微胶质细胞参数绘图软件（MMPS）：一种用于定量分析微胶质细胞形态的开源、用户友好型工具

摘要

小胶质细胞参数绘图软件（MMPS）是一种用户友好的分析流程，无需编程专业知识，可对免疫荧光图像中的单个小胶质细胞形态进行半自动分析。该软件已在啮齿类动物脂多糖诱导的神经炎症模型中得到验证，能够稳定检测与激活相关的形态学变化，实现标准化、可扩展的小胶质细胞表型分析。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统中来源于髓系的免疫细胞，在神经系统损伤后介导组织降解与重塑，并已成为多种神经退行性疾病中具有前景的治疗靶点。对小胶质细胞形态的定量分析能够揭示不同小胶质细胞亚群之间的细微差异，同时保留重要的in situ信息。然而，目前许多可用的小胶质细胞形态分析平台要么未公开获取，要么需要专业的计算技能，从而限制了其广泛应用。为克服这些局限性，本研究开发了一个基于 Python 3.11 的开源小胶质细胞形态分析平台，称为小胶质细胞参数映射软件（Mapping Microglial Parameters Software, MMPS）。MMPS 与基于免疫荧光的工作流程兼容，安装和操作均无需编程经验。该软件通过易于使用的图形用户界面实现单细胞小胶质细胞形态分析的半自动化，并整合了可自定义的图像处理和掩膜生成工作流程。本研究采用啮齿类动物脂多糖（LPS）诱导的神经炎症模型对 MMPS 进行验证。定量的动物水平分析表明，与对照溶剂处理组相比，LPS 处理组动物的小胶质细胞胞体面积显著增加（p < 0.01），细胞周长显著减少（p < 0.05），这与小胶质细胞活化和神经炎症相关的形态学特征一致。总体而言，MMPS 为跨实验室的小胶质细胞形态定量分析提供了一个标准化、可重复的平台。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的固有免疫细胞，能够持续监视其周围环境中的病原体和组织损伤¹。激活后，小胶质细胞会回缩其突起，从稳态的分支状形态转变为阿米巴样表型^2,3。在缺血性中风^4,5和阿尔茨海默病^6,7等神经退行性疾病中，小胶质细胞常通过持续产生细胞因子、广泛降解组织以及吞噬作用来维持神经炎症²。这些过程会导致神经血管单元的破坏，进一步加剧小胶质细胞的活化和中枢神经系统损伤⁸，从而使小胶质细胞成为有前景的治疗靶点^9,10。

识别神经退行性疾病中不同小胶质细胞亚群间细微差异的一种方法是通过形态学分析。该方法通常使用Cx3CR1-GFP动物结合in vivo双光子显微镜¹¹，或通过免疫荧光（IF）标记已确立的小胶质细胞标志物，如离子化钙结合接头分子-1（Iba1）或P2Y嘌呤能受体¹²来实现。尽管小胶质细胞在损伤后常在稳态形态与阿米巴样形态之间转换，但先前的研究表明，小胶质细胞还可呈现其他表型，包括过度分枝状小胶质细胞^3,13、蜂窝状小胶质细胞^3,14、活化型小胶质细胞¹⁵以及杆状小胶质细胞^3,16。然而，目前对小胶质细胞形态的研究通常依赖于对稳态和阿米巴样表型的手动分类。这些方法需要专门的分析流程，而这些流程在不同实验室之间往往缺乏标准化，使得即使是经过培训的人员也难以区分相似的形态，例如稳态与过度分枝状表型之间的差异¹⁷。此外，基于免疫荧光的细微形态改变分析需要高分辨率成像，这可能带来额外的技术挑战。

为解决这些局限性，已开发出多种分析平台，可半自动¹¹或全自动¹⁸地检测小胶质细胞，并在用户自定义的目标区域（例如 200–800 µm²）内生成细胞的多个二值化图像，即所谓的“掩模”（masks）。这些方法可减少人为偏差，提高结果的可重复性，并提升分析效率。尽管取得了上述进展，但目前许多可用的软件平台仍存在限制其广泛应用的缺陷，包括缺乏开源可及性¹⁷、需要编程专业知识^11,19,20、依赖in vivo双光子显微镜系统^11,19、缺乏直观的图形用户界面^11,21,22、处理速度较慢¹¹，或依赖商业软件平台^12,19,21。尽管近期研究已开始解决其中部分问题，但许多现有平台仍难以适用于基于免疫荧光（IF）的工作流程，而后者在小胶质细胞形态学研究中仍被广泛使用。

