从小鼠骨骼肌衍生的功能性线粒体的分离、纯化及表征，用于线粒体移植

Summary

建立了一套结合胰蛋白酶消化与差别离心的标准化方案，用于从小鼠骨骼肌中分离、纯化和功能性表征线粒体，并评估其在线粒体移植中的应用。

Abstract

线粒体是调节真核细胞中能量代谢、信号转导和细胞稳态的重要细胞器。线粒体功能障碍促成了多种疾病的发病机制，并促使线粒体移植作为再生治疗策略的发展。线粒体移植的成功应用依赖于高度纯化且功能完整的线粒体的可用性。骨骼肌因其高线粒体含量、代谢活性强且可及性强，是合适的供体来源。本研究建立了一套标准化、可重复的方案，用于从小鼠骨骼肌中分离、纯化和表征功能性线粒体，并评估其在线粒体移植中的应用。该手术分为两个主要阶段。首先，通过糖蛋白酶消化和差别离心，从C57BL/6小鼠的骨骼肌中分离出线粒体。其次，对分离的线粒体进行了鉴定，以评估其纯度、超微结构和功能活性。线粒体纯度通过双辛戊酸（BCA）蛋白定量和西方印迹分析进行评估。超微结构完整性通过透射电子显微镜进行了检测。通过JC-1和线粒体荧光标记，结合高分辨率呼吸系统测量氧气消耗、ATP生成能力和呼吸控制比，评估了功能活性。分离出的线粒体表现出保存的膜电位、完整的超微结构和稳定的呼吸活动，表明适合后续功能研究和线粒体移植应用。

Introduction

线粒体是腺苷三磷酸（ATP）的主要产区，在细胞凋亡、钙稳态以及活性氧物种（ROS）代谢中起着核心作用。因此，线粒体的功能完整性对于维持细胞稳态和决定细胞命运至关重要 ^1,2。线粒体功能障碍，包括线粒体DNA（mtDNA）突变和电子传递链（ETC）异常，会导致能量代谢受损、氧化应激和细胞凋亡失调 ^3,4。这些异常与多种疾病相关，包括遗传性线粒体疾病、神经退行性疾病和心血管疾病^5,6。传统的线粒体功能障碍治疗策略，如抗氧化剂和代谢辅因子，通常疗效有限，因为它们只能缓解症状，但无法直接恢复线粒体功能 ^7,8。因此，线粒体移植已成为再生医学中一种有前景的治疗方法。该策略涉及将完整的外源线粒体输送到受损或功能失调的细胞中，以恢复线粒体活性和细胞能量代谢^9,10。以往研究表明，外源性线粒体可以被受体细胞内吞并纳入内源性线粒体网络，从而提升生物能量功能和细胞生存率11,12,13。

骨骼肌因其高线粒体含量、代谢活性和可及性，被认为是线粒体分离的合适供体 14,15,16。线粒体移植需要多个关键步骤，包括线粒体分离、纯化、功能表征以及高效地输送到受体细胞。然而，迄今为止报告的方案中仍存在显著方法学差异，尤其是在涉及组织均质化、酶消化、温度控制和纯化等程序中。这种变异性会影响线粒体的产量、纯度和功能完整性，从而限制实验的可重复性。

为提高方法学的一致性和可重复性，本研究提出了一套标准化方案，利用胰蛋白酶消化和差别离心法从小鼠骨骼肌中分离和表征功能性线粒体。通过双碳酸（BCA）蛋白定量、西方吸迹法、透射电子显微镜、基于荧光的膜电势测定和高分辨率呼吸法，对分离出的线粒体进行了纯度、超微结构完整性和功能活性的评估。此外，评估了受体细胞对分离线粒体的摄取情况，以评估其在线粒体移植应用中的适用性。该方案为获得功能性骨骼肌来源线粒体提供了可重复的工作流程，用于下游实验研究。

Protocol

所有动物实验均在特定的无病原体（SPF）设施内进行，并经空军医科大学第三附属医院动物伦理与使用委员会批准（批准号：IACUC-2024kq-065）。

雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄，18-20克）购自空军医科大学实验动物中心（生产许可证：SCXK（陕西）2024-002）。这些小鼠被安置在个体通风笼（IVC）中，环境为正压且环境清洁，温度为20-26°C，相对湿度为40%-70%，12小时的明暗循环，每小时至少换气15次。提供了消毒饮食、饮用水和环境丰富措施。

