处理组则降至约40%（***P < 0.001）（图4A）。

共聚焦免疫荧光染色显示，接受三轮hTERT反向转染的细胞中Ki67表达较模拟处理对照组升高，表明增殖活性增强（图4B）。RT-qPCR分析进一步表明，hTERT处理后衰老相关标志物p16和p21的表达降低。与模拟处理的早期衰老细胞相比，p16的表达从约2.3倍降至0.7倍，p21的表达从约11倍降至6倍（**P < 0.01；****P < 0.0001）（图4C、D）。补充图1进一步显示，在模拟转染细胞中，单独使用氯喹（CQ）或Y-27632处理对p16或p21的表达无显著影响。相反，在三轮hTERT反向转染过程中联合使用CQ和Y-27632，相较于单独hTERT反向转染或任一单药处理，对p16和p21表达的降低作用最为显著，而单药处理则产生中等程度的效果。这些结果表明，CQ与Y-27632联用可增强hTERT mRNA反向转染后衰老相关标志物表达的下调。综上所述，这些结果证明，重复进行hTERT mRNA反向转染可促进端粒延长，降低衰老相关标志物水平，并增强早期衰老LF1成纤维细胞的增殖特性。

图 1： 在早衰期 LF1 成纤维细胞中 d2EGFP‑T2A‑hTERT mRNA 的设计、合成及功能验证。 （A）嵌合型 hTERT mRNA 构建体的示意图，该构建体包含 T2A 肽连接的 d2EGFP 盒，可同时表达 hTERT 和不稳定型 EGFP。d2EGFP-T2A-hTERT 开放阅读框（ORF）两侧分别为人 β 珠蛋白基因（HBB）的 3’ 非翻译区（UTR）和合成的 5’ UTR。该 mRNA 通过修饰核苷酸进行体外合成，并最终添加 poly(A) 尾。 （B）通过自动化电泳 RNA 分析检测 in vitro 转录法高效合成高完整性 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA 的结果。 （C）转染 2 µg/mL d2EGFP-T2A-hTERT mRNA 后，采用基于毛细管的自动化免疫分析法对 hTERT 蛋白表达进行的时间进程分析。 （D）通过检测正向转染（FT）与反向转染（RT）条件下 EGFP 的表达水平，评估 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA 转染在早衰期原代二倍体成纤维细胞（LF1）中的有效性和表达情况。比例尺 = 10 µm。 （E）正向或反向转染后 eGFP 信号的平均荧光强度（MFI）定量分析。每种条件共分析 20 张独立图像，涵盖 5 个生物学重复中 4 个不同区域。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。 **P < 0.01；通过带 Welch 校正的非配对 t 检验进行评估。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：早衰期LF1成纤维细胞经多次正向与反向hTERT mRNA转染后的端粒长度动态变化及增殖寿命。（A）采用端粒MMqPCR法测定平均端粒长度（rT/S）。在群体倍增次数（PD）#76时开始，对早衰期成纤维细胞连续5天间隔进行三次正向转染（FT），转染物为d2EGFP-T2A-hTERT mRNA。误差线表示标准误（SEM）；n = 5个生物学重复；*P < 0.05，**P < 0.01，与仅接受模拟处理的细胞相比。（B）与（A）类似，在PD#76开始，对早衰期细胞连续5天间隔进行三次重复转染（RT），转染d2EGFP-T2A-hTERT mRNA。误差线表示SEM；n = 7个生物学重复；*P < 0.05，****P < 0.0001，与仅接受模拟处理的细胞相比。（C）在连续5天间隔进行三次正向和反向转染后，或仅进行模拟处理后的平均端粒长度（rT/S）比较。误差线表示SEM；n = 10个生物学重复；*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001。（D）LF1成纤维细胞在PD#76开始，每隔5天依次转染一次、两次或三次2 µg/ml d2EGFP-T2A-hTERT mRNA，或仅进行模拟处理的生长曲线。黑色箭头指示处理时间点。每条生长曲线重复三次，每个群体均设三个技术重复。每个生物学样本设3个技术重复，数据表示为均值±标准差（SD）。*P < 0.05，**P < 0.01；****P < 0.0001，通过Brown-Forsythe和Welch's ANOVA检验评估。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：具有催化活性且定位于细胞核的hTERT mRNA可驱动端粒酶活性出现短暂的、剂量依赖性激增，单独此效应足以促进早衰期LF1成纤维细胞中可测量的端粒延长。（A）将处于早衰期的细胞分别转染模拟物（mock）、eGFP或d2EGFP-T2A-hTERT mRNA。转染后48小时，从20,000个细胞中制备细胞提取物，并进行TRAP检测。反应产物在非变性PAGE凝胶上电泳，并用SYBR Green染色。（B）通过TRAP检测测定的热介导端粒酶失活情况。（C）对早衰期LF1细胞在转染hTERT mRNA后随时间变化的端粒酶活性进行分析，结果显示活性在72小时内恢复至基线水平，表明酶活性为短暂激活。（D）向早衰期LF1细胞中加入不同剂量的d2EGFP-T2A-hTERT mRNA（0–3,000 ng/mL），结果显示端粒酶活性随剂量增加而升高。（E）递送2 µg/ml TERT可提高早衰期LF1细胞中的端粒酶活性。ΔNLS突变体部分增强了端粒酶活性但未诱导端粒延长，因其在细胞质中发挥作用且不能转位至细胞核；而催化失活型（CI）TERT mRNA则未产生该效应，表明功能上存在差异。（F）功能性TERT、缺乏核定位信号（ΔNLS）以及催化失活型（CI）TERT反向转染对早衰期LF1细胞平均端粒长度（rT/S）的影响，表明具有催化活性并定位于细胞核的TERT在端粒延长中的关键作用。误差线表示标准差（SD）；n = 7个生物学重复；****P < 0.0001，与仅用模拟物处理的细胞相比，经单因素方差分析结合Welch校正评估。每条带下方标注了RTA%（相对端粒酶活性，占对照的百分比）。通过以下公式计算每条带TRAP样本梯形条带与ITAS条带（内参对照-IC）的强度比值：标准化活性_normalized = 梯形条带强度 / IC强度；每个样本均以阳性对照为基准计算其相对活性百分比（阳性对照：H1299细胞，2,500个细胞），公式如下：相对活性（%）= 样本的Activity_normalized / 参照的Activity_normalized。每一步均进行了背景扣除。请点击此处查看该图的放大版本。

