强制 miR-486-3p 过表达抑制 A549 和 H358 肺腺癌细胞中与增殖相关的活性、克隆形成生长、伤口闭合以及 Matrigel 穿越能力。这些效应伴随 WNT5B、DVL1 表达水平的降低， β-catenin 和 BCL-2，表明一种 体外 与Wnt相关变化存在关联，但未确立直接靶向或通路因果关系。
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强制 miR-486-3p 过表达抑制 A549 和 H358 肺腺癌细胞中与增殖相关的活性、克隆形成生长、伤口闭合以及 Matrigel 穿越能力。这些效应伴随 WNT5B、DVL1 表达水平的降低， β-catenin 和 BCL-2，表明一种 体外 与Wnt相关变化存在关联，但未确立直接靶向或通路因果关系。
肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌的主要组织学亚型，仍与较高的发病率和死亡率相关。既往研究已发现miR-486-3p在LUAD中具有抑癌功能，但其与WNT5B、DVL1及 β-catenin 相关的表达变化尚不明确。本研究在常规培养条件下，检测了 A549 和 H358 肺腺癌细胞中 miR-486-3p 的基础表达水平，并与 Beas-2b 支气管上皮细胞进行比较。通过慢病毒转导构建了稳定的 miR-486-3p 过表达模型。采用 CCK-8、克隆形成、伤口愈合和 Transwell 实验分别评估细胞增殖相关活性、克隆形成能力、伤口闭合能力以及穿越 Matrigel 包被膜的能力。检测了 WNT5B、DVL1 的表达水平， ββ-catenin 和 BCL-2 蛋白水平通过 Western 印迹检测，同时采用 RT-qPCR 进一步检测 WNT5B、DVL1、CTNNB1 和 BCL2 的 mRNA 水平。在所用培养条件下，miR-486-3p 在 A549 和 H358 细胞中的表达量低于 Beas-2b 细胞，慢病毒转导在两种 LUAD 细胞系中均实现了稳定的过表达。强制过表达 miR-486-3p 降低了 CCK-8 信号、克隆形成能力、伤口闭合率以及 Matrigel 包被膜穿透能力，并伴随 WNT5B、DVL1 和总 β-catenin 水平的下降 β-catenin 和 BCL-2 蛋白水平降低。RT-qPCR 进一步显示，在两种 LUAD 细胞系中，miR-486-3p 过表达后 WNT5B、DVL1、CTNNB1 和 BCL2 的转录水平均下降。这些结果支持一种 体外 强制表达miR-486-3p与多种恶性细胞表型减弱及Wnt相关基因表达改变之间存在关联；然而，这些结果并未证实miRNA与靶标之间的直接结合、通路活性或因果性的线性信号传导机制。
肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的组织学亚型，在全球范围内对肺癌相关的发病率和死亡率具有重大影响1,2,3,4,5。分子分型和靶向治疗已改善了部分患者群体的预后，但晚期肺腺癌仍难以治疗，且在生物学上具有高度异质性1,2,3,4,5。因此，明确参与恶性细胞行为的调控机制，对于提出可验证的治疗假说仍具有重要意义。
Wnt 信号通路包括依赖 β-catenin 和不依赖 β-catenin 的分支，调控细胞增殖、存活、极性和运动能力6,7,8,9。WNT5B 通常与非经典信号通路相关，但其生物学效应随受体和细胞环境的不同而变化10,11。DVL1 是多种 Wnt 通路共有的胞质信号转导蛋白，已被发现与肺癌中 β-catenin 相关的行为有关12。因此，WNT5B、DVL1 和 β-catenin 的同时变化本身不应被解释为单一线性通路的证据。
microRNA（miRNA）是一类短的非编码RNA，通过与靶标转录本的序列依赖性相互作用来调控基因表达13,14,15。由于单个miRNA可能影响多个RNA，miRNA丰度的改变可影响多种与肿瘤相关的表型13,14,15,16,17,18。已有多个miRNA被发现与肺癌的生长、运动性和信号传导相关，且在多种癌症背景下已报道miRNA与Wnt相关网络之间的串扰16,17,18,19,20。
