从小鼠骨骼肌中分离、纯化和表征用于线粒体移植的功能性线粒体

摘要

建立了一种标准化方案，结合胰蛋白酶消化与差速离心法，用于从小鼠骨骼肌中分离、纯化线粒体并进行功能表征，同时评估其在线粒体移植中的应用。

摘要

线粒体是真核细胞中调控能量代谢、信号转导和细胞稳态的关键细胞器。线粒体功能障碍参与多种疾病的发病机制，由此推动了线粒体移植作为一种再生治疗策略的发展。线粒体移植的成功应用依赖于高纯度且功能完整的线粒体的可获得性。由于骨骼肌具有较高的线粒体含量、代谢活性以及易于获取的特点，是理想的供体来源。本研究建立了一种标准化、可重复的小鼠骨骼肌功能性线粒体分离、纯化与表征的实验方案，并评估了其在线粒体移植中的应用价值。该实验流程主要包括两个阶段：首先，通过胰蛋白酶消化结合差速离心法，从小鼠C57BL/6骨骼肌组织中分离线粒体；其次，对分离得到的线粒体进行纯度、超微结构及功能活性的表征。采用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量法和蛋白质印迹（Western blot）分析评估线粒体纯度；通过透射电子显微镜观察其超微结构完整性；利用JC-1染色和线粒体荧光标记，并结合高分辨率呼吸测定系统检测氧消耗、ATP生成能力及呼吸控制比，以评估其功能活性。分离获得的线粒体表现出稳定的膜电位、完整的超微结构以及良好的呼吸功能，表明其适用于后续功能研究及线粒体移植应用。

引言

线粒体是三磷酸腺苷（ATP）生成的主要场所，在细胞凋亡、钙稳态以及活性氧（ROS）代谢中发挥核心作用。因此，线粒体功能的完整性对于维持细胞稳态和决定细胞命运至关重要^1,2。线粒体功能障碍，包括线粒体DNA（mtDNA）突变和电子传递链（ETC）异常，会导致能量代谢受损、氧化应激以及细胞凋亡调控失常^3,4。这些异常与多种疾病相关，包括遗传性线粒体疾病、神经退行性疾病和心血管疾病^5,6。针对线粒体功能障碍的传统治疗策略，如抗氧化剂和代谢辅因子，通常疗效有限，因其仅能缓解症状而无法直接恢复线粒体功能^7,8。因此，线粒体移植作为一种有前景的再生医学治疗手段应运而生。该策略通过将完整的外源性线粒体递送至受损或功能异常的细胞中，以恢复线粒体活性和细胞能量代谢^9,10。既往研究表明，外源性线粒体可被受体细胞内化，并整合到内源性线粒体网络中，从而改善生物能量功能并增强细胞存活能力^11,12,13。

骨骼肌被认为是线粒体分离的合适供体，因其具有较高的线粒体含量、代谢活性以及易于获取的特点^14,15,16。线粒体移植需要多个关键步骤，包括线粒体的分离、纯化、功能表征以及高效递送至受体细胞。然而，迄今为止报道的实验方案在方法学上仍存在较大差异，尤其是在组织匀浆、酶消化、温度控制和纯化等操作步骤方面。这种差异性可能影响线粒体的得率、纯度及功能完整性，从而限制实验的可重复性。

为了提高方法学的一致性和可重复性，本研究提供了一种标准化的实验方案，通过胰蛋白酶消化和差速离心法从小鼠骨骼肌中分离并表征功能性线粒体。采用双辛可宁酸（BCA）蛋白定量、Western印迹、透射电子显微镜、基于荧光的膜电位检测以及高分辨率呼吸测定法，对分离得到的线粒体的纯度、超微结构完整性和功能活性进行了评估。此外，还评估了分离线粒体被受体细胞摄取的情况，以验证其在线粒体移植应用中的适用性。该方案为获取可用于后续实验研究的功能性骨骼肌来源线粒体提供了可重复的操作流程。

方案

所有动物实验均在特定病原体阴性（SPF）环境中进行，并经空军军医大学第三附属医院动物伦理与使用委员会批准（批准号：IACUC-2024kq-065）。

雄性 C57BL/6 小鼠（6–8 周龄，18–20 g）购自空军军医大学实验动物中心（生产许可证：SCXK（陕西）2024-002）。小鼠饲养于正压通风隔离笼（IVCs）中，环境洁净，温度为 20–26 °C，相对湿度为 40%–70%，光照-黑暗循环周期为 12 小时，每小时换气至少 15 次。提供灭菌饲料、饮水及环境丰富化设施。

