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X波段电子顺磁共振用于监测斑马鱼黑色素瘤异种移植中与黑色素相关的自由基变化 体内

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DOI：

10.3791/71542

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2026年7月17日

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1Department of Organic and Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Medical University of Warsaw, 2Novilet, 3Department of Functional Materials Physics, Institute of Physics, Faculty of Physics and Astronomy, Adam Mickiewicz University, 4Laboratory of Protein Engineering, Mossakowski Medical Research Institute, Polish Academy of Sciences

本文内容

摘要

本方案旨在利用斑马鱼异种移植模型评估黑色素瘤的发展 体内 电子顺磁共振（用于检测和分析黑色素自由基的光谱学技术），为黑色素瘤的临床前研究和治疗评估提供了一种新方法。

摘要

本方案介绍了一种新型 体内 应用X波段（9.5 GHz）电子顺磁共振波谱法监测斑马鱼中与黑色素相关的自由基动态Danio rerio黑色素瘤异种移植模型。该方法的目标是在生理相关的脊椎动物模型中，实现对胚胎发育过程中以及肿瘤-宿主相互作用中与黑色素相关的氧化还原变化进行直接、无标记且定量的评估。

利用黑色素固有的顺磁性，该方法可提供仅通过传统荧光成像无法获得的互补性生化信息。重要的是，所检测到的电子顺磁共振信号反映了黑色素聚合物中具有氧化还原活性的部分，因此可作为氧化还原敏感的读出信号，而非总色素含量的直接测量指标。

通过选择性检测色素型野生型胚胎中与黑色素相关的自由基、白化对照组中无信号、独立生物学重复样本间标准化电子顺磁共振信号存在统计学显著的发育变化，以及使用替代样品架和冷冻样品获得的可比结果，验证了该方法的性能。

通过结合X波段电子顺磁共振波谱与斑马鱼异种移植模型，本方案为黑色素瘤的临床前研究、氧化还原生物学研究以及黑色素生成调节干预措施的评估提供了一个可扩展、符合伦理且可转移的平台。

引言

本研究的总体目标是开发并验证一种可靠的 体内 斑马鱼中黑色素自由基的检测与定量方法斑马鱼)胚胎异种移植模型结合X波段（9.5 GHz）电子顺磁共振波谱法。该方法旨在实现对黑色素瘤发展过程中及药物干预下与黑色素相关的氧化还原过程进行直接、定量的评估。

黑色素是一类具有异质性的生物聚合物，广泛存在于多种生物的皮肤、毛发和眼睛中，负责其色素沉着。在多种黑色素中，真黑色素（eumelanin）和褐黑色素（pheomelanin）在生物学中发挥着不同的作用。真黑色素具有抗氧化和光保护特性，而褐黑色素在紫外线照射下可促进活性氧（ROS）的生成1,2,3。抗氧化与促氧化作用均与黑色素自由基的形成有关。在分子层面，黑色素是一种具有异质性的氧化还原活性聚合物，由含吲哚结构和醌类结构的亚基组成，可呈现多种理化状态，包括完全氧化的醌式结构、部分还原的半醌式自由基结构以及完全还原的氢醌式结构4,5,6。半醌自由基物种的相对丰度是动态变化的，受局部理化环境的影响，包括氧气浓度、活性氧（ROS）水平、金属离子相互作用、pH值、聚合程度以及黑素体的成熟状态7,8,9。

因此，需要能够对这些自由基浓度进行定量评估的方法，以更好地理解黑色素氧化还原状态的变化。在黑色素瘤中，黑色素细胞内黑色素生成的失调会促进黑色素瘤的发生和发展。这种失调通常与氧化还原状态的改变有关，并依赖于局部微环境条件。这使得黑色素的氧化还原活性成为肿瘤生物学中的一个重要因素10。因此，能够直接评估黑色素自由基的方法对于理解黑色素瘤的发病机制及治疗反应至关重要。

斑马鱼胚胎是研究色素沉着和黑色素瘤的强大 体内 模型。受精后5天内（即受精后120小时，hpf），根据欧盟指令2010/63/EU，它们不被归类为受保护动物，因此可在无需正式伦理审批的情况下进行高通量实验。其发育迅速、组织透明且已有成熟的实验方案，使斑马鱼非常适用于毒理学和药理学研究11,12。尤为重要的是，这种鱼类在遗传和生理上与人类具有显著相似性，参与黑色素生成的关键通路在进化上高度保守13。野生型斑马鱼主要产生真黑素，可作为生理性色素沉着的模型；而基于移植可产生真黑素和褐黑素的黑色素瘤细胞系的异种移植模型，则能够在生理相关的微环境中研究哺乳动物肿瘤的进展及药物反应14,15。

目前，基于荧光的成像技术是斑马鱼黑色素瘤异种移植研究中的标准方法。该方法可通过荧光染料（例如二氯二氢荧光素二乙酸酯，DCFDA）或转基因品系（Grx1-roGFP2、HyPer）实现对肿瘤生长、迁移及治疗反应的实时可视化16,17。然而，荧光技术主要提供形态学和空间信息，在捕捉生化反应及与氧化还原相关的过程方面存在局限性。此外，其检测结果可能受到光漂白、染料泄漏、荧光药物化合物的干扰，以及标记过程对细胞生理状态潜在影响的干扰。尤为关键的是，基于荧光的方法无法提供有关黑色素自由基或其动态氧化还原行为的直接信息。