MIR486 位点可产生成熟的 miR-486-3p 和 miR-486-5p 两条链。miR-486-3p 在口腔癌和胶质母细胞瘤中表现出抑瘤活性，而在皮肤鳞状细胞癌中则有促进肿瘤作用的报道21,22,23,24,25。本研究通过基于假设的策略选择 miR-486-3p，依据包括其在公开的 LUAD 数据中表达水平降低、既往报道其在 LUAD 中具有抑瘤作用，以及生物信息学预测其与 WNT 相关候选转录本之间的关联。Tomioka 等人证明了 miR-486 的两条链在 LUAD 中均具有抑瘤效应，并通过全基因组靶标筛选鉴定了 GINS426。因此，本研究并不声称首次证明抗肿瘤表型。相反，本研究旨在评估强制表达 miR-486-3p 是否伴随 WNT5B、DVL1 和 β-catenin 表达水平的变化，以及在两种 LUAD 细胞系中是否引起可重复的表型改变。这些分析用于评估关联性，但并未确立直接靶向关系、通路活性或线性的 WNT5B/DVL1/β-catenin 作用机制。
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所用试剂和设备列于材料表中。
细胞培养
使用人肺腺癌（LUAD）细胞系 A549 和 H358，以及永生化支气管上皮细胞系 Beas-2b。选择 A549（KRAS G12S）和 H358（KRAS G12C；STK11 缺失）作为具有不同 KRAS 突变背景的常用 LUAD 模型，而 Beas-2b 则作为非恶性支气管上皮对照细胞系。A549 和 H358 细胞在 RPMI-1640 培养基中培养，Beas-2b 细胞在 DMEM 中培养；每种培养基均含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润气氛中培养。由于肿瘤细胞系与上皮对照细胞系在不同的常规培养基中维持，因此对跨细胞系的基础表达水平比较需谨慎解读。
慢病毒转导与稳定细胞筛选
采用携带hsa-miR-486-3p前体（LV-miR-486-3p）或随机阴性对照序列（LV-NC）的慢病毒载体进行稳定过表达功能获得性实验设计。将A549和H358细胞以每孔5 × 104个细胞的密度接种于6孔板中，过夜培养。次日，加入慢病毒颗粒，感染复数（MOI）为10，并添加8 µg/mL聚凝胺（polybrene）。感染24小时后，弃去病毒液，更换为新鲜完全培养基。转导后的细胞使用2 µg/mL嘌呤霉素筛选7天。筛选完成后，存活细胞恢复培养并扩增，用于后续分子生物学及功能实验。本研究未设置miR-486-3p抑制实验组，因实验设计旨在专门评估稳定强制过表达所产生的效应。
注意：为了尽量减少处理相关因素对细胞活力的影响，LV-NC 组与 LV-miR-486-3p 组之间的感染复数（MOI）、多聚素（polybrene）处理时间以及嘌呤霉素筛选条件必须保持一致。
实时定量聚合酶链式反应
采用RT-qPCR检测miR-486-3p的表达水平，并验证慢病毒过表达在A549和H358细胞中的效率。使用TRIzol试剂按照制造商说明书提取总RNA。通过分光光度法测定RNA浓度和纯度，A260/A280比值在1.8–2.1范围内视为合格。对于mRNA分析，使用商品化cDNA合成试剂盒，按照制造商方案将1 µg总RNA逆转录为cDNA。对于microRNA分析，采用miRNA特异性的茎环逆转录引物进行cDNA合成。定量PCR反应总体积为20 µL，包含10 µL 2× SYBR Green Master Mix、每种引物0.4 µM以及2 µL cDNA模板。扩增程序包括：95 °C预变性5分钟，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性10秒，60 °C退火/延伸30秒。随后进行熔解曲线分析以确认扩增特异性。miRNA定量以内参U6小核RNA作为对照，mRNA归一化则以GAPDH为参考基因。相对表达水平采用2−ΔΔCq法计算。