本文介绍了一种面向用户的微胶质细胞形态学分析平台，称为微胶质细胞参数绘图软件（Mapping Microglial Parameters Software, MMPS）。MMPS 无需编程经验，可与基于 ImageJ 的现有工作流程集成，专为免疫荧光（IF）图像设计。该软件使用 Python 3.11 开发，融合了先前已发表的开源形态学分析平台中的若干概念¹¹。MMPS 具备直观的图形用户界面，支持用户导入并批量处理大量 IF 图像，并提供多种可自定义的图像处理选项。该平台还引入了手动细胞选择功能，以尽量减少免疫荧光成像过程中引入的过采样伪影；同时支持手动勾画胞体轮廓，避免将细胞突起纳入胞体测量中。此外，MMPS 包含可自定义的掩膜生成参数以及多种质量控制功能，以提高掩膜的准确性。软件可计算多个常用的形态学参数，包括周长、平均质心距离、掩膜面积、离心率、圆形度和胞体面积。对于更深入的研究，MMPS 生成的结果可与多种 ImageJ 插件兼容，并可通过配套的插件进一步进行分形、骨架和凸包分析。

通过检测皮层第四层中小胶质细胞的形态学改变，利用啮齿类动物脂多糖（LPS）诱导的神经炎症模型对MMPS进行了验证。定量分析表明，与给予载体的对照组相比，LPS处理显著增加了小胶质细胞胞体面积，同时减少了细胞周长，表明MMPS能够准确检测与小胶质细胞活化相关的小幅度形态学变化。

方案

所有动物实验均按照西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（方案编号 #2109047180）的规定以及美国国立卫生研究院支持的《实验动物护理和使用指南》进行。本方法中使用的仪器、试剂和软件列于材料表中。

1. 实验动物

1. 获取10只雄性Sprague-Dawley大鼠（2-3月龄）。大鼠到达动物房后，应以每笼多只的方式饲养，维持12小时光照/12小时黑暗的循环环境，并可自由摄取食物和饮水。大鼠到达后需适应环境3天，方可开始实验。
2. 将大鼠随机分配至溶剂对照组或LPS处理组（每组n = 5只大鼠）。
   注意：由于使用的大鼠数量较少，可采用简单随机化策略，通过计算机生成的随机数字将大鼠分配至各处理组。
3. 给药后监测大鼠是否出现“病态行为”：体重减轻（>15%）、分泌卟啉、呼吸异常或活动减少。
   注意：病态行为症状通常在给药后前12小时内出现，因此建议在清晨（上午6-8点）注射试剂，全天观察行为变化，并于傍晚（下午5-7点）将大鼠送回动物房。

2. 神经炎症模型

1. 通过将50 mg LPS溶解于5 mL磷酸盐缓冲液中，制备LPS（O111:B4）储存液（10 mg/mL）。
   注意：LPS为内毒素。研究人员应遵循所在机构关于其操作与处置的标准操作程序（SOP）。
2. 称量大鼠体重，随后通过腹腔注射给予LPS（10 mg/kg）或PBS（对照溶剂）。
3. 根据大鼠体重，预计注射体积为150–300 µL。
4. 注射后24小时，通过心脏灌注后断头法处死大鼠。
5. 使用吸入式异氟烷（5% O₂中）麻醉大鼠5–10分钟。通过足底回缩反射消失确认麻醉效果。
6. 在麻醉状态下，沿胸部正中线切开皮肤，暴露膈肌与胸骨。使用止血钳夹住剑突，以打开胸腔。
7. 剪开膈肌和肋骨，向四肢方向延伸切口，以暴露心脏。
8. 使用止血钳夹闭降主动脉和下腔静脉。将25号带翼针头插入左心室。
9. 使用蠕动泵以冰冻PBS进行灌注（25 mL，流速30 mL/min）。灌注开始数秒内切开左心房，以利于灌注液流出。
10. 使用4%多聚甲醛进行灌注（25 mL，流速30 mL/min）。
    警告：操作多聚甲醛时应佩戴适当的个人防护装备，并在通风良好的环境中进行。多聚甲醛废弃物应按照机构及当地法规妥善处置。
11. 灌注完成后，使用断头器对大鼠实施断头。
    注意：请遵循所在机构关于断头操作记录及刀片锐化维护的相关规定。
12. 向耳廓方向牵拉头皮，暴露颅骨。
13. 将止血钳或咬骨钳插入眼眶，击碎额骨。
14. 将镊子插入枕骨大孔，剥离顶骨。
15. 使用精细镊子取出脑组织，并在4%多聚甲醛中4℃孵育过夜。
16. 将脑组织依次转移至20%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液中，每种浓度均在4℃孵育过夜，以实现冷冻保护。