电子顺磁共振波谱法提供了一种独特而强大的分析手段，因为它能够直接检测和定量顺磁性物质，包括稳定的黑色素相关自由基。真黑色素和褐黑色素均含有生成特征性电子顺磁共振信号的半醌基团，这些信号的相对贡献已被探索作为色素沉着状态和黑色素瘤进展的生物标志物18，19。重要的是，由于只有氧化还原活性的半醌组分直接贡献于检测到的信号，电子顺磁共振波谱法提供了与传统黑色素生成相关检测方法（如黑色素含量定量、酪氨酸酶活性或色素沉着分析）互补的信息。因此，电子顺磁共振信号强度应被理解为受局部物理化学条件影响的黑色素功能状态的氧化还原敏感性读数，而非总色素丰度的直接度量。

尽管大多数体内电子顺磁共振研究采用L波段系统（一种使用低频微波（约1–2 GHz）来研究顺磁性物质的电子顺磁共振光谱技术，尤其适用于需要更深信号穿透的较大样品）20，但X波段电子顺磁共振对小体积样品具有更高的谱分辨率和灵敏度，因此特别适用于斑马鱼胚胎。此外，近年来的技术进展，包括多谐波检测系统的应用，显著提高了信号质量，使得在具有挑战性的生物样品（体积小且含水量更高）中也能实现可靠的测量21,22。X波段谐振腔的尺寸适合容纳数个斑马鱼胚胎，结合其比L波段系统更高的分辨率，可减少实验所需动物数量。这一点在进行异种移植模型研究时尤为重要。

尽管具有这些优势，X波段电子顺磁共振在该模型中的活体斑马鱼胚胎及黑色素瘤异种移植瘤中的应用仍基本未被探索。体外研究利用黑色素瘤细胞系（如B16F10）已对黑色素自由基的性质提供了有价值的见解；然而，这些研究缺乏活体生物复杂的生理环境23,24。特别是，斑马鱼的微环境引入了若干关键因素——如氧浓度梯度、细胞间相互作用以及动态的代谢活性——这些因素可能显著影响黑色素自由基的行为25,26。因此，迫切需要开发并验证一种体内方法，以实现在生理相关条件下对黑色素自由基进行直接测量。

本研究中，我们介绍了一种将X波段电子顺磁共振波谱技术应用于斑马鱼胚胎（包括移植了B16F10和B16F1黑色素瘤细胞系的异种移植模型）的详细实验方案。该方法通过实现对黑色素自由基含量的定量评估，为基于荧光的成像技术提供了一种互补手段，从而揭示氧化还原动态过程。通过将荧光技术提供的结构与空间信息，与电子顺磁共振所提供的生化信息相结合，这一联合策略增强了斑马鱼模型在临床前黑色素瘤研究中的分析能力。重要的是，本方案中检测到的电子顺磁共振信号反映了黑色素聚合物中具有氧化还原活性的部分。因此，信号强度应被解读为一种对氧化还原状态敏感的读数，而非总黑色素含量的直接测量指标，并应结合总色素含量，作为与黑色素相关的氧化还原状态变化的指示。由于采用的是全生物体测量方法，且注射的黑色素瘤细胞数量有限，所检测到的信号主要代表整个斑马鱼胚胎/幼鱼水平上与黑色素相关的自由基整体变化，而非仅来源于异种移植部位的黑色素瘤特异性信号。这一区别在动态生物系统中尤为重要，因为在这些系统中，黑色素氧化状态的变化可能独立于总体色素含量的变化而发生。

方案

本研究使用受精后5天内（120 hpf）的斑马鱼（Danio rerio）胚胎。在此发育阶段，根据欧盟指令2010/63/EU，胚胎不被视为受保护动物，因此实验无需伦理委员会的正式批准。尽管如此，所有实验均遵循良好的实验室规范以及机构关于斑马鱼护理和使用的指导方针。

