量化胚胎致死率 秀丽隐杆线虫

摘要

本方案提供了一种简单且低成本的方法，用于定量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎致死率。该方法无需专业设备或挑虫技术，即可在群体水平上简便地检测胚胎异常。本方案可用于量化基因突变、RNA干扰介导的基因敲低以及饮食对胚胎发育的影响。

摘要

胚胎致死是用于研究的基石表型 秀丽隐杆线虫 研究旨在表征由毒性暴露和基因突变等因素引起的发育缺陷。因此，准确量化胚胎致死的外显率对于理解这些干扰因素对动物发育机制及影响至关重要。尽管已有自动化评分平台，但这些方法通常需要较高的资金投入以及专用的硬件或软件。本文介绍一种技术要求低、成本低廉的检测方法，通过测量未能成功孵化的胚胎所占百分比来量化胚胎致死率。值得注意的是，该检测版本无需使用线虫挑取工具，因而特别适合初学者操作。此方法的另一优势在于，每次技术重复可检测来自多个个体后代的情况，避免了单虫检测可能带来的偏差。本实验方案包含对关键参数的讨论，例如为准确反映表型外显率所需的最少后代数量，以及方法学设计的理论依据。最后，我们提供了将该检测方法改进用于评估基因敲降效应的操作指导 通过 RNA干扰、药物处理或营养补充，为工具箱增添了多功能且易于使用的方法 秀丽隐杆线虫 研究人员

引言

胚胎致死是评估基因和环境因素在早期发育中作用的关键表型。C. elegans 由于其固定的细胞谱系、透明的身体和快速的生活周期，成为研究发育过程的有力模型¹。C. elegans 胚胎致死率可用于评估化学、药理学、营养和遗传干扰条件下发育的完整性^2,3,4,5。因此，简便且通用的胚胎致死率精确定量方法将有助于推动相关科研领域的发展。

研究胚胎发生的先进高通量和高内涵方法依赖于专用的成像系统和软件，通常需要大量的资金投入^4,6,7，而较简单的高通量方法主要提供定性结果^8,9。相比之下，经典方法采用手动、低成本的方式，通常通过蠕虫挑取工具反复转移单个雌雄同体个体，以评估其全部子代的胚胎致死率²

方案

1. C. elegans 的培养与维护

注意：有关秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养的详细指南可参见 WormBook¹¹。

1. 准备用于维持培养的线虫生长培养基（NGM）平板。
   1. 配制1 L NGM培养基时，取3 g NaCl、2.5 g细菌用蛋白胨和17 g琼脂加入2 L瓶中，加入975 mL蒸馏水及一个搅拌子，于121 °C高压灭菌20分钟。
   2. 将培养基在水浴中冷却至55 °C，将瓶子置于磁力搅拌器上，采用无菌操作加入25 mL 1 M磷酸钾缓冲液，以及各1 mL的下列溶液：1 M MgSO₄、1 M CaCl₂和5 mg/mL胆固醇。每100 mm培养皿中倒入约25 mL培养基。
2. 制备大肠杆菌（E. coli）OP50过夜培养物。
   1. 采用无菌操作，向1 L锥形瓶中加入LB培养基至其体积的五分之一（200 mL），用无菌接种环接种单个E. coli OP50菌落。于37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
3. 用E. coli OP50接种NGM维持培养平板（

结果

在两种品系中进行了胚胎致死率检测：野生型 N2 和 RNAi 超敏感品系 rrf-3(pk1426)。通过喂食法进行 RNAi，我们敲低了先前在高通量筛选中报道可导致胚胎致死的基因^9,12。图2 展示了该检测方法的代表性结果。T04G9.4 的敲低在 rrf-3(pk1426) 和 N2 动物中均产生接近完全外显的胚胎致死效应（图2A、B），因此可作为强胚胎致死表型的可靠阳性对照。由于胚胎致死率以比例形式测量，属于二项分布结果，其方差在取值范围中段预期最大，而在边界附近较小¹³。因此，接近极端值的表型，如载体对照（0% 致死率）或 T04G9.4 与 K08E3.5（100% 致死率），变异性较低。相比之下，外显率中等的 RNAi 敲低，如 B0272.3 和 fat-6

讨论

确保实验的可重复性和准确性需要注意多个关键步骤。首先，漂白步骤的时间必须严格控制，以溶解成虫而不损伤胚胎。其次，转移足够数量的胚胎进行计数至关重要：数量过少会降低统计精度，而过多则会使计数过程变得不必要的繁琐。接下来，应在胚胎开始孵化前完成胚胎转移。否则，孵化出的幼虫将随成虫一起被冲洗掉，导致孵化率偏低，从而高估胚胎致死率。最后，为了保持胚胎和L1幼虫计数的一致性，新手实验人员必须经过培训，以准确识别胚胎并检出所有孵化出的幼虫。这一看似简单的任务可能因杂质的存在以及细菌菌苔质地的变化而变得复杂，后者可能由某些添加剂引起。

还需区分真正的胚胎致死与发育迟缓。在标准条件下， 子宫外 野生型胚胎的胚胎发育在9小时内完成^14,15然而，某些突变菌株和处理条件可能会显著延缓胚胎发育^16,17,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素钠盐	Sigma-Aldrich	A9518
细菌蛋白胨	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	秀丽隐杆线虫遗传中心	N2	野生型
C. elegans NL2099	秀丽隐杆线虫遗传中心	NL2099	rrf-3(pk1426) II，RNAi 超敏感型
无水氯化钙	Sigma-Aldrich	746495
胆固醇	Sigma-Aldrich	C3045
15 mL 锥形管	VWR	60818-725
14 mL 培养管	VWR	470150-966
隔膜真空泵	Amazon	TC-100
解剖显微镜	AmScope	SM-2
大肠杆菌 HT115	秀丽隐杆线虫遗传中心		RNase III 缺陷型，用于喂养法 RNAi 实验
大肠杆菌 OP50	秀丽隐杆线虫遗传中心
颗粒状琼脂	Fischer Scientific	BP97445
手持式计数器	LabDepot	HTCP01
IPTG，无二噁烷（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）	US Biological	I8500
LB 培养基（Miller 配方）	US Biological	L1520	配制 LB 培养基时，将 25 g LB 粉末溶解于 1 L 蒸馏水中，121.1 °C 下高压灭菌 20 分钟。
鲁尔锁式一次性注射器	BH Supplies	BH20LL
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643
显微镜载玻片	Sail Brand	7101
100 mm 培养皿	Tritech Research	T3371
35 mm 培养皿	Tritech Research	T3501
磷酸钾缓冲液（PPB）			配制 1 M 磷酸钾缓冲液：将 98 g 磷酸二氢钾和 48 g 磷酸氢二钾溶解于 1 L 蒸馏水中，调节 pH 至 6，121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	795496
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	529568
摇床（往复式混合器）	Corning LSE	6720
25 mL 移液管	Corning	4489
5 mL 移液管	Celltreat	229235
Infors Multitron 摇床培养箱	INFORS HT	NA
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
5 N 氢氧化钠溶液	Fisher Scientific	SS256-500
5% 次氯酸钠	LabDepot	LC246302
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus 离心机	Thermo Scientific	75016030
磁力搅拌器	ONilab	ONi28-S
注射器滤器	Semmerfeld	JQP033022QE1
水浴锅	FOUR E's Scientific	WB401