图4优化的hTERT mRNA反向转染部分逆转了早衰期LF1成纤维细胞的衰老相关表型，并恢复了增殖标志物。 (A代表性图像 β经连续3次、每隔5天转染修饰的hTERT mRNA后表达β-半乳糖苷酶的早期衰老LF1细胞。比例尺 = 100 µm. β-gal 表达在末次转染后 15 天进行分析。实验重复进行了三次。 >每份样本手动计数100个细胞。B代表性共聚焦显微镜图像（20倍放大），显示早期衰老的LF1细胞，经增殖标志物Ki67染色。比例尺 = 100 µm. hTERT 反向转染3轮后，Ki-67表达显著增加。经过3轮反向转染后，Ki67阳性细胞核的比例显著升高× hTERT（RT）。该图表示平均值 ± Ki67阳性细胞核计数的标准差，以Mock转染组为归一化对照。每种实验条件下共检测18张图像，从每个生物学重复中选取6个不同的视野，共计n = 3个生物学重复。****P < 0.0001. (C) 3 天后衰老标志物的表达× 通过RT-qPCR评估的hTERT介导的局部重编程（n = 6）。所有数据均表示为均值 ± SD。P < 0.01; ****P < 通过采用 Welch 校正的非配对 t 检验评估，p 值为 0.0001。 请点击此处以查看此图的放大版本。

组分	体积/终浓度
PCR 模板 DNA	200 –1000 ng
10× IVT 缓冲液	2 μL
ATP (100 mM)	2 μL (终浓度 10 mM)
GTP (100 mM)	1.5 μL (终浓度 7.5 mM)
CTP (100 mM)	2 μL (终浓度 10 mM)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)	2 μL (终浓度 10 mM)（可通过以 1:4–2:2 的比例加入普通 UTP（m1Ψ-5′-TP:UTP）来提高假尿苷三磷酸的掺入率）
ARCA (10 mM)	4 μL (终浓度 2 mM)
RNase 抑制剂 (40 U/μL)	0.5 μL (20 U)
T7 RNA 聚合酶 (50 U/μL)	2 μL (100 U)
无核酸酶水（Nuclease-free H₂O）	20 μL

表1： 体外转录（IVT）反应体系组成，用于合成核苷修饰的hTERT mRNA。 列出了用于ARCA加帽IVT合成的反应组分及最终用量。

组分	体积/终浓度
纯化的 mRNA，最多 5 μg	≤20 μL
10× Poly(A) 加尾缓冲液	5 μL
ATP (10 mM)	5 μL（终浓度 1 mM）（尽管缓冲液中已含有 ATP，额外添加有助于 poly A 尾的稳定）
Poly(A) 聚合酶 (5 U/μL)	1 μL (5 U)
无核酸酶水（Nuclease-free H₂O）	加至总体积 50 μL