1. 试剂的配制及B16F1与B16F10小鼠黑色素瘤细胞系的培养

  1. 完全培养基的制备
    1. 向500 mL的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5.5 mL青霉素-链霉素溶液。
    2. 使用前将完全培养基预热至37 °C。
      注意：使用预热的溶液以尽量减少细胞操作过程中的热应激。
  2. 从冻存细胞中解冻并启动培养
    1. 在37 °C水浴中快速解冻冻存的细胞冻存管（约1–2分钟）。
    2. 用70%乙醇对冻存管外表面进行消毒。所有后续操作均需在无菌条件下进行。
    3. 将细胞悬液转移至含有9 mL预热完全培养基的15 mL锥形管中。保留少量原始悬液用于支原体 检测。
    4. 在室温下以200 × g离心5分钟。
    5. 吸除上清液 ，以去除残留的二甲基亚砜（DMSO；来自冻存液）。
    6. 用10 mL新鲜且预热的完全培养基重悬细胞沉淀。
    7. 将细胞转移至⌀9 cm的培养皿中，并轻轻以“8”字形晃动，使细胞均匀分布。
    8. 将细胞在37°C、5% CO₂及≥95%湿度条件下培养过夜。
    9. 16–24小时后更换为新鲜预热的完全培养基。
    10. 继续培养，直至细胞达到>80%融合度。随后进行传代培养（见步骤1.3）。
      注意：除培养皿外，也可使用无菌培养容器（如T形培养瓶）。若使用较小的培养皿或培养瓶，应按比例分装细胞，以维持相同的相对培养表面积。
  3. 细胞传代培养
    1. 移除细胞单层上的培养基。保留少量用于支原体检测。
    2. 向培养皿中加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
    3. 在室温下让PBS作用于细胞3–5分钟，以充分去除血清蛋白。
    4. 轻柔吸除PBS，注意避免细胞脱落。
    5. 加入1 mL细胞解离试剂，在37°C孵育至细胞变圆并脱落（孵育时间不超过5分钟）。
    6. 加入1 mL预热的完全培养基以终止酶解作用。
    7. 轻轻吹打细胞悬液数次，获得单细胞悬液。
    8. 将细胞以1:4至1:10的传代比例转移至含有预热完全培养基的新培养皿或T形培养瓶中。轻轻以“8”字形晃动，使细胞均匀分布。
    9. 将细胞在37 °C、5% CO₂及≥95%湿度条件下培养。
      注意：使用预热溶液（37 °C），所有操作均应在II级生物安全柜内无菌进行，并穿戴适当的个人防护装备。每2–3天或在细胞融合度达80–90%时进行传代。使用低代次细胞（解冻后<P20），记录传代次数，并定期监测培养物是否存在污染及形态学变化。
  4. 细胞冻存（建库）
    1. 使用健康、处于指数生长期的细胞（约70%–80%融合度）。
    2. 按照步骤1.3.1–1.3.7所述方法收获细胞，并将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
    3. 以300 × g离心2分钟。
    4. 弃去上清液，用冻存液将细胞重悬至1–5 × 106个细胞/mL。
    5. 将细胞悬液分装至已标记的冻存管中（注明细胞系、传代数、日期）。
    6. 使用程序降温盒在-80°C过夜冷冻。
      1. 作为替代方法，可采用嵌套式保温法：将冻存管插入专为1.5/2.0 mL管设计的小型泡沫塑料架中，再将该架置于较大的聚苯乙烯盒内。
        注意：这种双层结构设计旨在提供必要的热缓冲，以实现缓慢降温速率，这对成功冻存至关重要。
        注意：处理低温材料时必须佩戴隔热手套和面部防护装备。请遵循机构关于液氮和危险废物处理的指南。
    7. 在-80 °C过夜孵育后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。短期保存可将冻存管存放于-80 °C。
  5. 支原体检测
    1. 在细胞解冻、传代或冻存过程中收集少量培养基或细胞悬液。
    2. 根据制造商说明书，使用经验证的基于PCR或酶法的支原体检测试剂盒进行检测。
    3. 实验或细胞系建库应使用无支原体污染的培养物。
    4. 记录检测结果，并丢弃或隔离受污染的培养物直至清除污染。
      注意：应定期进行支原体污染检测。

2. 将癌细胞移植到斑马鱼幼鱼中

  1. 准备用于移植的癌细胞
    1. 将细胞培养至约80%汇合度。
    2. 按照步骤 1.3.1–1.3.7 所述收集细胞。
    3. 将细胞悬液转移至2 mL微量离心管中。
    4. 以 300 × g 室温下持续2分钟。
    5. 移除上清液，并用 1 mL 无菌 PBS 洗涤细胞沉淀。
    6. 重复步骤 2.1.4–2.1.5，并将细胞重悬于剩余的 PBS 中。细胞悬液浓度越高，沉降越少。
    7. 轻轻吹打悬浮液，直至获得均一的单细胞悬液。
      注意：使用200 µL移液器吸头，预先用45%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液润洗（预填充），以防止细胞在注射微针中沉降。
    8. 将细胞悬液置于冰上直至注射。
      注意：若出现细胞聚团，可将细胞悬液通过35–40 µm细胞筛过滤和/或使用0.01–0.05 mg/mL DNase I处理细胞。
  2. 斑马鱼卵的生产
    1. 在预计产卵的前一晚 收集时，将成年斑马鱼放入含有系统水（用于产卵）的繁殖缸中。
    2. 将水箱置于完全黑暗的环境中过夜；这样可确保在第二天早晨开灯时诱导产卵。
    3. 鱼类将在次日开灯后产卵。通过将鱼缸中的水倒入茶滤网来收集卵。
    4. 用E3培养基（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂，0.33 mM MgSO₄，pH 7.2）充分冲洗胚胎。2，0.33 mM MgSO₄4).
    5. 将受精卵转移至含有20–25 mL E3培养基的9 cm培养皿中。每个培养皿中放置的胚胎数量不超过50个。
    6. 将胚胎在28 °C下孵育至后续使用。
      注意：务必始终保持卵的湿润。
  3. 斑马鱼胚胎制备
    1. 在约36 hpf时手动去除胚胎的绒毛膜。
      1. 使用两把超细珠宝镊子（No. 5）。用其中一把镊子牢固但轻柔地夹住卵壳以固定卵子，用另一把镊子夹住靠近第一把镊子处的卵壳。
      2. 用镊子轻轻向相反方向拉动，制造一个小的裂口。小心扩大开口，直至胚胎滑出。
    2. 根据既定的斑马鱼实验方案，使用新鲜配制的三卡因溶液麻醉去壳胚胎幼虫27.
      注意：无绒毛膜的胚胎较为脆弱、易粘连，且必须避免暴露于空气中。操作斑马鱼胚胎时应使用玻璃移液管和琼脂糖包被的培养皿。 <3 dpf
  4. 制备显微注射针
    1. 使用无 filament 玻璃毛细管进行拉制 根据制造商指南设置参数的拉制仪。
    2. 使用精细镊子，分两步折断针尖：首先，在针尖最细处进行第一次轻微折断；然后，在细胞受阻位置精确地进行第二次折断。这样可形成一个最佳开口，既刚好允许细胞通过，又尽可能保持开口最小。
    3. 使用长款微量移液器将细胞悬液回填入针头，这是填充玻璃微毛细管的一个技巧。注意避免引入气泡。
      1. 使用尽可能高的细胞密度（最大浓度）制备悬液；具体细胞剂量通过注射装置的设置进行控制。
      2. 频繁用少量悬液补充针头，使针管内悬液柱高度不超过2 mm。这可最大限度减少细胞在针管内的沉降，确保注射过程中细胞分布更均匀、递送更稳定。
    4. 将装好样品的针安装到显微注射装置的针夹上。
    5. 调整注射压力和脉冲持续时间，以实现每次注射所需的细胞数量（注射的细胞悬液总体积不应超过注射时斑马鱼胚胎眼的大小）。
      注意：斑马鱼异种移植显微注射方法的详细示例此前已有描述 由其他作者28.
  5. 显微注射操作步骤
    1. 根据实验设计，将细胞悬液注射到卵黄囊或循环系统中。
    2. 在校准的注射条件下，每枚胚胎注射超过1000个细胞。
      注：以注射磷酸盐缓冲液（PBS）的胚胎作为阴性对照。
  6. 注射后的处理
    1. 将注射后的胚胎/幼虫置于 28-32 °C 条件下培养
    2. 每天在解剖显微镜下观察幼虫的存活情况和发育进程。
    3. 在选定的实验时间点评估肿瘤细胞的增殖和迁移。
    4. 按照第3.1节所述进行电子顺磁共振（EPR）测量，或按照第2.7节所述保存样品
      注意：丢弃存在注射损伤或注射不当的幼体。遵守所有机构的生物安全和动物护理指南。根据安全规程处理三卡因和生物废弃物。按照相关规定处置危险材料。
  7. 冷冻样本采集 
    1. 将幼虫浸入冰冷的三卡因溶液中至少3分钟以实施安乐死。
    2. 将10只幼虫一组转移至1.5 mL微量离心管中。移除每管中的多余培养基。
    3. 将样品于 -20 °C 保存，直至进行电子顺磁共振分析。