3. 免疫荧光

1. 在干冰上将经冷冻保护的脑组织置于Tissue Tek O.C.T. 包埋剂中冷冻。
2. 使用冷冻切片机将脑组织切成30 µm切片。
3. 将切片收集于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并转移至插入12孔板中的网状孔内。
4. 每只大鼠至少选取两个包含前背侧海马区的切片。
5. 在摇床上用PBS清洗切片，每次5分钟，共洗两次。
6. 在含0.3% Triton X-100的PBS中对切片进行通透处理，摇床孵育45分钟。
   注意：除非另有说明，每次洗涤或孵育步骤均使用3 mL溶液。
7. 用PBS清洗切片，每次5分钟，共洗两次。
8. 将抗原修复液用PBS稀释至1倍浓度，每孔加入2 mL。
9. 将切片置于水浴中，在80°C孵育20分钟。
10. 让切片自然冷却至室温后再进行后续操作。
11. 用PBS清洗切片，每次5分钟，共洗两次。
12. 将切片在含10%驴血清、0.05% Triton X-100的PBS中封闭，37°C振荡孵育2小时。
13. 用含1%驴血清、0.05% Triton X-100的PBS清洗切片，每次5分钟，共洗三次。
14. 将切片转移至新的不含网状孔的12孔板中，每孔加入500 µL用含1%驴血清、0.05% Triton X-100的PBS配制的一抗（抗Iba1抗体）溶液。
15. 通过在孵育液中省略一抗来制备阴性对照。
16. 所有切片在4°C下于旋转摇床上孵育过夜。
17. 将切片重新转移回网状孔中。
18. 用含1%驴血清、0.05% Triton X-100的PBS清洗切片，每次10分钟，共洗三次。
19. 将切片与二抗（抗兔抗体，1:1000稀释）在含1%驴血清、0.05% Triton X-100的PBS中室温孵育1.5小时。
    注意：从本步骤起所有后续操作应尽量避免光照，并用铝箔包裹培养板以防止荧光染料降解。
20. 用PBS清洗切片，每次5分钟，共洗两次。
21. 将切片贴附于显微镜载玻片上。
22. 在避光条件下空气干燥载玻片 >2 小时。
23. 使用水溶性封片剂对切片进行封片。
24. 使用封片介质制备阴性对照玻片。
25. 将玻片置于玻片盒中，在室温避光环境中保存。

4. 成像

1. 确定成像系统在40倍放大倍数下的像素尺寸。如果图像中未找到比例尺，请为每张图像添加比例尺。
2. 使用DAPI染色在低倍镜下识别对应于皮层第四层的致密皮层核带。
3. 将图像聚焦于已识别的皮层区域。
4. 切换至40倍放大倍数。
5. 调整各通道的曝光设置，以最大程度分离DAPI和Iba1信号与背景荧光。
6. 采集贯穿小胶质细胞全层深度的Z轴层扫图像（> 30步）。
7. 基于所采集的两种染色的Z轴层扫图像，生成并保存一幅复合的最大强度投影图像。
   注意：针对每幅图像优化曝光和Z轴层扫设置，以最大化DAPI/Iba1信号与背景荧光之间的信号分离。信号分离不良会降低掩模生成的准确性。