协议中使用的试剂、化学品和实验仪器列于 材料表中。

1. 动物献祭与组织采集

1. 将小鼠放入密封安乐死舱，通过逐渐吸入二氧化碳（CO₂）进行安乐死，每分钟30%-70%的舱室体积。
2. 确认死亡原因为自发呼吸和心跳停止、瞳孔反射丧失，且对机械刺激无反应。
3. 将安乐死的C57BL/6小鼠浸泡在75%乙醇中5分钟进行消毒。
   注意：为避免酒精引起的组织固定和细胞损伤，浸泡时间限制在10分钟。在整个方案中使用新鲜组织，因为冷冻会损害线粒体的存活能力和功能完整性。
4. 将小鼠放入无菌培养皿，置于层流罩内，腹部朝上，完全暴露腹部和后肢区域。
5. 用镊子提起靠近生殖器区域的下腹部皮肤，做一个小切口。进行钝器切除，将皮肤与底层组织分离。切口沿中线向上延伸至踝部，并向两侧后肢方向延伸，完全暴露后肢肌群。
6. 识别大腿前侧股四头肌，并沿肌纤维方向用钝器切割将其分离。切断远端髌韧带和近端肌腱，完全隔离肌肉组织。
   注意：每次清洗时，组织应用预冷却的磷肥缓冲生理盐水（PBS）并补充2%青胰岛素-链霉素，并使用新的培养皿清洗，以减少污染。
7. 将分离的肌肉组织立即放入预冷PBS中，彻底冲洗以去除组织表面的毛发和血迹。
8. 用无菌纱布轻轻吸走组织上的多余水分。将组织分入1.5毫升微离心管中，称重样本。每个样本约使用100毫克组织以保持制剂间的一致性。

2. 组织切碎与均质化

1. 将装有第 1.8步 组织的微离心管放入冰上。用无菌剪刀将组织切碎为约1-2 mm³ 大小的小块。
2. 加入8卷预冷的0.25%胰蛋白酶，将组织碎片冰上消化15分钟。
   注意：根据组织质量计算所需的胰蛋白酶体积（1 mg ≈ 1 μL）。例如，将640微升0.25%胰蛋白酶加入80毫克组织中。
3. 将混合物以1000 ×克 离心，4摄氏度离心5分钟。 丢弃上清液，保留组织颗粒。将沉淀重新悬浮在1毫升预冷线粒体分离缓冲液中，内含D-甘露醇（215 mM）、蔗糖（75 mM）、HEPES（20 mM）、EGTA（1 mM）和无脂肪酸牛血清白蛋白（0.5% w/v）。
4. 将悬浮液转移到冰上保持的玻璃均质器中。通过10-12次轻柔上下划动均匀组织，直到懸浮液变得浑浊。
   注意：避免在均质器底部侧向旋转玻璃杵，因为过度的机械力可能损伤线粒体膜并影响线粒体功能。

3. 差速离心

1. 将均质液转移到1.5毫升微型离心管中，并在1000 ×克 下、4°C离心5分钟。
2. 将上清液转移到新鲜的1.5毫升微离心管，并在 12,000× 克下离心5分钟，温度为4°C，以获得粗粒体颗粒。
   注意：使用1毫升注射器仔细收集上清液，同时避免扰动沉淀和残留组织碎片。

4. 线粒体纯化与储存

1. 将粗粒体沉淀轻轻地悬浮在含有蔗糖（250 mM）、HEPES（10 mM，pH 7.4）、EGTA（1 mM）和牛血清白蛋白（0.15% w/v）的预冷洗涤缓冲液中。在1000 × g 下离心，在4°C下离心5分钟。
2. 将上清液转移到新鲜离心机管中，并在 12,000 × g 、4°C下离心10分钟，以获得纯化后的线粒体颗粒。
   注意：尽可能立即使用新鲜分离的线粒体。可在含蔗糖（0.25 M）、Tris-MOPS（10 mM，pH 7.4）和EGTA（0.1 mM）的线粒体储存缓冲液中，短期储存4°C或长期储存−80°C。然而，冷冻可能损害线粒体酶活性和呼吸功能。主要使用冷冻样本进行蛋白质分析。