3. 通过电子顺磁共振波谱法检测黑色素自由基

  1. 斑马鱼幼鱼中黑色素自由基的检测 体内
    1. 打开X波段电子顺磁共振波谱仪，并根据制造商的说明让系统稳定。
    2. 将20–30条斑马鱼幼鱼（受精后3–5天，dpf）转移至1.5 mL微量离心管中。
    3. 用100 µL E3培养基填充斑马鱼幼鱼用的平口毛细管。
    4. 用塑料帽密封毛细管的一端，并确保液柱保持在扁平腔室内。
    5. 将数条幼虫连同少量E3培养基转移至100 µL血细胞比容毛细管中。
    6. 轻轻将血细胞比容毛细管中的幼虫放置在平坦部分的顶部。 
      注意： 注意保持溶液的连续性，扁平部分或扁平部分顶端附近不应有气泡。
    7. 在保持扁平腔室内液体持续接触的同时，去除毛细管外管段的多余液体。
    8. 重复步骤 3.1.5–3.1.7 直到有20–30只幼虫被装入平口毛细管中。
    9. 去除毛细管管状部分的残留液体。
    10. 将毛细管插入电子顺磁共振波谱仪中，并将样品置于谐振腔中心。
    11. 在波谱仪软件中设置采集参数如下： 中心磁场 = 335 mT；扫描宽度 = 10 mT；调制幅度 = 500 µT；微波功率 = 1.6 mW；扫描次数 = 32；扫描时间 = 11 s；时间常数 = 0.
    12. 获取电子顺磁共振谱。
    13. 从共振器中取出毛细管，将幼虫释放到培养皿中的新鲜E3培养基中。
      注意：上样过程中应避免引入气泡，因为液柱不连续可能降低信号的重复性。若无法进行多谐波检测，请减小调制振幅，并优化采集参数，在不引起谱失真的前提下使信号强度最大化。
  2. 冷冻斑马鱼幼鱼中黑色素自由基的检测
    1. 室温下解冻一份含有10条已安乐死的斑马鱼幼体的冷冻样品，持续5–10分钟。
    2. 向解冻的样品中加入 100 µL E3 培养基。
    3. 将幼虫连同培养基一起转移至一支100 µL血细胞比容毛细管中。
    4. 将毛细管中多余的液体移除，直至样品仅占据活性谐振器的体积（约1 cm长度）。
    5. 用封口剂密封毛细管。
    6. 将毛细管插入电子顺磁共振波谱仪中，并将样品置于谐振腔中心。
    7. 在波谱仪软件中设置采集参数如下：中心磁场 = 335 mT；扫描宽度 = 10 mT；调制幅度 = 500 µT；微波功率 = 1.6 mW；扫描次数 = 32；扫描时间 = 11 s；时间常数 = 0.
    8. 采集并保存电子顺磁共振谱。
      注意：确保样品的上边缘低于谐振腔的上边缘，以避免信号失真。若无法进行多谐波检测，请降低调制幅度，并优化微波功率，以在无谱线失真的前提下使信号强度最大化。
  3. 从多谐波分析软件中提取电子顺磁共振数据及谱图的后期处理 
    1. 在多谐波分析软件中打开记录的电子顺磁共振谱。
    2. 通过选择启用双通道信号处理 使用两个通道.
    3. 将处理的谐波数量设置为30。
    4. 调节 微波相位/度 参数，直至获得对称的吸收和分散组分。
    5. 调节 调制相位/度 参数直到 通道1 显示纯吸收信号并 通道 2 显示纯色散信号。
    6. 调节 调制幅度/G 参数调整至获得最窄且无畸变的谱线为止。
    7. 设置 低通/Hz 用于在保留谱线形状的同时降低高频噪声的参数。
    8. 选择 噪声抑制 标签并点击 启用噪声抑制. 调整 平滑因子 和 窄线宽优化 调整参数，直至信噪比提高，且谱线无明显失真。
    9. 选择 伪影 标签并启用 异常值校正 和 带宽校正.
    10. 将光谱数据保存为数据分析软件可用的格式，以便进一步分析。
    11. 使用合适的数据分析软件，通过数值积分计算双重积分信号强度。
      注意：使用高Q值谐振器时，带宽校正可改善高次谐波成分的重构。多谐波重构能够从过调制的原始数据中恢复无失真的光谱，并提高低强度生物样品的信噪比。

