量化胚胎致死率 秀丽隐杆线虫

摘要

本方案提供了一种简单且低成本的方法，用于定量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎致死率。该方法无需专业设备或挑虫技术，即可在群体水平上简便地检测胚胎异常。本方案可用于量化基因突变、RNA干扰介导的基因敲低以及饮食对胚胎发育的影响。

摘要

胚胎致死是用于研究的基石表型 秀丽隐杆线虫 研究旨在表征由毒性暴露和基因突变等因素引起的发育缺陷。因此，准确量化胚胎致死的外显率对于理解这些干扰因素对动物发育机制及影响至关重要。尽管已有自动化评分平台，但这些方法通常需要较高的资金投入以及专用的硬件或软件。本文介绍一种技术要求低、成本低廉的检测方法，通过测量未能成功孵化的胚胎所占百分比来量化胚胎致死率。值得注意的是，该检测版本无需使用线虫挑取工具，因而特别适合初学者操作。此方法的另一优势在于，每次技术重复可检测来自多个个体后代的情况，避免了单虫检测可能带来的偏差。本实验方案包含对关键参数的讨论，例如为准确反映表型外显率所需的最少后代数量，以及方法学设计的理论依据。最后，我们提供了将该检测方法改进用于评估基因敲降效应的操作指导 通过 RNA干扰、药物处理或营养补充，为工具箱增添了多功能且易于使用的方法 秀丽隐杆线虫 研究人员

引言

胚胎致死是评估基因和环境因素在早期发育中作用的关键表型。C. elegans 由于其固定的细胞谱系、透明的身体和快速的生活周期，成为研究发育过程的有力模型¹。C. elegans 胚胎致死率可用于评估化学、药理学、营养和遗传干扰条件下发育的完整性^2,3,4,5。因此，简便且通用的胚胎致死率精确定量方法将有助于推动相关科研领域的发展。

研究胚胎发生的先进高通量和高内涵方法依赖于专用的成像系统和软件，通常需要大量的资金投入^4,6,7，而较简单的高通量方法主要提供定性结果^8,9。相比之下，经典方法采用手动、低成本的方式，通常通过蠕虫挑取工具反复转移单个雌雄同体个体，以评估其全部子代的胚胎致死率^2,10。然而，该方法对初学者而言技术难度较高，且扩展性有限。此外，基于单个母体子代数量的传统检测方法仅量化单一母体后代的胚胎存活能力，可能引入无意的偏差。

本方法的总体目标是提供一种替代性的、简单、经济且多功能的方法，用于中等通量下胚胎存活率的定量分析。该方法通过每组重复测量多个个体后代的胚胎致死率，无需使用线虫挑取工具，也无需任何专用或昂贵的设备。本研究还展示了该方法如何应用于常见的实验干预，如RNA干扰以及药物或营养物质的测试。

方案

1. C. elegans 的培养与维护

注意：有关秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养的详细指南可参见 WormBook¹¹。

1. 准备用于维持培养的线虫生长培养基（NGM）平板。
   1. 配制1 L NGM培养基时，取3 g NaCl、2.5 g细菌用蛋白胨和17 g琼脂加入2 L瓶中，加入975 mL蒸馏水及一个搅拌子，于121 °C高压灭菌20分钟。
   2. 将培养基在水浴中冷却至55 °C，将瓶子置于磁力搅拌器上，采用无菌操作加入25 mL 1 M磷酸钾缓冲液，以及各1 mL的下列溶液：1 M MgSO₄、1 M CaCl₂和5 mg/mL胆固醇。每100 mm培养皿中倒入约25 mL培养基。
2. 制备大肠杆菌（E. coli）OP50过夜培养物。
   1. 采用无菌操作，向1 L锥形瓶中加入LB培养基至其体积的五分之一（200 mL），用无菌接种环接种单个E. coli OP50菌落。于37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
3. 用E. coli OP50接种NGM维持培养平板（图1A）。
   1. 将E. coli OP50培养物转移至已灭菌的离心管中，室温下以3,500 × g离心30分钟。将菌体沉淀用原体积的五十分之一的液体重新悬浮。每100 mm NGM平板使用1–1.5 mL浓缩菌液进行接种。
   2. 将平板在室温下过夜培养，使细菌生长。
      注：这些维持培养平板具有高密度细菌，可支持每平板最多4,000条线虫生长，适用于进行大量实验或培养生长缓慢的C. elegans品系。接种后的维持平板可在4 °C冰箱中保存最多1个月。
4. 建立初始的C. elegans培养物（图1A）。
   1. 使用无菌移液枪头从饥饿状态的维持平板上切下一小块含有约1,000条线虫的琼脂块，将该琼脂块转移至已接种的NGM平板上。
   2. 将新平板放入塑料容器中，在20 °C培养3天，直至线虫处于产卵期并开始产卵。确保细菌菌苔充足，避免线虫种群饥饿。此时，线虫种群已准备好用于实验。

