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研究文章

长链非编码RNA FGD5-AS1通过靶向miR-93-5p对脑出血后脑损伤的保护作用

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DOI：

10.3791/71556

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2026年8月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, 2Department of Neurology, Jianli People's Hospital, 3Department of Rehabilitation Medicine, Ganzhou People's Hospital, 4Department of Nephrology and Endocrinology, Ganzhou Fifth People's Hospital, 5Department of Neurosurgery, Langfang People's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究探讨了FGD5-AS1与miR-93-5p在实验性脑出血模型中的相互作用，发现FGD5-AS1敲低与神经功能损伤减轻、炎症反应降低以及氧化应激减弱相关。

摘要

脑内出血（ICH）是一种与高死亡率和高致残率相关的神经系统疾病，可导致严重的神经功能损伤。本研究探讨了FGD5-AS1在ICH中的作用及其潜在机制。体外和体内的ICH模型被建立。采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测FGD5-AS1和miR-93-5p的表达水平。使用改良神经功能缺损评分（mNSS）评估神经功能缺损，采用干湿重法评估脑水肿。利用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定炎症因子和氧化应激标志物。采用细胞活力与增殖检测试剂盒评估细胞活力。通过双荧光素酶报告基因实验和Pearson相关性分析检测FGD5-AS1与miR-93-5p之间的相互作用。实验性ICH在动物和细胞模型中均伴随FGD5-AS1表达的升高。抑制FGD5-AS1可减轻脑肿胀，改善神经功能，减少炎症和氧化损伤，并增强内皮细胞存活。抑制miR-93-5p会削弱这些保护作用，支持两者之间存在调控关系。FGD5-AS1负向调控miR-93-5p的表达，而抑制miR-93-5p可减弱FGD5-AS1敲低后所观察到的效应。这些结果表明，FGD5-AS1可能通过调控miR-93-5p参与ICH相关的脑损伤过程，FGD5-AS1/miR-93-5p轴可能成为实验性ICH中值得进一步研究的潜在靶点。

引言

脑内出血（ICH）是一种致死率和致残率较高的神经系统疾病，占所有卒中病例的10%至20%1,2。由于缺乏有效的治疗靶点，目前对ICH的治疗主要局限于手术和支持性治疗3。Pinho et al. 验证了关于ICH患者死亡率、功能预后及血肿扩大比例的预测模型，为医疗专业人员提供了新的视角4。尽管在ICH治疗方面已取得一定进展，患者的预后仍然不佳。因此，发现新的ICH治疗靶点对于改善长期预后具有重要意义。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的转录本，可通过多种机制调控基因表达，包括转录水平、转录后水平以及表观遗传学过程5。越来越多的证据表明，lncRNA表达异常与多种神经系统疾病的发生发展相关，例如脑卒中、创伤性脑损伤、脑内出血（ICH）和蛛网膜下腔出血6。在这些调控分子中，FGD5-AS1已被发现参与多种细胞过程，包括细胞增殖、凋亡、炎症信号传导以及氧化应激反应。通过竞争性内源RNA作用、转录调控和表观遗传修饰等机制，FGD5-AS1可影响多个下游靶基因的表达。已有研究报道，FGD5-AS1的异常表达见于多种病理状态，包括恶性肿瘤、心血管疾病和代谢性疾病7,8,9,10,11。然而，其在神经系统疾病中的生物学意义尚未完全阐明。既往研究表明，FGD5-AS1参与胶质瘤和胶质母细胞瘤的进展12,13，并在氧糖剥夺/再灌注条件下促进神经元损伤14。这些发现提示FGD5-AS1可能在神经损伤中发挥调控作用；但其在脑内出血后脑损伤中的具体作用仍有待进一步阐明。

微小RNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，通过与靶标信使RNA中的互补序列相互作用来调控基因表达15。研究表明，miRNA在脑出血（ICH）中也发挥着重要作用。例如，miR-143-3p通过靶向ATP6V1A促进急性脑损伤后中性粒细胞的跨内皮迁移16；miR-195-5p通过抑制MMP-9和MMP-2的表达，对ICH所致脑损伤发挥保护作用17；miR-93-5p也被确认为改善ICH预后的潜在治疗靶点18。尽管已有研究证实FGD5-AS1和miR-93-5p在ICH中存在异常表达，并参与ICH后神经功能障碍的进展过程，但既往研究主要聚焦于二者各自的生物学效应，而FGD5-AS1与miR-93-5p作为内源性RNA之间的竞争性调控关系尚未明确建立。

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方案

1. 实验动物

本研究经赣州市人民医院动物伦理委员会批准（批准号：20230789），并严格遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行。本研究采用SPF级雌性SD大鼠（6–8周龄，180–230 g）。大鼠饲养于温度控制在22 °C ± 3 °C、12小时光照/黑暗循环的环境中，可自由获取食物和水。动物在实验前适应环境7天。本方案中使用的化学品、试剂和设备详见材料表。