miRNA 引物序列如下：茎环反转录引物，5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′；miR-486-3p 正向引物，5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′；通用反向引物，5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6 正向引物，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6 反向引物，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。WNT5B、DVL1、CTNNB1、BCL2 和 GAPDH 的引物序列，以及扩增片段长度和扩增效率，见表 1。mRNA 表达水平以 GAPDH 为内参进行标准化，miR-486-3p 表达水平则以 U6 为内参进行标准化。每次实验包含三个独立的生物学重复，每个生物学重复设有三个技术重复。
蛋白质印迹法
完成7天的嘌呤霉素筛选及恢复期后，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白（每道20 µg）在10% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，并在300 mA电流下湿转120分钟至PVDF膜。用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）配制的5%脱脂奶粉室温封闭1小时。PVDF膜在4 °C与以下一抗孵育过夜：WNT5B（1:1,000）、DVL1（1:1,000）、β-catenin（1:1,000）、BCL-2（0.5 µg/mL）或β-actin（1:5,000）。所有抗体的生产厂家及货号详见材料表。用TBST洗涤3次，每次10分钟，随后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5,000稀释），室温孵育1小时。再次用TBST洗涤3次，使用化学发光底物显色，并通过凝胶成像系统采集图像。采用ImageJ软件对条带强度进行定量分析。每种目标蛋白的表达水平均以同一样本中β-actin信号为内参进行归一化处理。密度分析仅选用在线性、未饱和检测范围内的曝光图像。实验共进行三次独立的生物学重复。
细胞计数试剂盒-8 检测
将稳定转导LV-NC或LV-miR-486-3p的A549和H358细胞以每孔1.5 × 104个细胞接种于96孔板中，每孔加入100 µL完全培养基。细胞过夜贴壁后更换培养基，并在加入Cell Counting Kit-8试剂后立即测定0小时的吸光度。在0小时、24小时、48小时、72小时和96小时时间点，每孔加入10 µL试剂，于37 °C孵育1小时后，在450 nm波长下读取吸光度值。对于修订后的时间进程分析，各组数据在作图前均以其自身的0小时值进行归一化处理。共进行三次独立的生物学重复实验，每次实验内的技术重复孔取均值后进行统计分析。
集落形成实验
将稳定筛选的 A549 和 H358 细胞制备成单细胞悬液，浓度为 5 × 102 个细胞/mL。每孔加入 1 mL 细胞悬液接种于 6 孔板中，随后加入 3 mL 完全培养基。细胞培养 14 天，每 5 天更换一次培养基。用 PBS 洗涤克隆集落，4% 多聚甲醛固定 20 分钟，结晶紫染色 20 分钟，再次洗涤后空气干燥。使用 ImageJ 软件计数包含至少 50 个细胞的克隆集落。共进行三次独立的生物学重复实验。
注意：为防止细胞出现人为聚集，需要制备均一的单细胞悬液，并在克隆形成过程中尽量减少培养板的扰动。
细胞迁移实验
将稳定转导的 A549 和 H358 细胞接种于 6 孔板中，培养至形成融合的单层细胞。使用无菌的 10 µL 移液枪头划出直线划痕，去除脱落的细胞后，对相同标记区域在 0 h、24 h、48 h 和 72 h 进行成像。使用 ImageJ 测量伤口面积，伤口闭合率计算公式为：(0 h 时的面积 − 特定时间点的面积) / 0 h 时的面积 × 100%。共进行了三次独立的生物学重复实验。未使用任何药理学增殖抑制剂，因此该实验结果应解释为伤口闭合程度的测量，而非特异性反映细胞迁移能力。
注意：划痕应以一致的宽度和压力产生，并在整个时间过程中追踪相同的视野。
细胞侵袭实验