表2：用于hTERT mRNA转录后修饰的poly(A)加尾反应组成。 显示了生成120–200个核苷酸长度poly(A)尾所需的试剂体积和反应条件。

参数	12孔板规格	6孔板规格
生长表面积	~3.8 cm²	~9.5 cm²
每孔培养基体积	1.0 mL	2.0 mL
细胞接种数量	5× 104–6.5× 104 Cells/ml	2.0–2.5 × 10⁵
平均细胞数量（100% 汇合时）	5.7× 104–7.2× 104 Cells/ml	2.9–3 × 10⁵
mRNA 转染量	750 –1000 ng	2000–3500 ng
mRNA 转染试剂用量	1.5 – 3.0 µL	4.75 – 7 µL
Opti-MEM 中 mRNA 与转染试剂的终体积	50 µL	200 µL

表3：在6孔和12孔培养体系中递送hTERT mRNA的推荐转染参数。 总结了用于正向和反向转染实验的细胞接种密度、mRNA用量、转染试剂体积以及复合物形成体积。

补充图1：重复hTERT mRNA反向转染后氯喹和Y-27632对衰老相关p16和p21表达的影响 (A) 空白处理组与3处理组中p16 mRNA表达的定量RT-PCR分析× 经氯喹（CQ）、Y-27632 或二者联合处理后的hTERT反向转染（RT）LF1成纤维细胞，如图所示。B) 在相同实验条件下对p21 mRNA表达水平进行定量RT-PCR分析。转录水平以RpL13a为内参进行标准化，并相对于年轻对照细胞（PD#12）表示。每个数据点代表生物学重复。数据表示为均值 ± n = 2 次生物学重复，每次生物学重复包含 5 次技术重复。统计学显著性在图中注明；ns，无显著性差异。*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001，由Brown–Forsythe和Welch's ANOVA确定。缩写：CQ，氯喹；RT，逆转录转染；Y-27632，Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。请点击此处下载此文件。

补充文件 1：hTERT 表达载体的 DNA 和蛋白质序列。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：群体倍增（PD）计算。 群体倍增（PD）使用公式 PD = log₂ (Nf/N₀) 计算，其中 N₀ 为接种的细胞数量，Nf 为收获的活细胞数量。累积 PD 通过累加各代次的 PD 值确定。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究将细胞衰老重新定义为一种独特的递送难题，而非增殖生理学的微小变异，并开发了一种针对衰老状态下的生物物理和免疫学限制而优化的端粒酶mRNA转染策略。衰老细胞具有硬化且富含胆固醇的细胞膜，以及降低的内吞活性，从而对核酸的有效递送构成了显著障碍。通过采用逆向转染方法，该方案利用衰老细胞在短暂贴壁期间发生的膜重塑过程及其膜可塑性增强的特性，使细胞与转染复合物的接触与摄取能力增强的时期实现同步^3,4。代表性结果表明，与传统的正向转染相比，该策略显著提高了hTERT modRNA的递送效率和表达水平，从而实现更明显的端粒延长以及更强的与 rejuvenation（再生）相关的表型变化。

该方法的核心是一种多层mRNA工程技术，旨在克服衰老细胞中的三大主要障碍：升高的固有免疫信号、增强的RNA降解以及受损的翻译能力^23,24,25。引入假尿苷和5-甲基胞苷可降低TLR3、TLR7/8及RIG-I信号通路的激活，同时提高转录本的稳定性和翻译效率^13,26。ARCA加帽和poly(A)尾优化进一步增强了转录本的稳定性与翻译产出，从而实现强效但短暂的hTERT表达。与先前研究一致，这些修饰可在最小化外源RNA递送所引发的固有免疫激活的同时，支持高效的端粒酶表达。

该方案还针对衰老细胞培养物特有的富含RNase的胞外环境进行了优化²⁷。通过核苷修饰、脂质复合物形成以及转染前立即添加RNase抑制剂，增强了RNA的保护效果。此外，逆转录转染的时间被调整以适应衰老细胞较慢的贴壁动力学，从而在细胞贴附过程中延长了细胞与mRNA-脂质复合物的相互作用时间。这些改进措施共同提高了在原本难以转染的细胞群体中成功递送 cargo 的概率。

内体逃逸是mRNA递送至衰老细胞的第二个关键瓶颈。衰老细胞表现出溶酶体含量增加，并增强了内吞物质向降解区室的转运^17,28。在转染后的早期阶段短暂暴露于氯喹可通过促进内体逃逸并减少内化mRNA的溶酶体降解，从而提高功能性递送效率。尽管最佳剂量和处理时间可能因细胞类型而异，但本文展示的结果表明，增强内体逃逸可显著提高mRNA在衰老成纤维细胞中的递送效率。