2. 实验培养基和细菌培养物的制备

注意：在此步骤中，选择方法1以检测RNAi介导的基因敲低效果，或选择方法2以研究膳食补充剂的影响。

1. 方法1：通过喂食法准备用于RNAi的实验NGM平板。
   1. 按照步骤1.1所述制备1 L NGM，然后采用无菌操作技术加入1 mL 1 M IPTG和1 mL 50 mg/mL氨苄青霉素。每35 mm平板中倒入约5 mL。
   2. 接种所需数量的携带靶向秀丽隐杆线虫（C. elegans）目的基因的L4440质粒的E. coli HT115 RNAi喂食克隆，同时设置空载体对照。用接种环挑取单个菌落，转移至含有50 μg/mL氨苄青霉素的1.5 mL LB培养基中。在37 °C、200 rpm的摇床上孵育18小时。
   3. 用100 µL过夜培养的E. coli HT115菌液接种含氨苄青霉素和IPTG的35 mm NGM平板，每种条件设置两个技术重复。将平板在室温下过夜培养，以促进细菌生长并诱导双链RNA的产生。将相同数量未接种的平板储存在4 °C，用于后续的卵转移。
2. 方法2：制备添加营养补充剂或药物的实验NGM平板。
   1. 按照步骤1.1的说明制备1.5倍浓缩的NGM，但使用642 mL蒸馏水代替975 mL。将制备好的培养基置于55 °C水浴中保温。
   2. 将目标补充剂配制成水溶性储备液，浓度为最终目标浓度的3倍（例如，若需制备含40 mM甲酸钠的平板，则配制120 mM的储备液）。通过将实验平板数量乘以1.666 mL（即每板体积的三分之一）来计算所需储备液体积。使用注射器滤器对储备液进行过滤除菌，并在水浴中加热至55 °C。
   3. 在50 mL锥形管中，将2份1.5x NGM与1份补充剂储备液混合。对于无补充剂对照组，将2份1.5x NGM与1份热灭菌水混合。轻轻翻转管子10次以混匀，然后采用无菌操作技术迅速将约5 mL培养基倒入每个35 mm平板中。
      注：使用1.5x NGM是为了补偿添加大量补充剂时造成的培养基稀释。然而，如果药物或代谢物储备液浓度达到最终浓度的100倍或更高，则可使用常规NGM代替1.5x NGM。当补充有机酸时，使用其钠盐形式有助于防止培养基pH下降。
   4. 采用无菌操作技术，向50 mL三角烧瓶中加入10 mL LB培养基（占烧瓶体积的五分之一）。接种一环E. coli OP50菌落，并在37 °C、200 rpm的摇床上过夜培养。
   5. 用100 µL过夜培养的E. coli OP50菌液接种35 mm NGM平板，每种条件设置两个技术重复。将平板在室温下过夜培养。将相同数量未接种的平板储存在4 °C，用于后续的卵转移。

3. 获得同步化的L1幼虫群体

1. 通过将7 mL无菌水、2 mL 5%次氯酸钠溶液和1 mL 5 N NaOH混合，制备碱性漂白溶液。
2. 通过将3 g KH₂PO₄、6 g Na₂HPO₄和5 g NaCl溶解于1 L蒸馏水中制备M9缓冲液，然后调节pH至6.5。在121 °C下高压灭菌20分钟，待溶液冷却后，无菌条件下加入1 mL 1 M MgSO4。
3. 用M9缓冲液将产卵成虫（步骤1.4.2）从培养板上冲洗下来，并转移至15 mL锥形管中。在350 x g下离心2分钟，吸除上清液，再用新鲜M9缓冲液充满管子。重复洗涤两次。
4. 向虫体沉淀中加入2 mL M9缓冲液和2 mL碱性漂白溶液。涡旋并剧烈振荡，期间定期在显微镜下观察，直至几乎所有虫体溶解。
5. 用M9缓冲液充满管子，在350 x g下离心2分钟。通过倒置管子去除上清液，然后用M9缓冲液洗涤四次。确保在虫体裂解后立即进行第一次洗涤，以防止过度漂白。最后一次洗涤后，向管中加入8 mL M9缓冲液，并在摇床上孵育18–20小时，直至卵孵化。