本方案中使用的试剂、化学品和实验仪器列于材料表中。

1. 动物安乐死与组织采集

1. 将小鼠放入密闭的安乐死舱内，通过逐渐吸入二氧化碳（CO₂）的方式进行安乐死，流速为每分钟30%-70%舱体体积。
2. 通过观察自主呼吸和心跳停止、瞳孔反射消失以及对机械刺激无反应来确认动物死亡。
3. 将已安乐死的C57BL/6小鼠浸入75%乙醇中消毒5分钟。
   注意：为避免乙醇引起的组织固定和细胞损伤，浸泡时间不得超过10分钟。本实验全程应使用新鲜组织，因为冷冻会损害线粒体的活性和功能完整性。
4. 将小鼠置于超净台内的无菌培养皿中，腹部朝上，充分暴露腹部及后肢区域。
5. 用镊子提起靠近生殖区域的下腹部皮肤，做一小切口，采用钝性分离法将皮肤与皮下组织分开。沿中线向上延伸切口至踝关节，并向两侧后肢方向横向扩展，以完全暴露后肢肌群。
6. 辨认大腿前侧的股四头肌，沿肌纤维走向用钝性分离法小心分离该肌肉。切断远端髌韧带和近端肌腱，以完全游离肌肉组织。
   注意：使用预冷的含2%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS），每次更换新的培养皿，清洗组织三次，以最大限度减少污染。
7. 立即把分离的肌肉组织放入预冷的PBS中，充分冲洗，以去除组织表面的毛发和血液。
8. 用无菌纱布轻轻吸去组织表面多余液体。将组织分装至1.5 mL微量离心管中并称重。每份样品使用约100 mg组织，以保证各组之间的一致性。

2. 组织切碎与匀浆化

1. 将来自步骤 1.8的含有组织的微量离心管置于冰上。使用无菌剪刀将组织切成约 1–2 mm³ 大小的小片段。
2. 加入 8 倍体积的预冷 0.25% 胰蛋白酶，在冰上消化组织片段 15 分钟。
   注意：根据组织质量计算所需胰蛋白酶体积（1 mg ≈ 1 µL）。例如，向 80 mg 组织中加入 640 µL 的 0.25% 胰蛋白酶。
3. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留组织沉淀。将沉淀重悬于 1 mL 预冷的线粒体分离缓冲液中，缓冲液含有 D-甘露醇（215 mM）、蔗糖（75 mM）、HEPES（20 mM）、EGTA（1 mM）和无脂肪酸牛血清白蛋白（0.5% w/v）。
4. 将悬液转移至置于冰上的玻璃匀浆器中。使用 10–12 次轻柔的上下搅拌，直至悬液变浑浊。
   注意：避免在匀浆器底部横向旋转玻璃研杵，因为过大的机械力可能损伤线粒体膜并影响线粒体功能。

3. 差速离心

1. 将匀浆转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以1,000 × g离心5分钟。
2. 将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以12,000 × g离心5分钟，以获得粗线粒体沉淀。
   注意：使用1 mL注射器小心收集上清液，避免扰动沉淀及残留的组织碎片。

4. 线粒体的纯化与保存

1. 用预冷的洗涤缓冲液（含蔗糖（250 mM）、HEPES（10 mM，pH 7.4）、EGTA（1 mM）和牛血清白蛋白（0.15% w/v））轻轻重悬粗线粒体沉淀。在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。
2. 将上清液转移至新的离心管中，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，以获得纯化的线粒体沉淀。
   注意：应尽可能立即使用新鲜分离的线粒体。可在 4 °C 短期保存，或在含蔗糖（0.25 M）、Tris-MOPS（10 mM，pH 7.4）和 EGTA（0.1 mM）的线粒体保存缓冲液中于 −80 °C 长期保存。然而，冷冻可能损害线粒体的酶活性和呼吸功能。冷冻样品主要用于蛋白质分析。