2. 建立 体内 ICH 模型

为建立实验性脑出血（ICH）模型，将0.23 U的VII型胶原酶溶解于1 µL无菌生理盐水中。大鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，随后以0.5 µL/min的速度将胶原酶溶液立体定位注入纹状体（前囟后方0.2 mm、中线外侧3.0 mm、颅骨表面下6 mm处）。对照组动物接受相同操作，但注射等体积的生理盐水而非胶原酶。实验设计的示意图见补充图1。

补充图1： 动物实验设计示意图。 大鼠被随机分为两组：一组使用0.23U VII型胶原酶构建脑出血（ICH）模型；另一组使用生理盐水作为对照组。模型组大鼠进一步随机分为两批，用于分析FGD5-AS1在ICH中的作用以及FGD5-AS1/miR-93-5p轴的协同效应。在诱导ICH后1小时，将转染试剂注射至大鼠脑内。在第0、1、3和7天使用mNSS评估大鼠神经功能；在诱导ICH后7天采集脑组织。请点击此处下载该文件。

将大鼠随机分为两组。其中一组用于分析 FGD5-AS1 在脑出血（ICH）中的作用，并进一步分为四个亚组：对照组（Control）、脑出血组（ICH）、脑出血+慢病毒-shNC 组（ICH + lentivirus (LV)-shNC）和脑出血+慢病毒-shFGD5-AS1 组（ICH + LV-shFGD5-AS1）。另一组用于分析 FGD5-AS1/miR-93-5p 轴的协同效应，并分为五个亚组：脑出血组（ICH）、脑出血+慢病毒-shNC 组（ICH + LV-shNC）、脑出血+慢病毒-shFGD5-AS1 组（ICH + LV-shFGD5-AS1）、脑出血+慢病毒-shFGD5-AS1 + antagomir NC 组（ICH + LV-shFGD5-AS1 + antagomir NC）和脑出血+慢病毒-shFGD5-AS1 + miR-93-5p antagomir 组（ICH + LV-shFGD5-AS1 + miR-93-5p antagomir）。每组包含 12 只大鼠。在诱导脑出血后 1 小时，将转染试剂以 2 mg/kg 的剂量注射至大鼠脑内。

3. 细胞培养与处理

脑微血管内皮细胞（BMECs）是研究血脑屏障、神经系统疾病机制及药物递送的关键模型20。一个 体外 采用氧糖剥夺（OGD）/氯化血红素处理在脑微血管内皮细胞（BMECs）中建立缺血性脑损伤（ICH）模型3. BMECs 在无葡萄糖和无血清的 DMEM 培养基中，于 5% CO 气体混合环境下培养2 和 95% N2 10分钟。然后用血红素（10µM）处理细胞，并转移至含有5% CO的厌氧室中2 和 95% N2 孵育2小时。通过将细胞恢复至正常培养条件以终止氧糖剥夺（OGD）。对照组在相同条件下用PBS处理。

细胞按照制造商的说明进行转染。细胞分别转染20 nM FGD5-AS1 siRNA（si-FGD5-AS1）、阴性对照siRNA（si-NC）、miR-93-5p抑制剂或空白对照抑制剂（NC抑制剂）。

4. 改良神经功能缺损评分测试

建立后 体内 在ICH模型中，于第0、1、3和7天采用改良神经功能缺损评分（mNSS）评估神经功能。评分基于四个领域：运动功能、感觉功能、平衡功能和反射功能。评分为1–4分表示轻度损伤，5–9分表示中度损伤，10–14分表示重度损伤。

5. 样本采集

脑出血诱导7天后，大鼠通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，随后经颈椎脱位处死，并采集脑组织。

6. 脑水肿的评估

采用干湿重法评估脑水肿19。脑组织取出后立即称重，得到湿重；随后将组织置于100 °C烘箱中干燥24 h，再次称重以获得干重。组织含水量按如下公式计算：

[（湿重 - 干重）/ 湿重] × 100%

7. 实时定量 PCR

采用RNA提取试剂，按照制造商提供的操作说明，从组织和细胞样品中提取总RNA。随后使用逆转录试剂盒合成互补DNA。然后利用实时荧光定量PCR平台进行定量PCR分析，以内源性参照基因为GAPDH和U6。扩增程序包括：95 °C预变性10分钟；随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性15秒，60 °C退火/延伸60秒。相对基因表达水平通过2−ΔΔCt法计算。本研究所用引物序列见补充表1。

补充表1：本研究中使用的引物序列及相关试剂序列。 实时荧光定量 PCR 实验中涉及的序列及所用试剂的相关序列 体外 实验。请点击此处下载此文件。

8. 细胞增殖实验

将转染的细胞接种至96孔板中。分别培养0、24、48和72小时后，每孔加入10 µL CCK-8试剂。细胞在37 °C孵育2小时，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。

9. 双荧光素酶报告基因检测

将包含 miR-93-5p 结合位点的 FGD5-AS1 野生型（WT）和突变型（MUT）3′-非翻译区（3′-UTR）克隆至 pGL3 载体中。使用转染试剂将该载体与 miR-93-5p 模拟物共转染。采用双荧光素酶报告系统检测相对荧光素酶活性。