结果

实验流程的示意图如图1所示。收集斑马鱼胚胎，移植B16F10黑色素瘤细胞，在受控条件下孵育，并在X波段电子顺磁共振分析之前通过明场或荧光显微镜进行监测。随后将活体胚胎装入扁平毛细管/样品架中，进行全生物体电子顺磁共振检测，从而实现对黑色素相关自由基信号的无创检测。在完成电子顺磁共振数据采集后，将胚胎释放至新鲜E3培养基中，以便在相同的生物样本中进行纵向重复测量。

Melanoma research process; includes cell injection, incubation, EPR spectroscopy, and analysis diagram.
图1实验流程的图示概览 体内 利用X波段电子顺磁共振（EPR）光谱技术监测斑马鱼黑色素瘤异种移植模型中与黑色素相关的自由基收集斑马鱼胚胎，移植黑色素瘤细胞，孵育后在显微镜下监测，随后装入定制的扁平毛细管中进行全生物体电子顺磁共振（EPR）检测。在检测到特征性的黑色素相关自由基信号（g ≈ 2.003）后，将幼鱼释放用于长期随访测量。 请点击此处以查看此图的放大版本。

为验证该方法的特异性，对野生型（WT）和白化型斑马鱼胚胎进行了检测。野生型胚胎约在受精后27小时（hpf）开始出现可见的色素沉着。相应地，从野生型胚胎获得的电子顺磁共振谱在g ≈ 2.003处显示出特征性的单线信号，符合真黑素来源的半醌自由基（如DHI/DHICA）的特征。相比之下，缺乏功能性黑色素合成能力的白化型胚胎即使在受精后5天（dpf）也未在相同谱区检测到可测的电子顺磁共振信号。这证实所观察到的信号特异性来源于黑色素自由基，并作为阴性对照验证了方法的选择性（图2）。

EPR 谱图，野生型与白化型 5dpf，磁场强度与信号强度，光谱学结果。
图 2：野生型（WT）与白化型斑马鱼胚胎在 5dpf 时的代表性 X 波段电子顺磁共振谱。箭头指示来自 5dpf 野生型斑马鱼胚胎黑色素相关自由基信号的共振位置（g ≈ 2.003）。请点击此处查看该图的放大版本。

该方法可实现对发育过程中黑色素自由基形成的定量监测。随着色素沉积的进行，电子顺磁共振信号强度明显增强。比较2 dpf至5 dpf的野生型胚胎，可见每胚胎归一化的双积分电子顺磁共振信号显著增加。归一化处理是通过将原始电子顺磁共振信号强度除以样品中胚胎数量后，再计算双积分而实现的（图3A）。

采用Kruskal–Wallis检验进行统计分析，随后进行Dunn多重比较检验。对六次独立的生物学重复实验（每次包含7–10个胚胎）的分析显示，不同发育阶段之间的归一化电子顺磁共振信号存在统计学显著差异（p < 0.05），证实了该方法的敏感性。

电子顺磁共振谱的双重积分与未成对电子自旋的数量成正比。因此，其增加表明在发育过程中与黑色素相关的自由基数量增多。重要的是，这种增加可能反映了与进行性黑色素生成相关的黑色素氧化还原平衡的变化，而不仅仅是色素的积累。

通过比较处于相同发育阶段（5 dpf）但胚胎数量不同（7个与10个）的样品所获得的代表性电子顺磁共振谱，进一步评估了该实验方案的可重复性。正如预期，原始谱图的信号强度差异与样品中胚胎数量成正比（图3B）。在将每条谱图根据样品中的胚胎数进行归一化处理后，谱图几乎完全重叠（图3C），批次间的变异度仍低于10%。这些结果突显了按胚胎数进行归一化的重要性，并证实了该方法在比较研究中的稳健性。

图表与光谱；按天数统计的蛋白质表达（A）及按鱼数量归一化的电子顺磁共振信号强度（B，C）
图3：发育过程中黑色素相关自由基动态的定量监测及电子顺磁共振光谱的归一化。（A）从野生型（WT）斑马鱼胚胎在受精后2、3、4和5天（dpf）获得的X波段电子顺磁共振信号的双积分结果。信号强度已根据每份样品中的胚胎数量进行归一化。数据代表六次独立生物学重复实验的平均值±标准差，每次实验包含7–10个胚胎。统计学显著差异：*p < 0.05。（B）使用含7个和10个胚胎的样品，从5 dpf的WT胚胎获得的代表性原始电子顺磁共振光谱。信号幅度随样品中胚胎数量的增加而成比例增强。（C）将B图中的相同电子顺磁共振光谱进行归一化处理后的结果，即原始光谱强度除以毛细管中胚胎的数量。请点击此处查看该图的放大版本。