5. 线粒体和胞质蛋白提取及BCA定量

1. 线粒体蛋白提取
   1. 将纯化后的线粒体沉淀重新悬浮于每100毫克起始组织50微升RIPA溶解缓冲液中，并在冰上培养15分钟。
   2. 将裂解液离心，约 14,000×克 ，4°C下离心15分钟。 将上清液转移到新的1.5毫升微离心管中，获得线粒体蛋白分数。
2. 细胞质蛋白提取
   1. 在 4.2步 中以12,000 × g 在4°C下离心15分钟。 丢弃上清液，保留沉淀为富集的细胞质组分。
   2. 将细胞质沉淀重新悬浮于50微升的RIPA裂解缓冲液中，并按照 步骤5.1.1-5.1.2进行样品处理。
      注意：用蛋白酶抑制剂新鲜准备裂解缓冲液，所有操作均在冰上进行，以最大限度减少蛋白质降解。此步骤中使用的线粒体可以是新鲜的，也可以是冷冻的。
3. BCA蛋白定量
   1. 通过将试剂A和试剂B以50：1（v/v）的比例混合，制备BCA工作溶液。在96孔板的每个孔中加入200微升工作溶液。
      注意：使用前请立即制备BCA工作液，并在室温下1小时内使用。
   2. 将牛血清白蛋白（BSA）液（2 mg/mL）稀释为0.5 mg/mL，并冰镇保存直到使用。
   3. 通过在分开的孔中加入20、19、18、16、12、8、4或0微升的BSA溶液，准备标准曲线。用NaCl溶液将最终体积调整为20微升。
   4. 在一组孔中加入4微升线粒体蛋白和16微升NaCl溶液。向另一组孔中加入4微升细胞质蛋白和16微升NaCl溶液。
   5. 向每个孔加入200微升BCA工作液，并在37°C下在黑暗中孵育板30分钟。使用微板读器测量562纳米的吸收率。
   6. 构建一条相关系数为 （R²） ≥ 0.999 的蛋白质标准曲线。通过从标准曲线插值吸收值计算蛋白质浓度（μg/μL）。

6. 骨骼肌来源线粒体的纯度评估

1. 将线粒体和胞质蛋白样本稀释至最终浓度为1.5 μg/μL。制备20微升反应混合物，含30 μg蛋白质和4个×加载缓冲液。用NaCl溶液调节剩余体积。将样品煮沸10分钟，保存在−80°C下直到使用。
2. 使用4%-20%梯度预制胶分离蛋白质样本。在140-150伏电泳下进行50分钟。
3. 在甲醇中激活PVDF膜（0.22微米）1分钟。使用快速转移缓冲液在400 mA下转移蛋白，持续30分钟。
4. 从转印夹层取下PVDF膜，用TBST清洗5分钟。用5%脱脂牛奶在室温下轻轻摇晃，封闭膜1小时。
5. 将稀释的一级抗体（COX IV、细胞色素c、β-肌动蛋白）1：1000置于抗体稀释缓冲液中。将该膜与原级抗体一起在4°C下孵育一夜。
6. 用TBST清洗膜三次，每次10分钟。
7. 将膜与稀释的2级抗体1：10,000在室温下孵育1小时。
8. 用TBST清洗膜三次，每次10分钟。冲洗印迹并拍摄图像。

7. 骨骼肌来源线粒体的有丝粒蛋白追踪器染色

1. 使用前，将染色工作液稀释至预热培养基中最终浓度200 nM。
2. 将线粒体沉淀重新悬浮在100微升工作溶液中，并在37°C下黑暗中孵育20分钟。
3. 孵育后加入五卷预冷储存缓冲液。在 12,000 × g 下离心，4°C下悬浮液10分钟，并丢弃含有未结合染料的上清液。
4. 将染色线粒体悬浮液的分度转移到玻片上，并用盖片覆盖样本。
5. 使用激光扫描共焦点显微镜拍摄荧光图像，并设定适当的激发和发射设置，以检测红色荧光线粒体染料。

8. 利用JC-1染色评估线粒体膜电位

1. CCCP（羰基氰化物m-氯苯肟）处理基团
   1. 用CCCP处理线粒体悬浮液，最终浓度为10微米，并培养20分钟以消散线粒体膜电位。
   2. 将CCCP处理的线粒体悬浮液与250微升JC-1染色溶液在37°C下缓缓搅拌，孵育20分钟。
2. JC-1处理组
   1. 将线粒体沉淀重新悬浮在100微升JC-1工作液中，并在37°C下培养20分钟，避免光照。
   2. 将5 ××的 JC-1 染色缓冲液与蒸馏水以 2：8（v/v）比例稀释，并保持缓冲液冰块保存。
   3. 去除染色溶液，用预冷的1× JC-1染色缓冲液清洗线粒体沉淀两次。
   4. 将染色的线粒体重新悬浮在PBS中，并用激光扫描共焦显微镜成像。使用适当的激发和发射设置来检测绿色荧光JC-1单体和红色荧光JC-1聚集体。