10. 酶联免疫吸附测定

将脑组织样本（20–50 mg）以1:9的组织与缓冲液比例，在预冷的RIPA裂解缓冲液中进行匀浆。匀浆后，样品在4 °C下以12,000 × g 离心20分钟，并收集上清液用于分析。将各实验组的BMEC收集后，在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟，保留上清液。随后，根据制造商说明书，使用相应的检测试剂盒测定MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。

11. 统计分析

所有数据均以均值 ± 标准差表示。使用统计软件对数据进行可视化分析。每个实验至少重复三次。采用 t 检验比较两组间差异，采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 事后检验比较两组以上样本间的差异。当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

FGD5-AS1 对脑出血大鼠的影响

FGD5-AS1 在脑出血组中的表达显著高于对照组（P < 0.0001；图1A）。与 LV-shNC 组相比，转染 LV-shFGD5-AS1 后，FGD5-AS1 的表达显著降低（图1B）。脑水肿评估显示，脑出血大鼠的脑水肿程度较对照组大鼠更为严重，而沉默 FGD5-AS1 可显著降低脑含水量（图1C）。同样，脑出血诱导后 MDA 水平显著升高，而在 FGD5-AS1 沉默后其水平降低（图1D）。采用 mNSS 评估神经功能显示，脑出血组的神经功能损伤显著大于对照组，而沉默 FGD5-AS1 可改善神经功能结局（图1E）。此外，脑出血大鼠中炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的水平显著升高，但在...

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讨论

脑内出血后脑损伤不仅源于初始的出血事件，还源于随时间推移而逐步发展的多种继发性病理反应21。虽然原发性血肿可直接造成周围组织的机械性破坏，但后续损伤则由炎症激活、氧化损伤和程序性细胞死亡等过程介导。这些继发性机制显著导致神经功能恶化和不良临床预后22。因此，识别能够限制继发性损伤的分子通路仍是脑内出血研究中的重要目标。

越来越多的证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）是基因表达的关键调控因子，参与多种神经系统疾病的发生和发展23。LncRNA Snhg3可激活下游的神经炎症相关TWEAK/Fn14/STAT3通路，导致脑出血（ICH）大鼠脑微血管功能障碍24。LncRNA MIR17HG通过抑制FOSL2介导的HIC1转录激活，维持小胶质细胞在ICH进展过程中的促炎表型25。既往研究报道，FGD5-AS1在脑出血患者血清及小鼠模型中均显著上调...

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披露

作者无相关财务或非财务利益需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阴性对照antagomirGenePharma, 中国B04007阴性对照antagomir
BMECsATCC, 美国CRL-8270人脑微血管内皮细胞
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）碧云天, 中国C0038细胞活力检测试剂盒
DMEM培养基Gibco, 美国12430054无糖无血清培养基
Dual-Glo 荧光素酶检测试剂盒Promega, 美国E2920荧光素酶活性检测
电子天平SartoriusSecura224-1CN组织称重用精密天平
GAPDH和U6引物生工生物定制引物合成服务内参引物
Graphpad Prism 8.0GraphPad Software, 美国——统计分析软件
血晶素MCE, 中国HY-19424用于诱导细胞损伤的血晶素试剂
IL-1β ELISA试剂盒Abcam, 英国ab197742炎症性细胞因子定量检测
IL-6 ELISA试剂盒Abcam, 英国ab222503炎症性细胞因子定量检测
LightCycler 96 实时PCR系统Roche, 瑞士5815916001实时荧光定量PCR仪
Lipofectamine 3000Invitrogen, 美国L3000001转染试剂
MDA检测试剂盒碧云天, 中国S0131脂质过氧化检测试剂盒
酶标仪BioTekSynergy H1OD450吸光度测定
miR-93-5p antagomirGenePharma, 中国B05001体内实验用miR-93-5p抑制剂
PBS索莱宝, 中国P1020磷酸盐缓冲液
戊巴比妥钠Sigma, Merck KGaA11715麻醉剂
pGL3-启动子载体诺唯赞, 中国V011541荧光素酶报告载体
PrimeScript RT Mix试剂盒Takara, 日本RR037A反转录试剂盒
RIPA裂解液碧云天, 中国P0013B蛋白/组织裂解缓冲液
ShFGD5-AS1慢病毒GenePharma, 中国D02001FGD5-AS1敲低载体
SPF级雌性SD大鼠维通利华——6–8周龄，SPF级
SYBR Green实时定量PCR预混液Takara, 日本RR420A定量PCR试剂
TNF-α ELISA试剂盒Abcam, 英国ab208348炎症性细胞因子定量检测
TRIzol试剂Invitrogen, 美国15596026总RNA提取试剂
VII型胶原酶Sigma, Merck KGaAC0773来源于溶组织梭菌；用于ICH诱导

参考文献

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