在功能层面，重复给予hTERT修饰RNA可导致端粒相对长度的累积性增加，延长复制性寿命，并减轻多种与衰老相关的表型。接受重复hTERT处理的细胞表现出SA-β-半乳糖苷酶活性降低、p16和p21表达减少、Ki67表达增加，以及增殖能力增强，相较于模拟转染对照组更为显著。值得注意的是，端粒酶活性仍为瞬时性，在转染后数天内即恢复至接近基线水平。这种瞬时表达特征避免了永久性的遗传修饰，同时仍能提供足够的端粒酶活性以产生可测量的生物学效应。然而需要指出的是，通过MMqPCR获得的端粒相对长度测量值并不能直接量化端粒的绝对延伸程度。未来结合末端限制性片段分析、定量荧光原位杂交、流式荧光原位杂交（Flow-FISH）或TeSLA等方法的研究，将有助于更精确地评估hTERT mRNA递送后的端粒长度动态变化。

该研究存在若干局限性，需加以考虑。衰老细胞群体本身具有异质性，其对mRNA递送的响应可能因衰老诱导方法、供体来源和培养历史的不同而存在差异。因此，不同实验体系之间的转染效率和 rejuvenation（恢复活力）效果可能存在差别。此外，端粒酶的重新激活主要针对细胞衰老中依赖端粒的方面，并不能直接纠正衰老的所有特征。即使端粒成功延长，与衰老相关的其他改变，如表观遗传漂移、线粒体功能障碍、蛋白质稳态失衡以及慢性炎症信号通路的异常，仍可能持续存在^29,30。因此，本实验方案应被视为一种用于研究并部分逆转端粒驱动型衰老的靶向工具，而非全面的细胞 rejuvenation（恢复活力）策略。

本方案中所述参数旨在为衰老的人类细胞提供实用的操作指南，其制定基于已发表的研究成果和实验经验，并通过反复优化而确定。细胞密度、转染试剂与mRNA的比例、复合物形成时间以及内涵体逃逸条件等因素可能需要根据具体的细胞类型和实验条件进行调整。因此，研究者应将文中报告的条件视为优化的起点，而非普遍适用的最终参数。