9. 通过透射电子显微镜对分离骨骼肌线粒体进行超微结构分析

1. 将新鲜分离的线粒体固定在2.5%戊二醛中，浸泡在0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，并在4°C下培养一夜。
2. 用0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）清洗样品，并在室温下用1%四氧化二锇固定1小时。
3. 通过分级乙醇序列脱水样品，随后浸入、嵌入并在环氧树脂中聚合。
4. 使用超切片机切片，厚度为50-70纳米的嵌入样本。
5. 用醋酸铀酰和柠檬酸铅双层染色这些部分。使用透射电子显微镜观察并成像样品。

10. 骨骼肌来源线粒体的细胞摄取

1. 文化 NCTC 克隆体 929（L929;RRID：CVCL_0462）从商业供应商获得的细胞，含含MEM Alpha的完整培养基，辅以10%胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素。
2. 当细胞汇聚度达到80%-90%时，抽取培养基并用预热的PBS清洗细胞两次。加入胰蛋白酶-EDTA，培养直到细胞脱离。
3. 加入完全培养基以终止消化，并通过轻柔移液法生成单细胞悬浮液。将悬浮液以1000×克离心5分钟，然后丢弃上清液。
4. 将细胞沉淀重新悬浮到新鲜的完整培养基中，并以适当的密度将细胞种子放入新的培养皿中。在含5%二氧化碳的加湿环境中，37°C孵育细胞。
5. 将5个（P5）细胞穿过到35毫米玻璃底盘中，并在过夜培养。
6. 用线粒体特异性红色荧光染料在37°C黑暗下标记分离的线粒体20分钟，并用PBS洗涤线粒体以去除未结合染料。
7. 将红色荧光染料标记线粒体（每盘20微克线粒体蛋白）加入细胞，并在含5%二氧化碳的加湿环境中37°C下培养24小时。
8. 用荧光肌动蛋白探针染色细胞30分钟，以观察肌动蛋白细胞骨架，并用荧光核染料对细胞核进行反染色。
   注意：共孵育期间请仔细控制血清浓度，因为过量血清可能降低线粒体摄取效率。这一步中使用的线粒体是新鲜的。

11. 利用高分辨率呼吸测验测量线粒体呼吸功能

1. 仪器准备
   1. 清洁呼吸舱、电极舱和塞子。
   2. 在每个腔室放置磁性搅拌棒，并检查氧电极膜的完整性。
2. 仪器校准
   1. 在每个呼吸腔中加入2.1毫升线粒体呼吸缓冲液（MiR05，pH 7.10），并确保无气泡存在。
   2. 在37°C下平衡高分辨率呼吸系统30分钟，并在氧气基线稳定后每日进行空气校准。
      注意：避免将气泡引入呼吸舱，因为它们会干扰氧电极信号并影响数据质量。 这一步中使用的线粒体是新鲜的。
3. 样品加载与平衡
   1. 将新鲜分离的含约30微克蛋白质的线粒体加入呼吸腔并密封舱内。
   2. 将腔室平衡5-8分钟，记录基础氧气消耗量。
      注意：将线粒体冰藏保存，分离后立即进行呼吸测量以保持活性。
4. SUIT 协议
   1. 依次加入5微升丙酮酸（2 M）、10 μL 谷氨酸（2 M）和10 μL苹果酸（400 mM）。稳定反应5分钟，记录CI漏呼吸。
   2. 加入10微升ADP（500 mM）诱导氧化磷酸化并记录CI OXPHOS呼吸。加入10微升氯化镁（0.3米）。
   3. 稳定后加入20微升琥珀酸盐（1 M），记录CI+CII OXPHOS呼吸。
   4. 加入2微升ATP合成酶抑制剂（0.01 mM），记录质子泄漏呼吸。
   5. 以每次2微升、每2分钟的间隔，逐步添加CCCP（1 mM），直到氧气消耗达到平台。记录最大电子转移系统容量。
   6. 添加1微升罗酮（1 mM）以抑制复合物I活性。
   7. 添加1微升抗霉素A（5 mM）以抑制复合III活性并记录残余氧消耗量。
   8. 加入5微升抗坏血酸（800 mM）和5 μL N，n，n'，n'-四甲基-对苯二胺（200 mM）。稳定后记录最大复杂静脉呼吸活动。
      注意：冷冻前所有试剂都要分量，以避免反复冻融循环。逐渐添加CCCP，因为过度解耦会抑制线粒体呼吸。
5. 数据分析
   1. 使用数据分析软件获取线粒体呼吸参数，包括CI泄漏、CI氧磷酸、CI+CII氧酸磷酸、CI+CII泄漏、CI+CII ET、CII和CIV。
   2. 计算呼吸控制比（RCR;状态3呼吸/状态4呼吸）和ATP生产能力。所有值保持在三个显著数以供统计分析。用于数据分析的软件是Oroboros Datlab 8（Oroboros Instruments）。