采用24孔聚碳酸酯膜插入式小室（孔径为8 µm）进行Transwell侵袭实验。将每个插入式小室的上表面用100 µL以无血清DMEM按1:8稀释的Matrigel基底膜基质包被，使最终蛋白质浓度约为1 mg/mL，并在37 °C孵育4 h。将A549和H358细胞分别以8 × 105 个细胞/mL和4 × 105 个细胞/mL的密度重悬于无血清RPMI-1640培养基中。取200 µL细胞悬液加入上室，相当于每个插入式小室接种1.6 × 105 个A549细胞或8 × 104 个H358细胞。下室中加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基500 µL作为趋化因子。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育48 h后，用棉签轻轻擦去膜上表面未侵袭的细胞。穿过膜的细胞用4%多聚甲醛固定20 min，并在室温下用0.1%结晶紫染色20 min。对每个插入式小室随机选取5个显微视野进行成像，使用ImageJ软件定量侵袭细胞数量。将5个视野的平均细胞数作为一个插入式小室的单一数值，以插入式小室而非单个显微视野作为实验单位。共进行了三次独立的生物学重复实验。
注意：应轻柔且一致地去除未侵袭的细胞，以避免损坏膜或使已迁移至其下表面的细胞脱落。
统计分析
数据以均值 ± 标准差（SD）表示，n 表示独立的生物学实验次数，除非另有说明。来自同一实验单元的技术重复或多个显微视野数据在进行推论性检验前已取平均值。对于三种细胞系的比较，采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 法校正的两两比较。对于 CCK-8 和伤口闭合的时间过程数据，采用双因素重复测量方差分析，评估处理因素、时间因素以及处理与时间交互作用的影响，随后在各个时间点进行 Šídák 法校正的比较。两组之间的比较采用双侧非配对 Student t 检验。统计分析和数据可视化使用统计分析与绘图软件完成。确切的 p 值在图示面板或原始数据表中给出。统计学显著性定义为 p < 0.05；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
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TCGA/starBase 分析显示 LUAD 中 miR-486-3p 表达水平降低，TargetScan 鉴定出候选结合位点
通过 starBase v3.0 获取的 TCGA 衍生表达数据显示，512 例肺腺癌（LUAD）样本中 miR-486-3p 的丰度显著低于 20 例非肿瘤肺组织样本（Wilcoxon 秩和检验，p = 3.2 × 10⁻5；图 1）。TargetScanHuman 鉴定出 miR-486-3p 在 DVL1 基因 3′ 非翻译区（3′ UTR）第 468–474 位存在一个保守性较差的候选 7mer-m8 位点，其 context++ 得分为 −0.23，context++ 得分百分位为 80。在 WNT5B 基因 3′ UTR 第 913–920 位也鉴定出一个保守性较差的候选 8mer 位点，其 context++ 得分为 −0.46，cont...
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本项功能获得性研究评估了在 A549 和 H358 肺腺癌（LUAD）细胞中稳定强制表达 miR-486-3p 的效应。在两种模型中，miR-486-3p 的过表达均与生长相关的 CCK-8 信号降低、克隆形成能力下降、伤口闭合减少以及穿过 Matrigel 包被的 Transwell 膜的细胞数量减少相关。这些表型变化伴随 WNT5B、DVL1、总 β-连环蛋白和 BCL-2 蛋白丰度的降低，以及 WNT5B、DVL1、CTNNB1 和 BCL2 转录水平的下调。综上所述，这些结果支持强制表达 miR-486-3p 与多种恶性细胞表型减弱以及部分 Wnt 相关分子的协调性变化之间存在关联。然而，本研究并未证实 miRNA 与靶标之间的直接结合、通路活性或因果性的信号传导顺序。
本研究中观察到的总体肿瘤抑制表型与既往报道一致，不应将其解读为主要的新颖发现。Tomioka 等人先前已证明，miR-486-3p 和 miR-486-5p 均可在肺腺癌（LUAD）细胞中抑制恶性表型，并通过无偏倚的靶标筛选策略鉴定了 ...