4. 培养母本群体

1. 在玻璃载片上放置五滴3 µL线虫悬液，于显微镜下计数孵化出的L1幼虫数量。将总数除以15，得到每微升的浓度。
2. 将30条L1幼虫接种至每个已铺菌的35 mm培养皿中，在20 °C条件下培养72小时。若实验条件导致发育延迟，可延长培养时间，直至线虫变为产卵期并开始产卵（图1B）。

5. 将胚胎转移至孵化板

1. 从冰箱中取出未接种的35 mm培养皿，使其恢复至室温。
2. 在显微镜下检查线虫培养皿，确认其中含有超过100个胚胎，且无已孵化的L1幼虫存在。
3. 用M9缓冲液小心充满培养皿，使用真空管线吸去液体以去除母代群体。确保培养皿上无成虫残留。
4. 用移液器吸头吸取200 µL M9缓冲液，用力吹打以使胚胎从细菌菌苔上脱离。在显微镜下观察，将吸头引导至胚胎密集区域进行吹打。
5. 取一个未接种的培养皿，将一滴胚胎悬液移入其中心。在显微镜下检查液滴，若其中胚胎数量未达到100–300个，则继续添加胚胎悬液直至达到该范围。确保不将亲代群体中的线虫随胚胎一同转移。
6. 让液体自然干燥，随后将转移后的培养皿在20 °C下孵育至少24小时。
   注意：若实验培养皿中已有L1幼虫存在，请改用真空管线逐个移除整个母代群体，而非使用M9缓冲液洗涤。此操作可避免将不黏附于细菌菌苔的L1幼虫被冲洗掉。随后进行子代转移，此时转移物将同时包含胚胎和L1幼虫。确保所有实验条件下均采用相同处理方法。

图1： 胚胎致死率检测的实验时间线及关键步骤示意图。 (A) 流程图时间线表示从维持培养基制备到孵化板评分的整个实验方案持续时间。图中指出了实验各对应日期的关键操作步骤。B胚胎致死率检测示意图（步骤4–6）。 第4天，将同步化的L1幼虫加入实验用RNAi或添加物平板，以建立母代种群。72小时后（即第7天），待线虫产卵完毕，将母代个体洗去，而胚胎仍附着在细菌菌苔上。随后用移液器将胚胎从菌苔上冲洗下来，并转移至孵化平板，每板至少放置100个胚胎。经过24小时孵育后，统计已孵化的幼虫和未孵化的胚胎数量。 请点击此处以查看此图的放大版本。

6. 培养皿计数

1. 使用永久性记号笔在35 mm培养皿的皿盖上绘制一个约4 mm × 4 mm的网格，然后将皿盖置于培养皿下方。以该网格为参考，在显微镜下使用手持计数器统计L1幼虫和未孵化胚胎的数量。
2. 合并技术重复组的计数结果，以确保每个重复组根据其子代数量得到适当的加权。具体而言，将各技术重复组中未孵化胚胎和已孵化幼虫的数量分别相加求和。
3. 通过将胚胎数量（未孵化的线虫）除以线虫和胚胎的总数，再乘以100，计算每个生物学重复组的胚胎致死率，以百分比表示。
   注意：如果某培养皿中仅含有已孵化幼虫或仅含有胚胎，则可跳过此计数步骤，因为其胚胎致死率分别为0（0%）或1（100%）。

7. 统计分析

1. 重复整个实验至少三次，以获得独立的生物学重复。每次生物学重复中，每种条件需使用两个技术重复孔板，每个技术重复至少包含 100 个胚胎。
2. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）判断不同条件之间的胚胎致死率是否存在显著差异，随后进行事后两两 Student’s t-tests 检验，并使用多重检验校正方法（如 Benjamini-Hochberg 法）进行校正。
   注意：合并两个技术重复可获得每生物学重复至少 200 个胚胎。此样本量满足 R 基础函数 power.prop.test 所估算的样本量要求（约每条件 184 个胚胎），可在 90% 检验效能和显著性水平 α = 0.05 下检测出 15% 的致死率差异（例如，20% vs. 35%）。