Results

线粒体分离和纯化工作流程的示意概述见 图1。所有手术均在4°C下进行，以保持线粒体完整性和功能活性。新鲜分离的骨骼肌组织被剁碎并与胰蛋白酶消化以促进组织解离，然后使用玻璃均质剂在等渗分离缓冲液中均质化。随后进行了差别离心，将线粒体从组织碎片和细胞质污染物中分离。首次离心在1,000×克下去除了核和大颗粒，而随后在12,000×克离心时得到粗糙的线粒体颗粒。额外的洗涤和离心步骤进一步减少了细胞质污染，得出适合下游结构和功能分析的纯化线粒体（见图1）。

图1：线粒体分离与纯化的示意图。 通过控制胰蛋白酶消化和差别离心结合方法分离出高纯度线粒体。所有手术均在4°C下进行，以保持线粒体的结构和功能完整性。新鲜分离的骨骼肌组织经过酶消化、均质化和顺序离心步骤，以获得适合下游功能和结构分析的纯化线粒体。 请点击此处查看该图的放大版本。

通过JC-1染色和荧光线粒体标记评估了分离线粒体的功能活性（见图2）。JC-1染色在基础条件下新分离的线粒体表现出强烈的红色荧光，表明线粒体膜电位得以保存。经过碳酸氰化物m-氯苯薮（CCCP）处理后，红色荧光减少，绿色荧光增强，符合线粒体膜去极化的表现。这些发现证实，分离的线粒体在分离后仍保持膜电位响应性，并保持功能活性。荧光标记进一步表明，线粒体在田野中呈现为离散、均匀分布的斑点结构，没有明显的聚集或染料沉淀。低背景荧光和均匀染色图样表明分离后线粒体完整性和膜电位得以保留。

图2：分离线粒体功能活性的表征。（A） 通过JC-1染色评估线粒体膜电位。纯化后的线粒体被用JC-1染色，并在荧光显微镜下观察。在对照组线粒体中观察到明显的红色荧光聚集体，表明线粒体膜电位得以保留。经过解偶联CCCP处理后，荧光主要转向绿色JC-1单体，表明膜去极化和膜电位坍缩（尺度条=50微米）。 （B） 纯化线粒体的线粒体荧光标记。荧光标记的线粒体呈现为分散的点状结构，缺乏明显聚集，背景荧光极少，表明线粒体完整性得以保存，膜电位稳定（尺度条=100微米）。 （C） JC-1染色后不同组的JC-1荧光强度比值定量分析。数据以SEM平均±表示（n=3）。统计显著性采用无配对t检验（****P < 0.0001）进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

通过透射电子显微镜检查了分离线粒体的超微结构完整性（见图3）。低倍成像显示纯化线粒体，形态主要呈椭圆形，而高倍成像则显示外膜完整且嵴结构清晰。未观察到明显的肿胀、破裂或结构破坏。定量评估分析了五个随机选取的田间，每个田间约含40-60粒线体。这些观察表明，分离过程有效保存了线粒体超微结构，并生成了适合下游功能研究的线粒体。

图3：通过透射电子显微镜评估分离骨骼肌线粒体的超微结构完整性。 （左）代表性透射电子脑成像，低倍率（4,000×;比例条=2微米），显示纯化后的线粒体形态主要呈椭圆形。 请点击此处查看该图的放大版本。