5. 小胶质细胞参数绘图软件（MMPS）

1. 将所有复合图像存储在单个图像目录中。
2. 为 MMPS 生成的结果创建一个独立的输出目录。
3. 从 GitHub 仓库下载 MMPS 独立程序包或 MMPS.py 脚本。
4. 如果通过 MMPS.py 启动 MMPS，需安装 requirements.txt 文件中列出的所有依赖项。
5. 打开 MMPS 程序包或运行 MMPS.py 脚本。
6. 选择“选择图像文件夹”并选定图像目录。
7. 选择“选择输出文件夹”并选定输出目录。
8. 如果操作系统提示，请授予文件夹访问权限。
   注意：补充文档和 GitHub 仓库中提供了额外的安装说明、故障排除指南和使用示例。
9. 选择“图像标注”，为每幅图像分配动物标识符和处理组别。
   注意：如果跳过图像标注步骤，MMPS 将在数据导出前提示输入处理组和动物标识符。
10. 在“参数”选项卡下输入像素尺寸。
11. 若未知像素大小，请选择“从比例尺校准”。当系统提示时，选择比例尺的起始点和终点，并输入已知的比例尺距离（单位为微米）。
12. 选择包含小胶质细胞信号的荧光通道。
13. 通过勾选每个图像名称旁的复选框来选择要处理的图像。当图像之间的背景荧光差异显著时，应单独处理各图像。
14. 查看“原始图像”、“预览”、“已处理图像”和“掩膜”选项卡，以比较图像处理的不同阶段。
15. 选择“预览当前图像”以评估图像处理设置。
16. 根据需要调整滚降球背景扣除、去噪和锐化参数。
17. 背景扣除时，使用 5–150 像素范围内的滚降球值。
18. 为减少不均匀照明伪影，使用 3–7 像素范围内的去噪值。
19. 使用 1–2 范围内的锐化值以改善边缘定义。
20. 优化图像处理参数后，选择“处理所选图像”。
    注意：图像处理时间取决于图像数量和所选参数。
21. 选择“选择胞体（全部图像）”。
22. 选择“显示彩色（C）”以显示 RGB 复合图像。如果图像颜色失真，选择“通道…”并取消勾选未使用的通道。
23. 选择显示 DAPI 与 Iba1 共定位的小胶质细胞胞体。避免选择接触图像边界的细胞。使用“Backspace”或“Delete”键删除错误选择的胞体标记。
24. 按“Enter”或“Return”键进入下一张图像。
25. 完成胞体选择后，选择“勾画胞体轮廓（全部）”。
26. 为每个选定的小胶质细胞勾画胞体轮廓。轮廓中应排除细胞突起，且每个胞体至少使用八个轮廓点。使用“撤销上一个点”、“Delete”或“Backspace”键删除错误放置的轮廓点。
27. 按“Enter”、“Return”、双击或右键单击以完成每个胞体轮廓。
28. 如有需要，选择“重做上一个轮廓”以重复上一个胞体轮廓操作。
29. 完成胞体轮廓绘制后，选择“生成所有掩膜”。
30. 设置最小阈值以限制低强度背景像素被纳入掩膜。
    注意：较高的阈值值可提高胞体准确性但牺牲分支结构，较低的阈值值则保留分支准确性但影响胞体。通常，10–30% 的阈值值可在背景抑制与分支保留之间取得平衡。
    注意：掩膜生成时间取决于所选细胞的数量。
31. 选择“全部掩膜质控”以开始掩膜质量保证。
32. 按面积从大（800 µm²）到小（200 µm²）的顺序审查掩膜。
33. 使用“已处理图像”和“掩膜”选项卡，将每个掩膜与对应的小胶质细胞进行比较。
34. 使用键盘快捷键“A”接受掩膜，使用“R”拒绝掩膜。按“B”键可撤销上一次接受或拒绝操作。使用键盘方向键浏览不同大小的掩膜。
35. 选择能够准确捕捉小胶质细胞分支结构、且不包含邻近细胞、过多背景、图像边界或比例尺的最大可接受掩膜。
    注意：若对掩膜准确性存疑，请拒绝该掩膜。
    注意：若大多数掩膜不准确，可选择“清除所有掩膜”，然后使用不同的阈值重新生成掩膜。
36. 完成掩膜质控后，选择“计算简单特征”以
    基于已接受的掩膜和胞体轮廓，计算平均质心距离、掩膜面积、周长、离心率、圆形度和胞体大小。
37. 参见表 1获取参数定义及神经炎症中小胶质细胞的变化趋势。
38. 下载“Sholl.py”、“FractalAnalysis_ImageJ.py”和“SkeletonAnalysisImageJ.py”以执行进一步分析。
39. 将“FractalAnalysis_ImageJ.py”作为 Fiji 插件打开，用于分形和凸包分析。
40. 当系统提示时，输入输出目录位置和像素大小。若仅需分析最大可接受掩膜，请选择“仅最大掩膜”选项。
41. 将“Sholl.py”作为 Fiji 插件打开，用于 Sholl 分析。
42. 当系统提示时，输入输出目录位置和像素大小。
43. 输入所需的 Sholl 分析步长。选择“使用胞体半径作为起始半径”以使用 MMPS 提供的胞体半径作为 Sholl 分析的起始半径。若不使用 MMPS 提供的胞体半径，则输入固定的胞体半径值。
44. 将“SkeletonAnalysisImageJ.py”作为 Fiji 插件打开，用于骨架分析。
45. 当系统提示时，输入输出目录位置、像素大小和掩膜文件夹位置。
46. 分析完成后，将所有插件生成的结果导出为 CSV 文件并保存至输出目录。

6. 小胶质细胞形态学计算中 MMPS 所用公式

注意：当点击“计算简单特征”时，MMPS 将自动执行所有计算。参数计算方法如下所示。

1. 周长
   1. 使用以下公式计算周长：
      
   2. 定义为周长，为边缘像素的数量，为像素尺寸（单位：µm）。
2. 平均质心距离
   注意： 平均质心距离也称为细胞铺展度¹¹。
   1. 根据细胞坐标确定四个分支末端点：
      上分支：最小 y 坐标，
      下分支：最大 y 坐标，
      左分支：最小 x 坐标，
      ​右分支：最大 x 坐标。
   2. 使用以下公式计算质心坐标：
      