5. 线粒体与胞质蛋白提取及BCA定量

1. 线粒体蛋白提取
   1. 将纯化的线粒体沉淀物每100 mg初始组织用50 µL RIPA裂解缓冲液重悬，冰上孵育15 min。
   2. 将裂解液在约 14,000 转下离心 × g 4 °C下离心15分钟。将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，以获得线粒体蛋白组分。
2. 细胞质蛋白提取
   1. 离心上一步获得的胞质上清液 步骤 4.2 在12,000 × g 4 °C下离心15分钟。弃去上清液，保留沉淀作为富集的胞质组分。
   2. 将细胞质沉淀重悬于50 µL RIPA裂解缓冲液中，并按照所述方法处理样品 步骤 5.1.1–5.1.2.
      注意：裂解缓冲液需新鲜配制，并加入蛋白酶抑制剂，所有操作均需在冰上进行，以尽量减少蛋白质降解。本步骤中使用的线粒体可为新鲜或冷冻的。
3. BCA 蛋白定量
   1. 按50:1（v/v）的比例混合试剂A和试剂B，配制BCA工作液。向96孔板的每个孔中加入200 µL工作液。
      注意：BCA 工作液需在使用前立即配制，并在室温下 1 小时内使用完毕。
   2. 将牛血清白蛋白（BSA）储备液（2 mg/mL）稀释至 0.5 mg/mL，并置于冰上保存直至使用。
   3. 通过向各孔分别加入 20、19、18、16、12、8、4 或 0 µL 的 BSA 溶液制备标准曲线。用 NaCl 溶液将最终体积调至 20 µL。
   4. 向一组孔中加入4 µL线粒体蛋白和16 µL NaCl溶液。向另一组孔中加入4 µL胞质蛋白和16 µL NaCl溶液。
   5. 向每孔中加入 200 µL BCA 工作液，在 37 °C 避光孵育 30 分钟。使用酶标仪在 562 nm 处测定吸光度。
   6. 构建蛋白标准曲线，其相关系数（R²≥ 0.999。通过标准曲线插值计算蛋白质浓度（µg/µL）。

6. 骨骼肌来源线粒体纯度的评估

1. 将线粒体和胞质蛋白样品稀释至终浓度为 1.5 µg/µL。配制含有 30 µg 蛋白和 4 × 上样缓冲液的 20 µL 反应体系，用 NaCl 溶液补足剩余体积。样品在沸水中加热 10 分钟，随后于 −80 °C 保存备用。
2. 使用 4%–20% 的预浇注梯度凝胶分离蛋白样品。在 140–150 V 条件下电泳 50 分钟。
3. 将 PVDF 膜（0.22 µm）在甲醇中活化 1 分钟，使用快速转膜缓冲液在 400 mA 条件下转膜 30 分钟。
4. 从转膜“三明治”结构中取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤 5 分钟，随后加入 5% 脱脂奶粉溶液，在室温下轻摇封闭 1 小时。
5. 用抗体稀释缓冲液将一抗（COX IV、细胞色素 c、β-actin）按 1:1,000 比例稀释，将膜与一抗在 4 °C 下孵育过夜。
6. 用 TBST 洗涤膜三次，每次 10 分钟。
7. 将膜与按 1:10,000 比例稀释的二抗在室温下孵育 1 小时。
8. 用 TBST 洗涤膜三次，每次 10 分钟。显影并采集图像。

7. 骨骼肌来源线粒体的 MitoTracker 染色

1. 使用前，立即用预热的培养基将染色工作液稀释至终浓度为 200 nM。
2. 用 100 µL 工作液重悬线粒体沉淀，在 37 °C 避光孵育 20 分钟。
3. 孵育后加入五倍体积的预冷保存缓冲液。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，弃去含有未结合染料的上清液。
4. 取部分染色后的线粒体悬液转移至载玻片上，盖上盖玻片。
5. 使用激光扫描共聚焦显微镜，根据红色荧光线粒体染料检测所需的适当激发和发射参数采集荧光图像。

8. 使用 JC-1 染色法评估线粒体膜电位

1. CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）处理组
   1. 用CCCP处理线粒体悬液，使其终浓度为10 µM，37 °C孵育20分钟，以消除线粒体膜电位。
   2. 将经CCCP处理的线粒体悬液与250 µL JC-1染色液在37 °C轻柔振荡孵育20分钟。
2. JC-1处理组
   1. 将线粒体沉淀重悬于100 µL JC-1工作液中，37 °C避光孵育20分钟。
   2. 通过将5×储存液与蒸馏水按2:8（v/v）比例稀释制备1× JC-1染色缓冲液，并将缓冲液置于冰上保存。
   3. 去除染色液，用预冷的1× JC-1染色缓冲液洗涤线粒体沉淀两次。
   4. 将染色后的线粒体重悬于PBS中，使用激光扫描共聚焦显微镜进行成像。选择适当的激发和发射参数，用于检测绿色荧光的JC-1单体和红色荧光的JC-1聚集体。