评估该方案是否依赖于所使用的定制平口毛细管 在体内 斑马鱼测量，使用定制的平口毛细管和标准商用毛细管进行黑色素相关自由基的检测 离体 分析。使用两种样品 holder 获得的代表性电子顺磁共振谱在谱线形状和共振位置上均表现出高度相似性（图4A)，表明对黑色素相关自由基的可靠检测并不局限于定制的毛细管设计。经每枚胚胎归一化后，扁平毛细管的信号强度比标准毛细管重新计算的结果低2倍。

为进一步评估样本处理的灵活性，分别在采集后立即以及冷冻后对斑马鱼胚胎进行了测量，随后 离体 使用标准毛细管进行分析。在六次独立的生物学重复实验中，新鲜样品与冷冻样品之间未观察到统计学上的显著差异（图4B这些结果表明，该方案可适配于常见的电子顺磁共振样品管，支持延迟的离体分析，从而显著提高了该方法在配备不同电子顺磁共振波谱仪的实验室之间的可及性、灵活性和可重复性。

电子顺磁共振谱和箱线图分析磁场对胚胎毛细血管的影响，显示数据变异性。
图 4：实验方案的兼容性。（A）在标准毛细管和平板毛细管中测得的 2 天龄野生型斑马鱼胚胎的原始电子顺磁共振谱。（B）使用标准毛细管对同一批生物重复样本（3 天龄野生型斑马鱼）在活体和冷冻状态下测量结果的比较。请点击此处查看该图的放大版本。

为了确定检测到的电子顺磁共振信号是否可直接归因于黑色素瘤来源的黑色素自由基，本研究采用白化斑马鱼胚胎作为无黑色素的背景模型，并向其中注射B16F10黑色素瘤细胞。在受精后4天（dpf）进行电子顺磁共振检测，检测条件与野生型胚胎所用条件相同。正如预期，未注射的白化胚胎在黑色素特异性谱图区域未显示出可检测的电子顺磁共振信号。重要的是，尽管通过明场显微镜确认了B16F10细胞成功植入（图5B），但在注射了B16F10细胞的白化胚胎中仍未检测到与黑色素相关的电子顺磁共振信号（图5A）。

斑马鱼B16F1细胞移植分析的电子顺磁共振信号图与显微图像。
图 5： 白化斑马鱼B16F10异种移植模型中黑色素瘤来源的黑色素相关自由基的直接检测评估。（A）使用X波段电子顺磁共振波谱仪测得的4天龄（4 dpf）白化斑马鱼及白化斑马鱼B16F10异种移植样本中与黑色素相关的电子顺磁共振信号。每组实验使用10个胚胎，共进行三次生物学重复。（B）癌细胞植入后第三天的4天龄白化斑马鱼及白化斑马鱼B16F10异种移植样本的明场图像。请点击此处查看该图的放大版本。

这些结果表明，在当前实验条件下，注射的黑色素瘤细胞数量低于X波段电子顺磁共振的直接检测阈值。因此，在整体生物体测量中检测到的与黑色素相关的信号主要反映了斑马鱼胚胎/幼鱼体内黑色素氧化还原状态的全局性变化，而非仅来源于异种移植瘤的黑色素瘤特异性信号。

在异种移植实验中，黑色素瘤细胞的移植效率和生长情况高度依赖于注射位点。将细胞注入循环系统（血液）可获得更一致的肿瘤形成效果，并能够可靠地检测到与黑色素瘤细胞相关的电子顺磁共振信号。相比之下，注入卵黄囊会导致胚胎发育受损和肿瘤生长不良，从而产生微弱或不稳定的信号。因此，推荐采用血液注射方式以获得稳定且可解读的实验结果（图6）。

显示B16F10卵黄、注射血液及对照组的连续波电子顺磁共振谱；磁场强度与信号强度关系图
图6：黑色素瘤细胞注射部位对2 dpf斑马鱼胚胎及异种移植发育的影响，通过X波段电子顺磁共振测定。将B16F10黑色素瘤细胞注射至斑马鱼胚胎卵黄囊或循环系统后获得的代表性电子顺磁共振谱图。请点击此处查看该图的放大版本。

为了进一步验证该方法在黑色素瘤模型中的适用性，我们比较了野生型（WT）斑马鱼胚胎与注射了B16F10黑色素瘤细胞的野生型胚胎在不同发育时间点所获得的电子顺磁共振信号。

在野生型胚胎中，电子顺磁共振信号随时间逐渐增强，反映了发育过程中真黑素的自然积累。相比之下，携带B16F10异种移植瘤的胚胎表现出信号动态的改变，在相应时间点其电子顺磁共振信号与野生型相比有所变化（图7）。这些差异可能反映了肿瘤对宿主黑素生成及全身氧化还原状态的调控作用，而不仅仅是对黑色素瘤来源的黑素自由基的直接检测。由于B16F10细胞主要产生真黑素，因此未检测到褐黑素信号。