      
   3. 定义 c_x 和 c_y 为质心坐标，x_i 和 y_i 为像素坐标，为像素总数。
   4. 使用以下公式计算分支距离：
      
   5. 定义 d 为分支距离，x_i 和 y_i 为分支末端坐标，c_x 和 c_y 为质心坐标。
   6. 使用以下公式计算平均质心距离：
      
   7. 定义为平均质心距离，为分支距离 d_i，为像素尺寸（单位：µm）。
3. 掩膜面积
   1. 使用以下公式计算掩膜面积：
      
   2. 定义为掩膜面积（单位：µm²），为掩膜内像素数量，为像素尺寸（单位：µm）。
4. 离心率
   1. 使用以下公式计算二阶中心矩：
      
      
      
   2. 定义 μ₂₀、μ₀₂ 和 μ₁₁ 为二阶中心矩，x_i 和 y_i 为像素坐标，c_x 和 c_y 为质心坐标，N 为像素总数。
   3. 使用以下公式计算协方差矩阵的特征值：
      
   4. 定义 λ₁ ≥ λ₂。
   5. 使用以下公式计算主轴和次轴长度：
      
   6. 定义 a 为主轴长度，b 为次轴长度。
   7. 使用以下公式计算离心率：
      
   8. 定义为离心率。
5. 圆形度
   1. 使用以下公式计算圆形度：
      
   2. 定义为圆形度，为主轴长度，为次轴长度。
6. 胞体大小
   1. 使用以下公式计算胞体面积：
      
   2. 定义 Sa 为胞体面积（单位：µm²），为胞体掩膜内像素数量，S 为像素尺寸（单位：µm）。

7. 统计分析

1. 使用 R 4.3.2 版本进行所有统计分析。
2. 使用每个细胞的最大可接受掩膜对数据集进行筛选。
3. 在统计分析前，将细胞参数在动物水平上取平均值。
4. 使用 Shapiro–Wilk 检验和 Levene 检验评估正态性与方差齐性。
5. 当数据集满足参数检验假设时，采用 Student t 检验或重复测量方差分析（ANOVA），并进行事后 Holm 校正的配对 t 检验。
6. 当数据集不满足参数检验假设时，采用 Wilcoxon 秩和检验或 Friedman 检验，并进行 Holm 校正的配对 Wilcoxon 符号秩检验。
7. 将统计学显著性定义为 p < 0.05。

结果

开发了一种开源的独立小胶质细胞形态学分析平台，称为小胶质细胞参数绘图软件（Mapping Microglial Parameters Software, MMPS），旨在为基于免疫荧光（IF）的小胶质细胞形态学分析提供一种易于使用且标准化的工作流程。该平台在以往形态学分析方法的基础上构建，无需编程专业知识，并集成了易于操作的图形用户界面。MMPS 的设计旨在提高对小胶质细胞细微分支结构的检测能力，同时引入多种保护机制，以尽量减少小胶质细胞掩膜的过度估计。

采用LPS诱导的啮齿类动物神经炎症模型对MMPS进行了验证。在完成组织处理和图像采集后（图1），通过缺乏一抗染色的阴性对照切片确认了免疫荧光（IF）的特异性（补充图1）。MMPS的处理流程始于将免疫荧光图像导入软件界面（图2A）。该软件提供多种图像处理选项，以增强小胶质细胞信号的检测能力并实现背景分离。系统强制执行基于Scikit-image软件包中滚动球算法的背景扣除，同时提供基于SciPy的高斯滤波器用于可选的去噪和锐化处理。图像处理完成后，通过红色选择标记手动选取并识别小胶质细胞胞体（图2B）。随后，手动勾画胞体边界，以用于后续的形态学计算（图2C）。

图1：神经炎症模型及处理流程的图示概述。大鼠注射LPS或PBS后24小时进行心脏灌注并处死取脑。取出大脑后切成30 µm厚的切片，用于Iba1（小胶质细胞标记物）的免疫荧光染色，随后进行MMPS分析。图示由Biorender制作。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：MMPS 使用概览。（A） 皮层小胶质细胞（红色，Iba1）及细胞核（蓝色，DAPI）的图像示例，用于在 MMPS 中进行参考（比例尺 = 75 µm，40x）。使用 MMPS 进行图像处理后，背景信号将被降低，并可准确评估细胞形态。（B） 在 MMPS 中处理图像后，通过红色圆圈手动选择胞体，用于后续方法中详述的步骤（比例尺 = 75 µm，40x）。（C） 两个代表性小胶质细胞被手动勾画轮廓，保存的胞体轮廓图像如下所示。（D） 所选细胞的掩膜生成可自动追踪小胶质细胞分支至 800 µm²，但需进行人工质量验证。此处展示了不准确的 800 µm² 掩膜，以及更准确的 700 µm² 掩膜。请点击此处查看该图的放大版本。

