强制 miR-486-3p 过表达抑制 A549 和 H358 肺腺癌细胞中与增殖相关的活性、克隆形成生长、伤口闭合以及 Matrigel 穿越能力。这些效应伴随 WNT5B、DVL1 表达水平的降低， β-catenin 和 BCL-2，表明一种 体外 与Wnt相关变化存在关联，但未确立直接靶向或通路因果关系。
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研究文章
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强制 miR-486-3p 过表达抑制 A549 和 H358 肺腺癌细胞中与增殖相关的活性、克隆形成生长、伤口闭合以及 Matrigel 穿越能力。这些效应伴随 WNT5B、DVL1 表达水平的降低， β-catenin 和 BCL-2，表明一种 体外 与Wnt相关变化存在关联，但未确立直接靶向或通路因果关系。
肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌的主要组织学亚型，仍与较高的发病率和死亡率相关。既往研究已发现miR-486-3p在LUAD中具有抑癌功能，但其与WNT5B、DVL1及 β-catenin 相关的表达变化尚不明确。本研究在常规培养条件下，检测了 A549 和 H358 肺腺癌细胞中 miR-486-3p 的基础表达水平，并与 Beas-2b 支气管上皮细胞进行比较。通过慢病毒转导构建了稳定的 miR-486-3p 过表达模型。采用 CCK-8、克隆形成、伤口愈合和 Transwell 实验分别评估细胞增殖相关活性、克隆形成能力、伤口闭合能力以及穿越 Matrigel 包被膜的能力。检测了 WNT5B、DVL1 的表达水平， ββ-catenin 和 BCL-2 蛋白水平通过 Western 印迹检测，同时采用 RT-qPCR 进一步检测 WNT5B、DVL1、CTNNB1 和 BCL2 的 mRNA 水平。在所用培养条件下，miR-486-3p 在 A549 和 H358 细胞中的表达量低于 Beas-2b 细胞，慢病毒转导在两种 LUAD 细胞系中均实现了稳定的过表达。强制过表达 miR-486-3p 降低了 CCK-8 信号、克隆形成能力、伤口闭合率以及 Matrigel 包被膜穿透能力，并伴随 WNT5B、DVL1 和总 β-catenin 水平的下降 β-catenin 和 BCL-2 蛋白水平降低。RT-qPCR 进一步显示，在两种 LUAD 细胞系中，miR-486-3p 过表达后 WNT5B、DVL1、CTNNB1 和 BCL2 的转录水平均下降。这些结果支持一种 体外 强制表达miR-486-3p与多种恶性细胞表型减弱及Wnt相关基因表达改变之间存在关联；然而，这些结果并未证实miRNA与靶标之间的直接结合、通路活性或因果性的线性信号传导机制。
肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的组织学亚型，在全球范围内对肺癌相关的发病率和死亡率具有重大影响1,2,3,4,5。分子分型和靶向治疗已改善了部分患者群体的预后，但晚期肺腺癌仍难以治疗，且在生物学上具有高度异质性1,2,3,4,5。因此，明确参与恶性细胞行为的调控机制，对于提出可验证的治疗假说仍具有重要意义。
Wnt 信号通路包括依赖 β-catenin 和不依赖 β-catenin 的分支，调控细胞增殖、存活、极性和运动能力6,7,8
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所用试剂和设备列于材料表中。
细胞培养
使用人肺腺癌（LUAD）细胞系 A549 和 H358，以及永生化支气管上皮细胞系 Beas-2b。选择 A549（KRAS G12S）和 H358（KRAS G12C；STK11 缺失）作为具有不同 KRAS 突变背景的常用 LUAD 模型，而 Beas-2b 则作为非恶性支气管上皮对照细胞系。A549 和 H358 细胞在 RPMI-1640 培养基中培养，Beas-2b 细胞在 DMEM 中培养；每种培养基均含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润气氛中培养。由于肿瘤细胞系与上皮对照细胞系在不同的常规培养基中维持，因此对跨细胞系的基础表达水平比较需谨慎解读。
慢病毒转导与稳定细胞筛选
采用携带hsa-miR-486-3p前体（LV-miR-486-3p）或随机阴性对照序列（LV-NC）的慢病毒载体进行稳定过表达功能获得性实验设计。将A549和H358细胞以每孔5 × 104个细胞的密度接种于6孔板中，过夜培养。次日，加入慢病毒颗粒，感染复数（MOI）为10，并添加8 µg/mL聚凝胺（poly....
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TCGA/starBase 分析显示 LUAD 中 miR-486-3p 表达水平降低，TargetScan 鉴定出候选结合位点
通过 starBase v3.0 获取的 TCGA 衍生表达数据显示，512 例肺腺癌（LUAD）样本中 miR-486-3p 的丰度显著低于 20 例非肿瘤肺组织样本（Wilcoxon 秩和检验，p = 3.2 × 10⁻5；图 1）。TargetScanHuman 鉴定出 miR-486-3p 在 DVL1 基因 3′ 非翻译区（3′ UTR）第 468–474 位存在一个保守性较差的候选 7mer-m8 位点，其 context++ 得分为 −0.23，context++ 得分百分位为 80。在 WNT5B 基因 3′ UTR 第 913–920 位也鉴定出一个保守性较差的候选 8mer 位点，其 context++ 得分为 −0.46，cont.......