（正确）高倍率透射电子显微镜成像（40,000×;比例条=200纳米），显示出光滑且连续的外线粒体膜和清晰的嵴结构。黄色箭头表示线粒体外膜保存完好，白色箭头表示线粒体嵴结构良好。未观察到肿胀、破裂或结构破坏的迹象。分析了五个随机选拔的田地，每个田地约有40-60个线粒体。这些发现表明，分离方案保留了线粒体超微结构完整性，并为后续功能性测定提供了可靠的结构基础。

随后通过蛋白质定量和免疫印迹分析评估线粒体产率和纯度（见图4）。胰蛋白酶消化法（TD）与正常提取法（NE）法的比较显示，TD法每mg组织约产出2.3-2.4微克线粒体蛋白，而NE法约为1.7-1.8微克/毫克组织。免疫印迹分析显示线粒体标记物——细胞色素c氧化酶和COX IV在线粒体组分中强烈富集，而在细胞质组分中检测极少。相比之下，细胞质标记β肌动蛋白在线粒体组分中仅表现出微弱信号，表明细胞质污染有限。TD组与NE组的比较表明，胰蛋白酶消化提高了线粒体的产率和纯度。综合来看，这些发现表明该方案生成的线粒体适合进行下游分子和功能分析。

图4：纯化线粒体的产率与纯度比较。（A） 利用胰蛋白酶消化（TD）和正常提取（NE）方法获得的线粒体蛋白产量，单位组织质量比较。TD组约为2.3-2.4 μg/mg，而NE组约为1.7-1.8 μg/mg。数据以SEM平均±表示（n=3）。统计显著性采用未配对t检验（*P < 0.05）进行分析。 （B） 利用TD和NE方法分离线粒体分数中的线粒体和细胞质标记蛋白进行免疫印迹分析。 （C-D） 线粒体标记蛋白细胞色素c氧化酶和COX IV的定量分析。线粒体标记在线粒体组分中高度富集，但在细胞质组分中表达极少。细胞质标记β肌动蛋白在线粒体组分中表现较弱，表明细胞质污染物的高效去除。与NE组相比，TD组的线粒体纯度有所提升。数据以SEM平均±表示（n=3）。统计显著性采用无配对t检验（*P < 0.05;**P < 0.01）进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

为进一步评估线粒体呼吸功能，采用高分辨率呼吸测验测量氧气消耗（见图5）。使用TD法分离的线粒体显示出约9-10的呼吸控制比（RCR）值，而使用NE法分离的线粒体则显示约8-9的RCR值。由于RCR值大于4通常被视为线粒体呼吸活动保存的指标，这些结果表明，使用两种方法分离的线粒体仍保持功能完整性。TD组观察到较高的RCR值表明线粒体呼吸功能的保存率优于NE组。还使用方程1−（泄漏呼吸率/电子转移呼吸率）评估生化耦合效率，接近1的值表明呼吸耦合更紧密，ATP产生效率更高。两组的偶联效率均接近1，表明线粒体生物能功能在分离后得以保留。

图5：纯化线粒体呼吸功能的检测。（A） 胰蛋白酶消化组（TD）组与正常提取组（NE）组线粒体呼吸控制比（RCR）的比较。两组的RCR值均大于4，表明分离后线粒体呼吸活动保持。TD组的RCR值略高于NE组，显示呼吸功能保存率较佳。数据以SEM平均±表示（n=3）。统计显著性使用未配对t检验（**P < 0.01）进行分析。 （b） 线粒体生化偶联效率与TD基团与NE基团ATP合成能力的比较。两组的联结效率值均接近1，表明呼吸高度耦合且ATP产生高效。数据以SEM平均±表示（n=3）。统计显著性采用未配对t检验（*P < 0.05）进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

接受细胞对分离线粒体的摄取情况进行了L929细胞的评估（见图6）。细胞与红色荧光染料标记的骨骼肌源线粒体共孵育，并用荧光肌动蛋白探针观察肌动蛋白细胞骨架。共焦点显微镜显示细胞质中分布着斑点状的红色荧光结构，表明L929细胞已吸收外源性线粒体。定量分析显示，线粒体摄取在12、24和48小时时呈时间依赖性增加。然而，24小时至48小时间仅观察到适度增加，表明摄取效率在24小时后接近饱和。此外，受体L929细胞在线粒体摄取后线粒体膜电位增加，显示线粒体功能有所改善。这些发现表明，通过该方案分离的骨骼肌来源线粒体可以在保持功能性活动的同时，被受体细胞有效内吞。