总之，本方案提供了一个可重复的框架，通过一种针对衰老细胞生理特征优化的反向转染策略，将修饰后的hTERT mRNA递送至衰老的人类细胞。该方法可实现端粒酶的瞬时重激活、可测量的端粒延长、复制性寿命的延长以及衰老相关表型的部分逆转。未来的研究应评估该策略在其他衰老细胞类型中的适用性，探索其与具有协同作用的 rejuvenation 干预手段联合应用的可能性，并推动其向临床转化。 体内 递送平台。因此，该方法为研究端粒生物学、细胞再生以及衰老研究中衰老的机制提供了有价值的工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ham's F-10 营养混合物	Thermo Fisher	11550043	细胞培养基。
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构类似物	New England Biolab	S1411L	对于大多数 RNA，帽结构可增加其稳定性，降低对外切核酸酶降解的敏感性，并促进 mRNA 起始复合物的形成。
5-甲基-胞苷-5´-三磷酸（5-甲基-CTP）	New England Biolab	N0432S	修饰的核苷三磷酸（NTPs）常用于降低体外转录 RNA 的免疫原性。
6 孔板	Corning	351146	用于在独立实验条件下培养和处理中到大体积的贴壁或悬浮细胞。
抗 Ki67 抗体（SP6）	abcam	ab16667	Ki67 主要在增殖细胞中表达。
细胞衰老检测试剂盒（SA-β-半乳糖苷酶染色）	cellbiolabs	CBA-230	利用 SA-β-半乳糖苷酶染色法鉴定衰老细胞
DNA LoBind 0.5 ml 管	Eppendorf	022431005	用于高效回收 DNA 和 RNA，避免任何损失
DNA LoBind 1.5 ml 管	Eppendorf	22431021	用于高效回收 DNA 和 RNA，避免任何损失
DNase I，无 RNase（1 U/μL）	Thermo Fisher	EN0521	DNase I，无 RNase，是一种内切核酸酶，可消化单链和双链 DNA。
大肠杆菌 Poly(A) 聚合酶	New England Biolab	M0276S	在大肠杆菌中，Poly(A) 聚合酶 I（PAP I）主要功能是作为模板非依赖性催化剂，将腺苷一磷酸（AMP）残基添加至 RNA 分子的 3' 末端。
胎牛血清	Thermo Fisher	A5256701	细胞培养血清补充剂
HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒	New England Biolab	E2065S	HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒（含加尾步骤）专为体外快速生产带有 ARCA 帽结构和 poly(A) 尾的 mRNA 而设计。通过 T7 RNA 聚合酶在共转录过程中掺入反向帽类似物（ARCA），合成带帽的 mRNA。
含 CleanCap 试剂 AG 的 HiScribe T7 mRNA 试剂盒	New England Biolab	E2080S	含 CleanCap 试剂 AG 的 HiScribe T7 mRNA 试剂盒可快速、高效地生产一种或多种转录本，每反应典型产量通常 ≥90 μg，
LongAmp Hot Start Taq DNA 聚合酶	New England Biolab	M0534S	LongAmp Hot Start Taq DNA 聚合酶在扩增长片段 PCR 产物方面表现出卓越性能。
M-MuLV 逆转录酶	New England Biolab	M0253L	M-MuLV 逆转录酶以引物起始，利用 RNA（cDNA 合成）或单链 DNA 作为模板，合成互补 DNA 链。
Monarch 旋转柱 RNA 纯化试剂盒（50 μg）	New England Biolab	T2040L	Monarch® 旋转柱 RNA 纯化试剂盒（50 μg）的主要功能是从酶促反应或提取混合物中纯化并浓缩最多 50 μg 高质量 RNA。
NEBuilder HiFi DNA 组装主混合液	New England Biolab	E2621L	NEBuilder HiFi DNA 组装主混合液可实现多个 DNA 片段的无缝组装，不受片段长度或末端兼容性的限制。由于其使用简便、灵活性高且采用简单的主混合液形式，该试剂在合成生物学领域以及多片段一步克隆中具有广泛应用。
Opti-MEM 减血清培养基	Thermo Fisher	31985070	在脂质-负载复合物形成过程中，用于最大化细胞转染效率。它提供一种优化的、化学成分明确的环境，可在减少标准血清补充需求的同时，保持哺乳动物细胞的高存活率。
PBS，pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）主要功能是为哺乳动物细胞和生物分子维持稳定的 pH 值和渗透压平衡。
PCR 条板	Thermo Fisher	AB0776	PCR 条板管（通常为 8 孔条或 12 孔条格式）的主要功能是在高通量热循环过程中容纳小体积液体反应体系。
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Millipore Sigma	P4707-50ML	聚-L-赖氨酸（PLL）氢溴酸盐用于细胞贴附的主要功能是包被带负电荷的固体表面（如玻璃或塑料），以形成高度黏附性的带正电荷基质。
假尿苷-5´-三磷酸（Pseudo-UTP- ΨUTP）	New England Biolab	N0433S	假尿苷-5´-三磷酸（Pseudo-UTP）常用于降低体外转录 RNA 的免疫原性。
核糖核苷酸溶液套装	New England Biolab	N0450L	包含 ATP、GTP、CTP 和 UTP 四种独立溶液
ROCK 抑制剂 Y-27632（盐酸二氢盐）	Stem cell technologies	72302	Y-27632 是一种细胞可渗透的、高效且选择性的 Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂。Y-27632 通过与 ATP 竞争结合催化位点，抑制 ROCK1（Ki = 220 nM）和 ROCK2（Ki = 300 nM）
RT-PCR 级水	Thermo Fisher	AM9935	RT-PCR 级水（常标注为无核酸酶水）的主要功能是作为超纯溶剂，用于对污染极为敏感的酶促反应，任何污染均可能导致样本降解或扩增抑制。
SUPERase·In RNase 抑制剂	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase 抑制剂是一种非人源蛋白类抑制剂，可通过非共价结合抑制最常见的、具有干扰性的 RNase，包括 RNase A、B、C、1 和 T1。
SYBR Green I 核酸凝胶染料	Thermo Fisher	S7563	SYBR™ Green I 核酸凝胶染料的主要功能是在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中可视化和定量双链 DNA（dsDNA）。
TransIT-mRNA 转染试剂盒	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	一种高效、低毒性的大 RNA 转染试剂
TRAPeze 端粒酶检测试剂盒	Millipore Sigma	S7700	TRAP（端粒重复扩增法）检测是一种广泛使用且灵敏的基于 PCR 的方法，用于检测和测量哺乳动物细胞及组织样本中的端粒酶活性。该方法包括三个主要步骤：端粒酶延伸端粒重复序列、通过 PCR 扩增这些产物，以及后续检测。
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Thermo Fisher	25300054	用于常规细胞传代（继代培养）和收获过程中从培养容器上解离贴壁哺乳动物细胞。