在完成胞体轮廓绘制后，MMPS 会使用由用户定义的最低强度阈值所约束的自适应阈值法，在 200–800 µm² 的尺寸范围内迭代生成掩膜。较小的掩膜更贴近用户定义的阈值，而较大的掩膜则逐步放宽阈值限制，以最大程度纳入分支结构。生成的掩膜需经过人工质量评估审查，以避免邻近细胞的纳入、过多背景信号的包含，或因图像边界或比例尺造成的截断。如图 2D所示，一个代表性小胶质细胞的 800 µm²掩膜延伸进入了邻近细胞。通过拒绝 800 µm²掩膜并选择 700 µm²掩膜，纠正了分割错误，同时保留了目标小胶质细胞的准确轮廓。

经过MMPS处理后，采用每个细胞最大可接受的掩膜来评估小胶质细胞的活化状态，因为这些掩膜在最小化背景干扰的同时最准确地捕捉到了远端分支结构。所计算的形态学参数总结于表1，并在图3中展示。与溶剂对照组相比，LPS给药显著降低了平均质心距离和细胞周长（p < 0.05；图3A、B），这与小胶质细胞活化过程中突起回缩的现象一致。在不同处理组之间，掩膜面积、圆形度或离心率均未观察到显著差异（图3C–E），尽管先前有研究报道这些参数与活化的小胶质细胞表型相关^3,23。本研究在统计效能上不足以检测胞体形状或掩膜面积的细微差异，且小胶质细胞亚群可呈现出异质性的炎症相关形态，未必普遍遵循上述趋势³。相比之下，与溶剂对照组相比，LPS处理动物的胞体面积显著增加（p < 0.01；图3F），进一步支持了活化相关形态重塑的存在²²。

图3：小胶质细胞形态学参数的比较。所有图中均进行了正态性检验（Shapiro-Wilk检验和Levene检验），所有情况下均无显著性差异（p>0.05），因此采用Student t检验。 圆点代表单个动物 （每组n=5）（A） 载体组的平均质心距离显著大于LPS处理组。（B） 载体组的小胶质细胞周长显著大于LPS处理组。（C） 不同处理组之间的掩膜面积无显著差异。（D） 各组之间的胞体偏心率无显著差异。（E） 不同处理组之间的胞体圆度无显著差异。（F） LPS组的胞体面积显著增加 * p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。

参数	定义	与小胶质细胞活化的关系
平均质心距离	细胞顶部、右侧、底部和左侧最远分支的平均距离	减小
周长	细胞轮廓的测量值	减小
掩膜面积	细胞的实际面积，而非目标掩膜面积	减小
离心率	细胞胞体近似伸长程度的测量值（0：圆形，1：高度伸长）	减小
圆度	细胞胞体近似圆形程度的测量值（0：伸长，1：圆形）	增大
胞体大小	细胞胞体的面积	增大

表1：由小胶质细胞参数绘图软件（MMPS）计算得到的参数及预测的小胶质细胞激活反应变化。 该表格总结了由小胶质细胞参数绘图软件（MMPS）计算的形态学参数，包括周长、平均质心距离、掩模面积、离心率、圆形度和胞体面积。

随后通过向经过设盲且此前未经培训的用户提 供相同的图像集以进行独立分析，来评估用户间的可重复性（补充图 2）。不同用户之间的差异无统计学意义，所有用户均重现了与LPS处理动物中小胶质细胞活化一致的形态学趋势。

MMPS 还支持下游的高级形态学分析。图3生成的参数相关性分析揭示了不同形态特征之间的关系。溶剂处理的大鼠仅显示小胶质细胞圆度与周长之间存在较弱的相关性（R² = 0.17），而LPS处理的大鼠则表现出更强的相关性（R² = 0.64），表明小胶质细胞活化程度增加与圆度和周长的同时降低相关（图4A）。此外，在溶剂处理组和LPS处理组中，掩模面积与平均质心距离均呈显著正相关（R²分别为0.71和0.88），这与小胶质细胞活化状态相关的分支复杂性变化一致（图4B）。