对照组与B16F10组在不同天数的EPR信号强度柱状图；光谱分析对比。
图7：对照野生型（WT）与携带B16F10肿瘤的野生型斑马鱼胚胎中全生物体电子顺磁共振（EPR）信号动态的代表性比较。在受精后第2、3、4和5天（dpf），从对照野生型（WT）斑马鱼胚胎及WT B16F10异种移植胚胎中获得的双积分X波段电子顺磁共振信号。信号强度已根据每份样品中的胚胎数量进行归一化处理。数据代表六次独立生物学重复实验（对照组）和三次重复实验（B16F10异种移植组）的平均值±标准差（SD），每次实验包含7–10个胚胎。请点击此处查看该图的放大版本。

总体而言，本方案成功实施的标志包括：（i）在有色胚胎中检测到 g ≈ 2 处清晰的单线电子顺磁共振信号，（ii）白化对照样本中无信号，（iii）信号强度随发育阶段增加而增强，以及（iv）在标准化后在生物学重复样本中具有可重复性。

讨论

本研究提出了一种稳健且灵敏的方案，利用X波段电子顺磁共振波谱法对斑马鱼胚胎中与黑色素相关的自由基进行体内检测。该方法可无创、免标记地监测生理性黑色素生成、黑色素瘤异种移植发育以及药物干预过程中与黑色素相关的氧化还原变化。通过将X波段电子顺磁共振波谱法的高灵敏度与斑马鱼异种移植平台相结合，该方法将现有斑马鱼黑色素瘤模型的分析能力从传统的形态学成像扩展至对氧化还原活性黑色素物种的直接生化表征。与主要提供结构和空间信息的荧光成像不同，电子顺磁共振波谱法可直接检测稳定的顺磁性半醌自由基，从而为黑色素氧化还原生物学提供互补的功能性洞察。

所展示的工作流程在色素沉着及黑色素瘤研究中具有广泛的应用性。潜在应用包括评估抗黑色素瘤疗法、探究药物诱导的氧化还原平衡变化、评价调节黑色素生成的化合物（如脱色剂或紫外线反应调节剂），以及分析肿瘤与宿主之间的相互作用 体内此外，结合荧光成像及其他表型分析方法，可提供一个整合空间分布、形态学与生物化学信息的多模态平台，从而提升斑马鱼模型在临床前研究与治疗开发中的预测价值。

获得可靠结果的关键在于多个实验参数。在异种移植实验中，与卵黄囊注射相比，将样本注入循环系统可实现更稳定的移植效果和更可重复的电子顺磁共振测量结果，该发现与先前的研究一致。29,30孵育温度的选择起着重要作用。虽然斑马鱼异种移植模型通常在32 °C下维持培养，以利于哺乳动物细胞的增殖动力学31本研究中使用的小鼠B16F10黑色素瘤细胞系在28 °C下表现出足够的侵袭性，能够展现出显著的增殖和迁移能力。由于32 °C的环境可能显著加速斑马鱼的发育进程——可能导致其在受精后第五天之前即出现自主摄食行为——将幼鱼维持在28 °C有助于确保实验个体始终处于未受保护的发育阶段32因此，选择该温度既可成功观察肿瘤的进展和转移，又符合动物福利法规对幼体进入独立摄食阶段后的保护要求。另一个关键点是，为最大限度减少生物学变异，必须准确归一化至胚胎数量并保持发育阶段的一致性。信号弱或不一致可能源于色素沉着不足、肿瘤负荷过低、样本在共振器内位置欠佳或毛细管填充不完全。在此类情况下，增加每样本的胚胎数量、优化移植效率以及确认样本位于共振器的有效作用体积内，可能有助于改善信号检测。需要更高数量的胚胎以满足 体内 由于水相生物样品的全生物体测量存在介电损耗和填充因子降低的问题，因此在平毛细管中的测量仍具有挑战性。尽管如此，该方法 可与标准毛细管配合使用 离体这些结果表明，该方案与常用的X波段电子顺磁共振波谱配置兼容，并支持延迟测量 离体 分析，提高使用不同仪器的实验室之间的可及性和可重复性。

尽管该方法具有优势，但仍存在若干局限性。一个重要的生物学考量是，所检测到的电子顺磁共振信号反映的是黑色素聚合物中具有氧化还原活性的部分，而不仅仅是总色素含量15,21,33。因此，电子顺磁共振信号强度的变化应被解读为与黑色素相关的氧化还原平衡状态的改变，而非黑色素丰度的直接替代指标。白化病异种移植实验进一步表明，在当前实验条件下，注射的黑色素瘤细胞数量仍低于X波段电子顺磁共振波谱法的直接检测阈值。因此，在携带异种移植的幼鱼中检测到的全生物体信号主要反映了肿瘤-宿主相互作用所诱导的宿主整体黑色素相关氧化还原状态的变化，而非仅来源于异种移植的黑色素瘤特异性信号。重要的是，斑马鱼微环境会引入动态的氧梯度、代谢相互作用以及氧化应激条件，这些因素可能进一步在体内调节黑色素自由基的群体in vivo19,20。在异种移植应用中，该方法目前仅限于高度色素化的黑色素瘤模型，因为需要足够的黑色素浓度才能实现可靠的信号检测。无色素性或色素较弱的肿瘤可能无法产生可检测的信号27。此外，本研究中使用的黑色素瘤细胞系（B16F10）主要产生真黑色素，因而呈现单一的电子顺磁共振谱线。在含有显著褐黑色素成分的模型中，可能会出现光谱重叠13。在此类情况下，需要采用先进的光谱模拟和解卷积方法，以区分真黑色素与褐黑色素的信号。