图6：L929细胞对骨骼肌来源线粒体的细胞摄取。（A） L929细胞在不同孵育时间（12小时、24小时和48小时）吸收纯化线粒体。在受体细胞质中检测到线粒体-荧光染料标记的线粒体（红色），而使用染色（绿色）观察肌动蛋白细胞骨架。核染色使用DAPI（蓝色）进行。共焦点显微镜确认L929细胞内化了外源性线粒体（比例条=50微米）。 （B） L929细胞在不同时间点线粒体摄取效率的定量分析。 （C） 在骨骼肌来源线粒体摄取后，对L929细胞线粒体膜电位的JC-1染色分析。 （D） 线粒体摄取后受体L929细胞JC-1聚集体与单体荧光比的定量分析。在活跃骨骼肌来源线粒体内化后，线粒体膜电位显著增加。数据以SEM平均±表示（n=3）。统计显著性采用单向方差分析（*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001）。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

线粒体移植是细胞治疗和再生医学中的一种新兴策略，通过传递功能完整的线粒体，恢复能量代谢受损细胞的生理功能。除了调控细胞能量代谢外，该技术还能调节细胞凋亡和氧化应激等关键生物过程，从而为多种疾病提供新的治疗机会 4,17,18,19。然而，线粒体移植的临床转化仍面临诸多挑战，其中包括缺乏标准化、高效且可重复的线粒体分离方案，这仍是一个主要瓶颈。

为解决这一问题，本研究建立了基于差别离心的标准化且可视化的实验方案，以高效分离功能性游离线粒体，从C57BL/6小鼠骨骼肌中分离。通过优化纯化程序，并结合胰蛋白酶的预消化、清洗和纯化步骤，该方法有效改善组织解离，保持线粒体结构完整性，并减少非靶细胞成分的污染。

该方案在线粒体纯度和产率之间实现了有利的平衡。与传统的研磨提取方法相比，现有方法更快、更实用且更具成本效益，适合常规实验室应用和供体线粒体制备。现有的线粒体分离方法各有其局限性。例如，密度梯度离心和免疫亲和纯化可以实现更高的纯度，但耗时且成本高，而纳米探针方法在常规应用方面尚未充分开发^20,21。对于骨肌等致密组织，优化的消化前胰蛋白酶步骤（0.25%胰蛋白酶在37°C下10-15分钟）结合温和均质化，比单用传统差动离心更能保持线粒体完整性。

本研究使用商业化差动离心试剂盒，在低温条件下全程遵循标准化流程，实现结构完整线粒体的快速采集。为解决提取过程中可能遇到的问题，如产量低、蛋白质污染和膜异常潜力，提出了多种故障排除策略。

线粒体产量低通常由均质化不足、组织数量不足或离心损失引起。这些问题可以通过确保充分的预消化、进行温和均质化（使用紧密均质剂10-15次）、使用至少100-150毫克新鲜骨骼肌组织、严格控制离心条件（1,000 × 克用于去除杂物，10,000-12,0 ×00 克用于线粒体沉淀）以及使用宽口径移液器头重新悬浮样品来尽量减少这些问题。蛋白质污染主要由残渣不完全清除或脂质干扰引起;因此，建议重复1,000 ×克 离心步骤，加入两次12,000 ×克 洗涤步骤，并仔细去除脂肪组织。线粒体膜电位异常通常与机械损伤或温度波动有关。因此应避免过度均质化，整个过程应在冰上进行，并在60-90分钟内完成，分离缓冲液应补充EGTA和0.5% BSA。通过确保酶促消化、选择合适的均质剂以及进行均质后过滤，可以改善不完全均质化。

尽管现有方案显著提高了线粒体分离的效率和纯度，但仍存在若干局限性。首先，该手术高度依赖组织新鲜度;理想情况下，组织样本应在死后1小时内处理。其次，如果洗涤过程中未充分去除，残留的胰蛋白酶可能会降解线粒体表面蛋白，包括转运酶相关蛋白，从而影响后续细胞的吸收效率。第三，线粒体储存时间有限，长期储存在4°C或低温保存会显著降低线粒体活性。