图 4：小胶质细胞参数的高级分析。所有图示均为基于普通最小二乘法计算的动物水平最佳拟合直线，显示其决定系数（R²）并以95%置信区间进行阴影填充。（A） 小胶质细胞胞体圆形度与总周长在对照组小胶质细胞中呈弱相关趋势（R² = 0.17），而在LPS处理后相关性增强（R² = 0.64）。（B） 平均质心距离与小胶质细胞面积在对照组（R² = 0.71）和LPS组（R² = 0.88）中均呈显著相关。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：通过阴性对照验证免疫荧光实验方案。每只大鼠相同脑区的一张切片在进行免疫荧光（IF）实验时未添加一抗，以确认无自发荧光（比例尺 = 75 µm）。(A) 载体处理组织的DAPI染色代表性图像（蓝色）。(B) 载体处理组织的Iba1染色代表性图像（红色）。(C) 载体处理组织的DAPI（蓝色）和Iba1（红色）共染色代表性图像。(D) LPS处理组织的DAPI染色代表性图像（蓝色）。(E) LPS处理组织的Iba1染色代表性图像（红色）。(F) LPS处理组织的DAPI（蓝色）和Iba1（红色）共染色代表性图像。请点击此处下载该文件。

补充图2：MMPS用户间差异评估。多位盲法评估者对图3中的相同样本使用MMPS，并比较了动物水平的结果。所有数据的正态性检验（Shapiro-Wilk检验和Levene检验）均无显著性差异（p>0.05），因此采用重复测量方差分析（ANOVA），并进行事后Holm校正的配对t检验（p>0.05）。(A) 各组间用户在平均质心距离上无显著差异（p>0.05）。(B) 各组间用户在周长上无显著差异（p>0.05）。(C) 各组间用户在掩膜面积上无显著差异（p>0.05）。(D) 各组间用户在离心率上无显著差异（p>0.05）。(E) 各组间用户在圆形度上无显著差异（p>0.05）。(F) 各组间用户在胞体面积上无显著差异（p>0.05）。 请点击此处下载该文件

讨论

本方法的主要目标是通过降低常见的技术障碍，同时保留现有形态学评估方法的优势，从而提高小胶质细胞形态学分析的可及性。MMPS 能够检测到小胶质细胞细微的形态学改变，同时兼容多种高级分析方法，包括分形分析、骨架分析、凸包分析和 Sholl 分析。与先前发表的方法相比，MMPS 提供了易于使用的图形用户界面，集成了常用形态学参数的自动计算功能，并无需编程操作，同时仍保持与更高级下游分析的兼容性。

多个关键的方法学步骤会显著影响分析的准确性和可重复性。高质量的免疫荧光（IF）成像对于可靠地生成掩膜及进行形态学计算至关重要。抗体特异性是图像质量的主要决定因素，因为非特异性标记会增加背景荧光，降低小胶质细胞与周围组织之间的信号分离度。同样，抗体浓度不理想也会降低荧光强度并削弱图像分辨率。Z轴层扫图像的采集同样关键，若省略Z轴层扫成像，可能会人为改变小胶质细胞分支复杂性和突起延伸的表观特征，从而导致形态学计算出现偏差。

在进行 MMPS 处理过程中，还需考虑若干其他重要因素。尽管 MMPS 支持批量图像处理，但通常更推荐对单张图像进行独立优化，因为不同图像之间的背景特征和染色质量可能存在显著差异。图像质量直接影响掩膜生成的准确性，因此在图像预处理阶段进行优化可显著提高后续分析的可重复性和稳健性。小胶质细胞胞体的仔细筛选也至关重要，尤其应避免选择接触图像边界的细胞，因为部分细胞的选中会人为地减小胞体测量值并干扰掩膜生成。在进行掩膜质量保证审查时，应剔除包含邻近细胞、过多背景区域或图像边界的掩膜。相反，不应仅因较小的掩膜未能覆盖所有远端突起而将其剔除，因为迭代掩膜生成算法会根据掩膜大小和局部像素强度有意调整局部阈值参数。

该方法具有高度可适应性，可根据特定的实验需求进行修改。由于MMPS是开源的，因此可以扩展该平台以分析单个Z轴层析图像帧，或整合自动细胞检测算法，从而构建完全自动化的形态学分析流程。此外，生成的掩膜和胞体轮廓仍可与基于ImageJ的工作流程兼容，用于分形、凸包、骨架和Sholl分析。由于MMPS是使用Python 3.11开发的，因此还可以利用常见的科学Python软件包，直接在软件中集成额外的分析功能，而无需依赖外部软件平台。