9. 通过透射电子显微镜对分离的骨骼肌线粒体进行超微结构分析

1. 将新分离的线粒体用0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制的2.5%戊二醛固定，在4 °C下孵育过夜。
2. 用0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤样品，并在室温下用1%四氧化锇后固定1小时。
3. 通过梯度乙醇系列对样品进行脱水，随后进行渗透、包埋，并在环氧树脂中聚合。
4. 使用超薄切片机将包埋的样品切成50–70 nm厚度的切片。
5. 用醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行双重染色，使用透射电子显微镜观察并成像样品。

10. 骨骼肌来源线粒体的细胞摄取

1. 使用完全培养基培养从商业供应商获得的 NCTC clone 929 (L929; RRID: CVCL_0462) 细胞，培养基为添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 MEM Alpha 培养基。
2. 当细胞融合度达到 80%–90% 时，吸除培养基，用预热的 PBS 洗涤细胞两次。加入胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育至细胞脱落。
3. 加入完全培养基以终止消化，并通过轻柔吹打形成单细胞悬液。将悬液在 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
4. 用新鲜完全培养基重悬细胞沉淀，按适当密度将细胞接种至新的培养皿中。于含 5% CO₂ 的湿润环境中，37 °C 培养。
5. 将第 5 代（P5）细胞接种至 35 mm 玻底培养皿中，过夜培养。
6. 在避光条件下，于 37 °C 使用线粒体特异性红色荧光染料对分离的线粒体标记 20 分钟，并用 PBS 洗涤线粒体以去除未结合的染料。
7. 将标记了红色荧光染料的线粒体（每皿 20 µg 线粒体蛋白）加入细胞中，在含 5% CO₂ 的湿润环境中，37 °C 孵育 24 小时。
8. 使用荧光肌动蛋白探针对细胞染色 30 分钟，以观察肌动蛋白细胞骨架，并用荧光核染料对细胞核进行复染。
   注意：共孵育过程中需严格控制血清浓度，过高的血清可能降低线粒体摄取效率。本步骤所用线粒体为新鲜制备。

11. 使用高分辨率呼吸测定法测量线粒体呼吸功能

1. 仪器准备
   1. 清洁呼吸室、电极室和密封塞。
   2. 将磁力搅拌子放入每个呼吸室中，并检查氧电极膜的完整性。
2. 仪器校准
   1. 向每个呼吸室中加入 2.1 mL 线粒体呼吸缓冲液（MiR05，pH 7.10），并确保无气泡存在。
   2. 将高分辨率呼吸测量系统在 37 °C 下平衡 30 分钟，在氧信号基线稳定后进行每日空气校准。
      注意：避免将气泡引入呼吸室，因为气泡会干扰氧电极信号并影响数据质量。本步骤中使用的线粒体为新鲜制备的。
3. 样品加载与平衡
   1. 向呼吸室中加入含有约 30 µg 蛋白质的 freshly isolated mitochondria，并密封呼吸室。
   2. 平衡呼吸室 5–8 分钟，并记录基础氧消耗率。
      注意：线粒体应始终保持在冰上，并在分离后立即进行呼吸测定，以维持其活性。
4. SUIT 实验方案
   1. 依次加入 5 µL 丙酮酸（2 M）、10 µL 谷氨酸（2 M）和 10 µL 苹果酸（400 mM），反应稳定 5 分钟后记录复合物 I 泄漏呼吸（CI Leak respiration）。
   2. 加入 10 µL ADP（500 mM）以启动氧化磷酸化，并记录复合物 I 氧化磷酸化呼吸（CI OXPHOS respiration）；随后加入 10 µL 氯化镁（0.3 M）。
   3. 加入 20 µL 琥珀酸（1 M），待反应稳定后记录复合物 I 与复合物 II 联合氧化磷酸化呼吸（CI+CII OXPHOS respiration）。
   4. 加入 2 µL ATP 合酶抑制剂（0.01 mM），并记录质子泄漏呼吸（proton leak respiration）。
   5. 以每次 2 µL、共三次的方式逐步加入 CCCP（1 mM），每次间隔 2 分钟，直至氧消耗达到平台期，记录最大电子传递系统容量（maximal electron transfer system capacity）。
   6. 加入 1 µL 鱼藤酮（1 mM）以抑制复合物 I 活性。
   7. 加入 1 µL 抗霉素 A（5 mM）以抑制复合物 III 活性，并记录残余氧消耗。
   8. 加入 5 µL 抗坏血酸（800 mM）和 5 µL N,N,N',N'-四甲基对苯二胺（200 mM），待反应稳定后记录复合物 IV 最大呼吸活性。
      注意：所有试剂应在冷冻前分装，避免反复冻融。CCCP 应逐步加入，过量解偶联会抑制线粒体呼吸。
5. 数据分析
   1. 使用数据分析软件获取线粒体呼吸参数，包括 CI Leak、CI OXPHOS、CI+CII OXPHOS、CI+CII Leak、CI+CII ET、CII ET 和 CIV。
   2. 计算呼吸控制比（RCR；State 3 呼吸 / State 4 呼吸）和 ATP 生成能力。所有数值保留三位有效数字用于统计分析。数据分析所用软件为 Oroboros Datlab 8（Oroboros Instruments）。