结果

在两种品系中进行了胚胎致死率检测：野生型 N2 和 RNAi 超敏感品系 rrf-3(pk1426)。通过喂食法进行 RNAi，我们敲低了先前在高通量筛选中报道可导致胚胎致死的基因^9,12。图2 展示了该检测方法的代表性结果。T04G9.4 的敲低在 rrf-3(pk1426) 和 N2 动物中均产生接近完全外显的胚胎致死效应（图2A、B），因此可作为强胚胎致死表型的可靠阳性对照。由于胚胎致死率以比例形式测量，属于二项分布结果，其方差在取值范围中段预期最大，而在边界附近较小¹³。因此，接近极端值的表型，如载体对照（0% 致死率）或 T04G9.4 与 K08E3.5（100% 致死率），变异性较低。相比之下，外显率中等的 RNAi 敲低，如 B0272.3 和 fat-6

讨论

确保实验的可重复性和准确性需要注意多个关键步骤。首先，漂白步骤的时间必须严格控制，以溶解成虫而不损伤胚胎。其次，转移足够数量的胚胎进行计数至关重要：数量过少会降低统计精度，而过多则会使计数过程变得不必要的繁琐。接下来，应在胚胎开始孵化前完成胚胎转移。否则，孵化出的幼虫将随成虫一起被冲洗掉，导致孵化率偏低，从而高估胚胎致死率。最后，为了保持胚胎和L1幼虫计数的一致性，新手实验人员必须经过培训，以准确识别胚胎并检出所有孵化出的幼虫。这一看似简单的任务可能因杂质的存在以及细菌菌苔质地的变化而变得复杂，后者可能由某些添加剂引起。

还需区分真正的胚胎致死与发育迟缓。在标准条件下， 子宫外 野生型胚胎的胚胎发育在9小时内完成^14,15然而，某些突变菌株和处理条件可能会显著延缓胚胎发育^16,17,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素钠盐	Sigma-Aldrich	A9518
细菌蛋白胨	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	秀丽隐杆线虫遗传中心	N2	野生型
C. elegans NL2099	秀丽隐杆线虫遗传中心	NL2099	rrf-3(pk1426) II，RNAi 超敏感型
无水氯化钙	Sigma-Aldrich	746495
胆固醇	Sigma-Aldrich	C3045
15 mL 锥形管	VWR	60818-725
14 mL 培养管	VWR	470150-966
隔膜真空泵	Amazon	TC-100
解剖显微镜	AmScope	SM-2
大肠杆菌 HT115	秀丽隐杆线虫遗传中心		RNase III 缺陷型，用于喂养法 RNAi 实验
大肠杆菌 OP50	秀丽隐杆线虫遗传中心
颗粒状琼脂	Fischer Scientific	BP97445
手持式计数器	LabDepot	HTCP01
IPTG，无二噁烷（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）	US Biological	I8500
LB 培养基（Miller 配方）	US Biological	L1520	配制 LB 培养基时，将 25 g LB 粉末溶解于 1 L 蒸馏水中，121.1 °C 下高压灭菌 20 分钟。
鲁尔锁式一次性注射器	BH Supplies	BH20LL
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643
显微镜载玻片	Sail Brand	7101
100 mm 培养皿	Tritech Research	T3371
35 mm 培养皿	Tritech Research	T3501
磷酸钾缓冲液（PPB）			配制 1 M 磷酸钾缓冲液：将 98 g 磷酸二氢钾和 48 g 磷酸氢二钾溶解于 1 L 蒸馏水中，调节 pH 至 6，121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	795496
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	529568
摇床（往复式混合器）	Corning LSE	6720
25 mL 移液管	Corning	4489
5 mL 移液管	Celltreat	229235
Infors Multitron 摇床培养箱	INFORS HT	NA
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
5 N 氢氧化钠溶液	Fisher Scientific	SS256-500
5% 次氯酸钠	LabDepot	LC246302
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus 离心机	Thermo Scientific	75016030
磁力搅拌器	ONilab	ONi28-S
注射器滤器	Semmerfeld	JQP033022QE1
水浴锅	FOUR E's Scientific	WB401