在转化层面，还面临额外挑战，包括提升 体内 递送效率、理解线粒体整合的长期机制，以及澄清移植线粒体与宿主基因组之间的潜在相互作用。随着线粒体分离和纯化技术的持续进步，预计未来方法创新将加速线粒体移植治疗的临床转化。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗细胞色素C抗体	Abcam	EPR1327	线粒体特性
抗褪色安装介质	PlantChemMed	PC-90016	减少荧光染料的光漂白
BCA蛋白测定试剂盒	中汇和彩生物技术有限公司	PQ003	蛋白浓度测定
β-肌动蛋白抗体	Cell Signaling technology	3700s	β-肌动蛋白抗体用于检测分离的线粒体纯度
BSA	Sigma	A6003	在分离过程中，它结合游离脂肪酸以保护线粒体活性。
离心机	Eppendorf	5418R	4 ℃ 离心
CCCP	Solarbio	C6700	解偶联线粒体氧化磷酸化并诱导最大质子泄漏
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus Corporation	FV4000	免疫荧光染色观察
COX IV多克隆抗体	Proteintech	11242-1-AP	线粒体特性
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	用于核染色
D-甘露醇	Solarbio	IM00402	保持渗透平衡并防止分离过程中线粒体肿胀
EGTA	Sigma	E4378	通常用于线粒体分离缓冲液中，通过特异性结合 Ca2+ 来保护线粒体功能
胎牛血清	Every Green	11011-08611	L929 细胞培养
镊子	RWD生命科学有限公司	F11003-11	用于抓握、持有和提升组织
玻璃研磨器	Beyotime	FGH005	用于组织研磨和线粒体分离
甲醛	LEAGENE	DF0151	它通过交联蛋白迅速固定和稳定细胞超微结构，防止自溶以保存细胞器的自然形态。
HEPES	Thermo Fisher	J67485	提供稳定的 pH 环境。
培养箱	Thermo Fisher	51032874	L929 细胞培养
JC-1	Solarbio	M8650	检测纯化线粒体膜电位的变化。
L929 细胞系	Procell	CL-0137	用于线粒体内吞检测
铅醋酸	Sigma	15326	用于染色超薄切片以观察精细亚细胞结构。
MEM Alpha 基础（1x）	Gibco	6125510	L929 细胞培养
甲醇	富裕化工（中国）	67-56-1	作为转移缓冲液的组成部分，用于去除 SDS 并促进蛋白质从凝胶转移到固相膜。
微板读取仪	Thermo Fisher	Varioskan LUX	测量 JC-1 染色线粒体的吸光度
线粒体膜电位检测试剂盒	Solarbio	M8650	骨骼肌线粒体膜电位检测
线粒体分离缓冲液	Solarbio	SM0020	基于差速离心的提取试剂盒
线粒体储存缓冲液	Solarbio	SM0020	用于线粒体保存
线粒体荧光探针 Red CMXRos	Yeasen 生物技术	40741ES50	线粒体特性
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	作为溶液制备中的缓冲液
Multi-rAb HRP-山羊抗小鼠重组二抗（H+L）	Proteintech	RGAM001	RGAM001 在蛋白质印迹中靶向小鼠 IgG (H+L)
Multi-rAb HRP-山羊抗兔重组二抗（H+L）	Proteintech	RGAR001	RGAR001 靶向兔 IgG (H+L) 在 ELISA 和蛋白质印迹中
无脂干奶粉	NCM 生物科技	WB6503	主要用作阻断剂，通过占据膜上非特异性结合位点来减少背景信号。
O2k-Fluo呼吸仪	Oroboros Instruments	O2K	确定线粒体呼吸功能和氧代谢。
四氧化锇	Sigma	75633	或后固定以保存脂质并增强 TEM 样品中的膜对比度。
PBS（1x）	Plant Chem Medicine	PC-00003	清洁肌肉组织
青霉素-链霉素	Procell	PB180120	L929 细胞培养
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	标记细胞骨架 F-肌动蛋白以进行荧光显微镜成像
聚偏氟乙烯（PVDF）膜	Millipore (Merck)	IPVH00010	蛋白质印迹
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	用于 SDS-PAGE 电泳分离蛋白质
预铸梯度聚丙烯酰胺凝胶（4-12%）	ACE Bioscience	ET12412LGel	用于 SDS-PAGE 分离线粒体和细胞总蛋白
蛋白酶抑制剂	陕西中汇和彩生物医药技术有限公司	PL032	抑制内源性和外源性蛋白酶的活性，防止样品处理过程中目标蛋白的降解。
RIPA 裂解缓冲液	中汇和彩生物技术有限公司	PL001-2A	用于动物和细胞组织的