结果

线粒体分离与纯化工作流程的示意图见图1。所有操作均在4 °C下进行，以保持线粒体的完整性和功能活性。新鲜分离的骨骼肌组织经剪碎后，用胰蛋白酶消化以促进组织解离，随后在等渗分离缓冲液中使用玻璃匀浆器进行匀浆。接着通过差速离心法将线粒体与组织碎片及胞质污染物分离。首先在1,000 × g条件下离心去除细胞核和较大碎片，随后在12,000 × g条件下离心获得粗线粒体沉淀。进一步的洗涤和离心步骤进一步减少了胞质污染，最终获得适用于后续结构与功能分析的纯化线粒体（图1）。

讨论

线粒体移植是细胞治疗和再生医学领域的一种新兴策略，通过递送功能完整的线粒体，恢复能量代谢受损细胞的生理功能。除了调控细胞能量代谢外，该技术还可调节凋亡和氧化应激等关键生物学过程，从而为多种疾病提供新的治疗机会^4,17,18,19。然而，线粒体移植的临床转化仍面临诸多挑战，其中缺乏标准化、高效且可重复的线粒体分离方案仍是主要瓶颈之一。

为解决这一问题，本研究建立了一种基于差速离心法的标准化且可视化的实验方案，用于高效分离C57BL/6小鼠骨骼肌中的功能性游离线粒体。通过优化纯化流程，并引入胰蛋白酶预消化、洗涤和纯化步骤，该方法有效改善了组织解离效果，保持了线粒体结构的完整性，并减少了非目标细胞组分的污染。