尽管具有上述优势，但仍需考虑若干局限性。MMPS 是在特定脑区的雄性 Sprague-Dawley 大鼠神经炎症模型中得到验证的，而不同脑区、疾病模型、物种或生物性别可能影响形态学结果。因此，MMPS 在其他实验范式中的适用性应通过预实验研究加以验证，或通过与既往文献的比较提供支持。此外，基于免疫荧光（IF）的成像无法完整捕捉三维分支结构，因为垂直于焦平面方向延伸的突起在最大投影图像中可能无法被检测到。增加分析细胞的数量可能有助于缓解这一局限性。MMPS 仍依赖于图像采集质量，因此需要针对不同的成像系统、染色方案和抗体制备条件进行优化。低分辨率图像可能导致掩膜尺寸被人为放大，原因在于胞体周围及紧密排列的分支边界模糊。鉴于此，本方案采用了游离漂浮式免疫荧光方法以及多种图像处理选项，以最大程度提升图像质量。

MMPS 还在一定程度上存在由用户引起的变异性，因为用户需手动选择细胞并勾勒胞体轮廓。然而，通过使用 DAPI 与 Iba1 的共定位，可在细胞选择过程中显著降低不确定性。此外，经盲法的用户间分析表明，未经培训的用户之间仍具有极低的变异性，证明该分析流程具有良好的可重复性。

与之前发布的多种小胶质细胞形态学分析平台不同，MMPS 并非完全自动化。然而，该设计旨在优先保证分割的准确性和掩膜的质量控制。通过修改 Python 源代码，可将自动化流程整合到本系统中，以实现自动化的 DAPI/Iba1 共定位检测、基于轮廓的胞体勾画，以及基于机器学习的掩膜接受或拒绝判断。此外，MMPS 需要较大的磁盘存储空间，因为生成的掩膜和胞体轮廓会自动保存为 .tiff 文件，用于后续分析和质量控制。通过修改软件，使其按单个细胞顺序生成掩膜，并立即进行质量评估和参数提取，可降低存储需求。

总之，MMPS 通过提供一个标准化的开源平台，扩展了小胶质细胞形态定量分析的应用范围，该平台无需编程专业知识或in vivo成像能力。该平台支持基于免疫荧光的小胶质细胞形态的可重复分析，同时保持与先进的下游分析方法的兼容性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔板	Fisher Scientific	07-200-82	用于组织切片的孵育和洗涤。
铝箔	Fisher Scientific	01-213-101	用于保护荧光样品免受光照。
抗原修复缓冲液（10×）	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	用于在免疫荧光染色过程中提高抗原的可及性。
抗Iba1一抗	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	用于小胶质细胞免疫荧光标记的一抗。
冷冻切片机	Fisher Scientific	95-710-0L	用于对冷冻脑组织进行规定厚度的切片。
驴抗兔IgG，Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	用于可视化兔一抗的荧光二抗。
驴血清	Fisher Scientific	50-413-115	用于减少非特异性抗体结合的封闭试剂。
EVOS FL Auto 2 成像系统	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	用于图像采集的荧光显微镜。
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	用于下游形态学分析及插件应用的图像处理平台。
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	用于保存荧光信号并固定盖玻片的封片介质。
异氟烷	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	动物实验过程中使用的吸入性麻醉剂。
脂多糖	Millipore Sigma	L2630	用于在啮齿类动物中诱导全身性神经炎症和小胶质细胞活化。
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		用于数据可视化和图表生成的Python绘图库。
MMPS（小胶质细胞参数映射软件）v1.00	本研究	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	为小胶质细胞形态学分析开发的开源软件平台。
Net小室	Millipore Sigma	CLS3477	染色过程中用于承载游离组织切片的插入式装置。
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		在MMPS中用于数值计算的Python库。
物镜（4×）	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	用于解剖定位和区域识别的低倍物镜。
物镜（40×）	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	用于小胶质细胞形态成像的高倍物镜。
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		在MMPS中用于图像处理功能的计算机视觉库。
多聚甲醛	ThermoFisher Scientific	169650025	用于组织灌注及切片前固定的固定剂。
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	用于玻片长期保存的永久性封片介质。
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP3991	用于组织洗涤和试剂配制的缓冲溶液。
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		用于图像处理操作的Python图像处理库。
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		用于生成MMPS图形用户界面的Python GUI框架。
Python 3.11	Python软件基金会	python.org	用于开发和运行MMPS的编程语言环境。
R 4.3.2	R统计计算基金会	r-project.org	用于数据分析和图表生成的统计软件。
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		用于图像处理和分割的Python图像分析库。
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		用于滤波和图像处理操作的Python科学计算包。
SD大鼠	Evingo	002	用于验证神经炎症模型的实验动物。
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3	脑组织冷冻前使用的冷冻保护剂。
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		用于读取和写入TIFF图像文件的Python包。
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583	用于冷冻组织样本切片的包埋介质。
吐温X-100	Fisher Scientific	BP151-100	免疫荧光过程中用于细胞膜通透的去垢剂。