然而，所展示的工作流程在研究黑色素瘤生物学、药物诱导的黑色素生成调控、氧化应激以及肿瘤-宿主相互作用方面具有广泛的应用潜力 体内将电子顺磁共振波谱技术与荧光成像、遗传报告系统及其他表型检测方法相结合，可进一步提升斑马鱼模型在临床前黑色素瘤研究及治疗开发中的预测价值。

披露

作者 Mikołaj Baranowski 任职于 Novilet 公司，该公司生产本研究中所用光谱仪的组件（多谐波分析仪）。其余作者声明无竞争利益。

致谢

该 "一种用于黑色素瘤潜在药物临床前研究的新型毛细管及黑色素自由基测定方法 斑马鱼 胚胎模型" FENG.02.07-IP.05-0059/23 项目 在波兰科学基金会的FENG POC项目框架内开展，该项目由欧洲联盟欧洲智能经济基金2021–2027（FENG）共同资助。本研究得到欧洲联盟智能增长行动计划项目（项目编号POIR.01.02.00-00-0077/18）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 或 0.5 mL 离心管 Eppendorf 0030120086, 0030121023用于将斑马鱼幼体转移至毛细管 
3 mL 一次性巴斯德吸管 Medlab Products76-1303-2用于胚胎和幼体的分选与转移
台式X波段电子顺磁共振（EPR）波谱仪 MiniScope MS200MagnettechBruker.com用于EPR谱图记录
氯化钙二水合物Chempur363-118748706用于配制E3培养基
细胞计数板（例如EVE或EVE PLUS） Nanoentek IncNC2200445用于细胞计数仪
CellTracker GreenThermo Fisher C2925荧光细胞示踪染料，用于细胞标记
CM-DiIThermo Fisher C7000荧光细胞示踪染料，用于细胞标记
CO2 培养箱 ICO240medMemmertN/A用于细胞维持，设定为37°C、5% CO2、≥95% 湿度 
Countess II 自动细胞计数仪InvitrogenAMQAX1000 用于细胞计数和 细胞密度 测定
冷冻储存盒 CryoKINGBiologixBGX-ID81用于移植肿瘤斑马鱼的储存
冷冻保存液 CM-1 Cytion#800150用于癌细胞冷冻
高糖、含谷氨酰胺、不含丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco#11965-092用于细胞培养维持
E3培养基  实验室自制N/A用于斑马鱼胚胎/幼体饲养，按 Cold Spring Harb Protoc 2011, doi: 10.1101/pdb.rec066449 配制
卵孵化箱Incubato10130024用于斑马鱼胚胎/幼体孵育， 设定温度为28–32°C 
eSpect+ 软件Novilethttps://novilet.eu/products/espect/用于多谐波分析仪
胎牛血清（FBS） Gibco A5256701DMEM的补充剂
精细镊子，陶瓷涂层，Dumont #5，11 cmDumont SA11252-50用于斑马鱼胚胎去壳
专为斑马鱼设计的扁平玻璃毛细管（应用编号：21 736）N/AN/A用于斑马鱼胚胎的EPR测量
无丝玻璃毛细针 Harvard ApparatusGB100-10无丝，用于显微注射
血细胞比容毛细管 （BRAND 一次性 BLAUBRAND 微量移液管），体积 50 和 100 μL BRAND41121500用于EPR测量或转移斑马鱼幼体至扁平毛细管
氯化镁六水合物Chempur363-116120500用于配制E3培养基
配备显微操作器的显微注射系统 FemtoJetEppendorf EPE5252000021用于将细胞装入微针
用于针头装样的Microloader吸头 Eppendorf #5242956003用于显微注射系统 
小鼠黑色素瘤细胞系 B16-F1 CytionCLS-400122用于异种移植
小鼠黑色素瘤细胞系 B16-F10Cytion305157用于异种移植
多谐波分析仪 eSpect+Novilethttps://novilet.eu/products/espect/用于EPR波谱仪以提高灵敏度
青霉素-链霉素溶液SigmaP0781-50ml可选，作为细胞培养用DMEM的补充剂
培养皿，55 mm Medlab Products51-0056-0A-NX用于斑马鱼卵、胚胎和幼体的孵育
磷酸盐缓冲液（PBS），不含钙和镁SigmaD8537-500ml用于细胞清洗
氯化钾Chempur363-117397402用于配制E3培养基
血细胞比容毛细管密封试剂盒 — CritosealNoxygenNOX-A.3-VPC用于斑马鱼胚胎的EPR测量
氯化钠Chempur363-117941206用于配制E3培养基
静态液氮储存罐 BiobaseYDS-47-127-FS用于细胞库保存
体视显微镜OptatechSK Series用于评估斑马鱼胚胎发育
无菌15 mL Falcon离心管SPL Life Sciences S50015用于细胞收获（离心）
无菌90 mm培养皿Googlab ScientificGP508用于细胞培养
无菌冻存管：CryoPure Tube 1.0 mLSarstedt72.377用于细胞冷冻
无菌组织培养巴斯德吸管（Corning Falcon 移液管），体积 5、10、25 mLCorning357543, 356551, 356535用于细胞培养
三卡因（MS-222） Sigma886-86-2现配4 g/L溶液，用于斑马鱼麻醉和安乐死
TrypLE Express (1×) 或胰蛋白酶-EDTA (0.05%) Gibco#12605-010用于传代过程中细胞解离
水浴锅 Precision GP 05Thermo ScientificN/A设定为37 °C，用于温育细胞培养基
斑马鱼胚胎ZIRChttps://zebrafish.org/documents/fees.php受精后1天，优选无色素品系（如白化品系） 

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