本方案在线粒体纯度与得率之间实现了良好的平衡。与传统的研磨提取方法相比...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗细胞色素C抗体	Abcam	EPR1327	线粒体表征
抗荧光淬灭封片剂	植物化学生物学与医学	PC-90016	减少荧光染料的光漂白
BCA 蛋白检测试剂盒	中汇和财生物科技有限公司	PQ003	蛋白质浓度测定
β-actin 抗体	Cell Signaling Technology	3700秒	使用β-actin抗体检测分离线粒体的纯度
BSA	Sigma	A6003	在分离过程中，它结合游离脂肪酸以保护线粒体活性。
离心	Eppendorf	5418R	4 °C 离心
CCCP	Solarbio	C6700	解偶联线粒体氧化磷酸化并诱导最大质子漏
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus Corporation	FV4000	免疫荧光染色观察
COX IV 多克隆抗体	Proteintech	11242-1-AP	线粒体表征
DAPI	植物化学药物	PC-90004	用于细胞核复染
D-甘露醇	Solarbio	IM00402	维持渗透平衡并防止分离过程中线粒体肿胀
EGTA	Sigma	E4378	常用于线粒体分离缓冲液中，通过特异性结合 Ca2+
胎牛血清	绿色标记	11011-08611	L929细胞的培养
镊子	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	用于抓取、夹持和提起组织
玻璃匀浆器	Beyotime	FGH005	用于组织匀浆及线粒体分离
戊二醛	LEAGENE	DF0151	它通过交联蛋白质快速固定并稳定细胞超微结构，防止自溶，从而保持细胞器的天然形态。
HEPES	Thermo Fisher	J67485	提供稳定的pH环境。
培养箱	Thermo Fisher	51032874	L929细胞的培养
JC-1	Solarbio	M8650	检测纯化后线粒体膜电位的变化。
L929细胞系	普罗细胞	CL-0137	线粒体胞吞实验
柠檬酸铅	Sigma	15326	对超薄切片进行染色以观察精细的亚细胞结构。
MEM Alpha 基础培养基（1x）	Gibco	6125510	L929细胞的培养
甲醇	Fuyu Chemical (中国)	67-56-1	作为转膜缓冲液的组分，用于去除SDS并促进蛋白质从凝胶转移至固相膜。
微孔板读板仪	Thermo Fisher	Varioskan LUX	测量经JC-1染色的线粒体的吸光度
线粒体膜电位检测试剂盒	Solarbio	M8650	骨骼肌线粒体膜电位的检测
线粒体分离缓冲液	Solarbio	SM0020	基于差速离心法的提取试剂盒
线粒体储存缓冲液	Solarbio	SM0020	用于线粒体保存
Mito Tracker  红CMXRos	叶森生物技术	40741ES50	线粒体表征
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	在溶液配制中作为缓冲液
多克隆兔抗小鼠HRP标记重组二抗（H+L）	Proteintech	RGAM001	RGAM001 在 Western 印迹中靶向小鼠 IgG（H+L）
多克隆兔源 HRP-标记山羊抗兔重组二抗（H+L）	Proteintech	RGAR001	RGAR001 在 ELISA 和 Western blot 中靶向兔 IgG（H+L）
脱脂奶粉	NCM Biotech	WB6503	它主要用作封闭剂，通过占据膜上的非特异性结合位点来降低背景信号。
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	测定线粒体呼吸功能和氧代谢。
四氧化锇	Sigma	75633	或进行后固定以保存脂质并增强透射电镜样品的膜对比度。
PBS（1×）	植物化学药物	PC-00003	清洁肌肉组织
青霉素-链霉素	Procell	PB180120	L929 细胞培养
鬼笔环肽-488	Beyotime	C1035	荧光显微成像用细胞骨架F-actin标记
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜	Millipore（默克）	IPVH00010	蛋白质印迹法
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	用于SDS-PAGE电泳的蛋白质分离
预制梯度聚丙烯酰胺凝胶（4–12%)	ACE 生物科学	ET12412LGel	用于线粒体和细胞总蛋白的SDS-PAGE分离
蛋白酶抑制剂	陕西中汇合才 biomedical technology	PL032	抑制内源性和外源性蛋白酶的活性，防止样品处理过程中目标蛋白的降解。
RIPA裂解缓冲液	中汇和财生物科技有限公司	PL001-2A	用于动物和细胞组织的总蛋白提取
氯化钠注射液（0.9%）	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	批准号：H61020014	细胞/组织实验中的缓冲、洗涤及渗透压维持
无菌手套	江苏扬子力德医疗器械有限公司	YMZ000-1	分离污染源并保护操作人员及实验样品
蔗糖	蔗糖	S818048	提供渗透支持，维持线粒体形态和功能完整性。
TBST	NCM Biotech	WB20500	用于减少背景信号的洗涤步骤，可作为抗体和封闭溶液的稀释剂，同时通过维持稳定的pH和离子环境来保护抗原-抗体结合的稳定性。
组织匀浆测定试剂盒（含二磷酸腺苷（ADP）、琥珀酸、鱼藤酮、抗霉素A、寡霉素、丙酮酸、苹果酸） 谷氨酸,抗坏血酸,N,N,N',N'- 四甲基对苯二胺（TMPD）	北京华为中易科技有限公司	023012	组织匀浆中线粒体氧消耗率的检测（适用于Oroboros O2k呼吸仪）
组织剪刀	RWD Life Science Co., Ltd.	S12003-09	用于切割和解剖软组织，以及在动物解剖中分离器官和筋膜
透射电子显微镜	HITACHI	HT7800	分析线粒体的超微结构形态
胰蛋白酶	植物化学药物	PC-90001	器官预消化
通用抗体稀释液	NCM Biotech	WB100D	抗体稀释液
超薄切片机	Leica	EMUC7	用于制备透射电子显微镜（TEM）所需的超薄切片
醋酸铀酰	电子显微镜科学公司	22400	对超薄切片进行染色以增强细胞内结构的对比度。
垂直电泳槽	BIO-RAD	165-8001	用于SDS-PAGE电泳的蛋白质分离
洗涤缓冲液	Solarbio	SM0020	洗涤并纯化分离的线粒体，保持其结构和功能完整性
75% 乙醇	上海麦克林生化有限公司	E885996	用于实验室设备和实验材料的表面消毒