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本项功能获得性研究评估了在 A549 和 H358 肺腺癌（LUAD）细胞中稳定强制表达 miR-486-3p 的效应。在两种模型中，miR-486-3p 的过表达均与生长相关的 CCK-8 信号降低、克隆形成能力下降、伤口闭合减少以及穿过 Matrigel 包被的 Transwell 膜的细胞数量减少相关。这些表型变化伴随 WNT5B、DVL1、总 β-连环蛋白和 BCL-2 蛋白丰度的降低，以及 WNT5B、DVL1、CTNNB1 和 BCL2 转录水平的下调。综上所述，这些结果支持强制表达 miR-486-3p 与多种恶性细胞表型减弱以及部分 Wnt 相关分子的协调性变化之间存在关联。然而，本研究并未证实 miRNA 与靶标之间的直接结合、通路活性或因果性的信号传导顺序。
本研究中观察到的总体肿瘤抑制表型与既往报道一致，不应将其解读为主要的新颖发现。Tomioka 等人先前已证明，miR-486-3p 和 miR-486-5p 均可在肺腺癌（LUAD）细胞中抑制恶性表型，并通过无偏倚的靶标筛选策略鉴定了 .......
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作者声明无利益冲突。
本研究获得了浙江省医药卫生科技计划（2025KY349）和嘉兴市重点扶持学科（2023-zc-014）的经费支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | SDS-PAGE 浓缩胶的制备 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | SDS-PAGE 分离胶的制备 |
| 20× TBS 缓冲液 | Solarbio | 71080 | Western 印迹洗涤和抗体稀释用储存缓冲液 |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1） | Solarbio | A1010 | SDS-PAGE 凝胶的制备 |
| 4% 多聚甲醛固定液 | Servicebio | G1101 | 克隆形成实验和 Transwell 实验的固定 |
| 5× 蛋白上样缓冲液 | Beyotime | P0015 | SDS-PAGE 蛋白样品制备 |
| 过硫酸铵 | Solarbio | 427A038 | SDS-PAGE 凝胶聚合引发剂 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009-1 | 蛋白浓度测定 |
| BCL-2 抗体 | Boster Biological Technology | A00040-2 | 兔多克隆抗体；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | TargetMol | C0005 | 细胞增殖相关代谢活性检测；每 100 μL 培养基中加入 10 μL |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Western 印迹成像 |
| 氯仿 | Servicebio | G3005 | 基于 TRIzol 的 RNA 提取过程中的相分离 |
| 结晶紫染色液 | Servicebio | G1014 | 克隆和 Transwell 膜染色 |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Beas-2b 细胞常规培养基 |
| DVL1 抗体 | Signalway Antibody | 53180 | 兔一抗；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| 胎牛血清（FBS） | Biosharp | BL203B | 常规细胞培养中添加 10%（v/v）；Transwell 下室中添加 20%（v/v） |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | 版本 8 | 图表绘制与统计分析 |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（无 Rox） | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | 基于 SYBR Green 的定量 PCR |
| Hifair III 第一链 cDNA 合成超混合液（含 gDNA 消化酶） | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | mRNA RT-qPCR 的逆转录 |
| IBM SPSS Statistics | IBM | 版本 22.0 | 统计分析 |
| ImageJ | National Institutes of Health | 版本 1.53 | Western 印迹条带密度分析、伤口面积测量、克隆计数和 Transwell 细胞计数 |
| 倒置显微镜 | Olympus | CKX53 | 伤口愈合实验和 Transwell 实验的成像 |
| 异丙醇 | Servicebio | G3006 | 基于 TRIzol 的 RNA 提取过程中的 RNA 沉淀 |
| LV-miR-486-3p 和 LV-NC 慢病毒制剂 | GenePharma | 定制合成 | 稳定过表达 miR-486-3p 的载体和随机阴性对照载体 |
| Matrigel 基底膜基质 | Corning | 354234 | 用无血清 DMEM 稀释至 1:8；终蛋白浓度约为 1 mg/mL |
| 甲醇 | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | PVDF 膜活化 |
| 酶标仪 | BioTek | ELx800 | 在 450 nm 处测定吸光度 |
| 微量紫外-可见分光光度计 | Allsheng | Nano-600 | RNA 浓度及 A260/A280 纯度评估 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 常规细胞培养中添加 1%（v/v） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Servicebio | G0002 | 细胞和膜的洗涤 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | APExBIO | K1007 | 加入 RIPA 裂解缓冲液中 |
| 蛋白 Marker | Biosharp | BL712A | Western 印迹分子量参照 |
| PVDF 膜 | Millipore | K2MA8350E | Western 印迹蛋白转膜膜 |
| QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | RT-qPCR 数据采集 |
| RIPA 裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B | 总细胞蛋白提取 |
| RNA 提取试剂（TRIzol 类型） | Servicebio | G3013 | 总 RNA 提取 |
| RPMI 1640 培养基 | Servicebio | G4510 | A549 和 H358 细胞的常规培养基，以及无血清 Transwell 细胞悬液 |
| SDS | Solarbio | S8010 | SDS-PAGE 试剂 |
| 脱脂奶粉 | BD | 2271470 | Western 印迹用 5% 封闭液 |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | 基于 TCGA 的 miR-486-3p 表达分析 |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | 预测候选 miR-486-3p 结合位点 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | SDS-PAGE 凝胶聚合催化剂 |
| Transwell 小室，24 孔，8 μm 孔径 | Corning | 3428 | Matrigel 包被膜穿透实验 |
| 胰蛋白酶 | Servicebio | G4000 | 细胞消化 |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Western 印迹洗涤缓冲液的制备 |
| 垂直电泳系统 | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | SDS-PAGE 蛋白分离 |
| Western HRP 底物鲁米诺试剂 | Affinity Biosciences | KF001 | 化学发光法 Western 印迹检测 |
| 湿转系统 | Bio-Rad | 1703930 | 蛋白向 PVDF 膜转移 |
| WNT5B 抗体 | Signalway Antibody | 56808 | 兔一抗；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| β-actin 抗体 | Abcam | ab8227 | 上样内参；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| β-catenin 抗体 | Signalway Antibody | 21725 | 兔一抗；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
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