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作者声明无利益冲突。
本研究获得了浙江省医药卫生科技计划（2025KY349）和嘉兴市重点扶持学科（2023-zc-014）的经费支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
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| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | SDS-PAGE 浓缩胶的制备 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | SDS-PAGE 分离胶的制备 |
| 20× TBS 缓冲液 | Solarbio | 71080 | Western 印迹洗涤和抗体稀释用储存缓冲液 |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1） | Solarbio | A1010 | SDS-PAGE 凝胶的制备 |
| 4% 多聚甲醛固定液 | Servicebio | G1101 | 克隆形成实验和 Transwell 实验的固定 |
| 5× 蛋白上样缓冲液 | Beyotime | P0015 | SDS-PAGE 蛋白样品制备 |
| 过硫酸铵 | Solarbio | 427A038 | SDS-PAGE 凝胶聚合引发剂 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009-1 | 蛋白浓度测定 |
| BCL-2 抗体 | Boster Biological Technology | A00040-2 | 兔多克隆抗体；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | TargetMol | C0005 | 细胞增殖相关代谢活性检测；每 100 μL 培养基中加入 10 μL |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Western 印迹成像 |
| 氯仿 | Servicebio | G3005 | 基于 TRIzol 的 RNA 提取过程中的相分离 |
| 结晶紫染色液 | Servicebio | G1014 | 克隆和 Transwell 膜染色 |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Beas-2b 细胞常规培养基 |
| DVL1 抗体 | Signalway Antibody | 53180 | 兔一抗；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| 胎牛血清（FBS） | Biosharp | BL203B | 常规细胞培养中添加 10%（v/v）；Transwell 下室中添加 20%（v/v） |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | 版本 8 | 图表绘制与统计分析 |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（无 Rox） | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | 基于 SYBR Green 的定量 PCR |
| Hifair III 第一链 cDNA 合成超混合液（含 gDNA 消化酶） | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | mRNA RT-qPCR 的逆转录 |
| IBM SPSS Statistics | IBM | 版本 22.0 | 统计分析 |
| ImageJ | National Institutes of Health | 版本 1.53 | Western 印迹条带密度分析、伤口面积测量、克隆计数和 Transwell 细胞计数 |
| 倒置显微镜 | Olympus | CKX53 | 伤口愈合实验和 Transwell 实验的成像 |
| 异丙醇 | Servicebio | G3006 | 基于 TRIzol 的 RNA 提取过程中的 RNA 沉淀 |
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| Matrigel 基底膜基质 | Corning | 354234 | 用无血清 DMEM 稀释至 1:8；终蛋白浓度约为 1 mg/mL |
| 甲醇 | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | PVDF 膜活化 |
| 酶标仪 | BioTek | ELx800 | 在 450 nm 处测定吸光度 |
| 微量紫外-可见分光光度计 | Allsheng | Nano-600 | RNA 浓度及 A260/A280 纯度评估 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 常规细胞培养中添加 1%（v/v） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Servicebio | G0002 | 细胞和膜的洗涤 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | APExBIO | K1007 | 加入 RIPA 裂解缓冲液中 |
| 蛋白 Marker | Biosharp | BL712A | Western 印迹分子量参照 |
| PVDF 膜 | Millipore | K2MA8350E | Western 印迹蛋白转膜膜 |
| QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | RT-qPCR 数据采集 |
| RIPA 裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B | 总细胞蛋白提取 |
| RNA 提取试剂（TRIzol 类型） | Servicebio | G3013 | 总 RNA 提取 |
| RPMI 1640 培养基 | Servicebio | G4510 | A549 和 H358 细胞的常规培养基，以及无血清 Transwell 细胞悬液 |
| SDS | Solarbio | S8010 | SDS-PAGE 试剂 |
| 脱脂奶粉 | BD | 2271470 | Western 印迹用 5% 封闭液 |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | 基于 TCGA 的 miR-486-3p 表达分析 |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | 预测候选 miR-486-3p 结合位点 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | SDS-PAGE 凝胶聚合催化剂 |
| Transwell 小室，24 孔，8 μm 孔径 | Corning | 3428 | Matrigel 包被膜穿透实验 |
| 胰蛋白酶 | Servicebio | G4000 | 细胞消化 |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Western 印迹洗涤缓冲液的制备 |
| 垂直电泳系统 | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | SDS-PAGE 蛋白分离 |
| Western HRP 底物鲁米诺试剂 | Affinity Biosciences | KF001 | 化学发光法 Western 印迹检测 |
| 湿转系统 | Bio-Rad | 1703930 | 蛋白向 PVDF 膜转移 |
| WNT5B 抗体 | Signalway Antibody | 56808 | 兔一抗；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| β-actin 抗体 | Abcam | ab8227 | 上样内参；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
| β-catenin 抗体 | Signalway Antibody | 21725 | 兔一抗；Western 印迹使用稀释比为 1:5,000 |
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