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方法文章

使用氢氧化钠和脱氧胆酸钠制备去细胞人外周神经移植物

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DOI：

10.3791/71578

⸱

2026年9月1日

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种标准化的碱辅助脱细胞方法，该方法结合氢氧化钠处理与蠕动泵驱动的溶液置换系统，以制备脱细胞化的人外周神经移植物，可有效去除细胞成分并保留天然的细胞外基质结构。

摘要

周围神经损伤通常需要移植物材料为轴突再生提供结构引导。尽管自体神经移植仍是临床金标准，但其应用受限于供区并发症和可用组织有限。这些局限性促使人们日益关注去细胞化人周围神经移植物作为神经再生的替代生物材料。然而，常用的基于去污剂的去细胞化方案可能会破坏细胞外基质（ECM）结构，并残留具有细胞毒性的物质，从而影响移植物质量。本文介绍了一种标准化的制备去细胞化人周围神经移植物的方案，采用碱辅助去细胞化方法。该方法首先使用氢氧化钠（NaOH）处理以有效破坏细胞成分，随后采用温和的脱氧胆酸钠（SDC）步骤，去除残留的细胞和免疫原性成分，同时保留天然的ECM结构。该策略减少了去污剂暴露，有助于维持天然ECM架构。操作流程包括供体神经准备、可控的NaOH处理、后续温和的SDC处理，以及在蠕动泵驱动系统中通过持续溶液交换进行充分洗涤，以促进去除残留加工试剂。进一步的后处理步骤用于维持结构完整性，并为移植物的最终包装和灭菌做好准备。通过组织学分析和残留DNA定量评估去细胞化效率，利用扫描电子显微镜检测ECM结构的保留情况。通过细胞毒性测试确认了处理后移植物中无残留SDC及其生物相容性。该方案为开展周围神经再生研究及转化应用提供了实用的去细胞化人周围神经移植物制备方法。

引言

周围神经损伤可导致严重的功能障碍，在再生医学和重建外科领域仍是重大的临床挑战。节段性神经缺损的再生需要移植物材料，这些材料不仅要能够桥接损伤间隙，还需提供结构引导和生化信号，以支持轴突再生和神经再支配。自体神经移植被广泛认为是临床金标准，因其能够保留天然的细胞外基质（ECM）结构，并为神经再生提供有利的微环境1,2。然而，其临床应用受限于供体组织来源有限、需要额外手术操作以及供区并发症等问题3,4。这些局限性推动了替代性移植物材料的开发，特别是去细胞化周围神经移植物，这类材料在最大限度减少免疫原性细胞成分的同时，保留了天然的ECM结构5,6,7,8。

脱细胞神经移植物的性能在很大程度上取决于脱细胞过程。传统方法通常依赖基于去垢剂的试剂，如 Triton X-100 和脱氧胆酸钠（SDC），这些试剂通过溶解脂质膜来去除细胞成分9,10,11。然而，长时间暴露于这些去垢剂可能破坏细胞外基质（ECM）的微观结构，并残留具有细胞毒性的物质，从而对细胞活力和再生效果产生不利影响12,13。因此，目前正积极研究能够在有效去除细胞的同时保持 ECM 完整性的替代脱细胞策略14。使用氢氧化钠（NaOH）进行碱性脱细胞已成为一种潜在的替代方法，因为极端 pH 条件可高效降解细胞成分、核酸和脂质15,16,17。然而，强碱性条件的非受控暴露可能损害 ECM 的完整性，凸显了精确控制处理条件的重要性16,18。

本文介绍了一种标准化的碱辅助去细胞化方法，用于人外周神经移植物的制备，并结合了由蠕动泵驱动的连续溶液交换系统。与传统的静态浸泡方法相比，该动态过程能够实现持续的溶液更换，有助于清除细胞碎片及残留的处理试剂。文章通过可视化方式逐步展示了完整的操作流程，包括供体神经的准备、可控的碱辅助去细胞化处理，以及利用蠕动泵驱动系统进行的连续溶液交换。所得移植物通过组织学分析、残留DNA定量和扫描电子显微镜（SEM）进行评估，以确认去细胞化的高效性及细胞外基质（ECM）超微结构的保留。通过对关键技术步骤的清晰展示，本文为去细胞神经移植物的制备以及后续工艺的放大提供了明确的操作框架。

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方案

捐赠的人类外周神经来自美国组织库，在L&C BIO的独家协议下获取，并符合美国组织银行协会（AATB）和美国食品药品监督管理局（FDA）的法规要求。随组织提供的捐赠者信息包括年龄和性别、病史以及血清学检测结果，均由认证的医疗主管审核并批准。收到组织后，所有样本均进行了入库检验，包括核实捐赠者筛查、血清学检测以及相关病原体检测；仅符合预设接受标准的组织被用于本研究。所有涉及人类样本的操作均遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。由于本研究未直接招募或涉及人类受试者，因此未单独发放机构审查委员会（IRB）批准编号。

1. 准备溶液（第1天）

  1. 在磁力搅拌下，将 10 g 氢氧化钠（NaOH）溶解于 1 L 蒸馏水中，配制 0.25 N 的氢氧化钠（NaOH）溶液。
  2. 在磁力搅拌下，将 40 g 脱氧胆酸钠（SDC）溶解于 1 L 蒸馏水中，配制 4% 的脱氧胆酸钠（SDC）溶液。
  3. 将每种配制好的溶液转移至无菌玻璃瓶中。
    注意：应在化学通风橱内操作脱氧胆酸钠（SDC）。穿戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和护目用具，以防止吸入和皮肤接触。

2. 准备用于脱细胞的外周神经节段

  1. 对包装好的原始外周神经外表面进行消毒，并在无菌条件下打开包装。
  2. 用无菌蒸馏水对外周神经冲洗数次。
  3. 使用无菌剪刀和镊子去除残留的脂肪组织、结缔组织、不必要的分支以及受损的神经组织，并再次用无菌蒸馏水冲洗外周神经。
  4. 将外周神经切成长度为 2–5 cm 的节段。将制备好的节段按长度分为三组：2–3 cm、>3–4 cm 和 >4–5 cm。
    注意：需分别处理每一长度组，因为不同长度的神经节段所采用的 IPA、NaOH 和 SDC 处理时间不同，具体如表 1所示。

3. 建立蠕动泵系统

  1. 将足够长度的耐化学腐蚀硅胶管连接到色谱柱的两端。
  2. 将管的一端连接至蠕动泵。
  3. 使用泵管将管的自由端连接至含有异丙醇（IPA）的 1 L 玻璃瓶，建立一个闭环循环系统。
    注意：务必牢固固定所有管路连接，因为蠕动泵产生的压力和振动可能导致管路从色谱柱或瓶子上脱落。

4. 去除外周神经的脂质

注意：除非另有说明，所有溶液更换步骤均需在室温（20–25 °C）下进行，使用蠕动泵，流速根据管路配置设定为 90–186 mL/min。每次处理过程中应保持所选流速恒定。

  1. 打开层析柱的一端，并用异丙醇（IPA）溶液部分填充层析柱，以确保神经组织插入后能立即浸没于溶液中。
  2. 使用无菌镊子轻轻夹住单个已制备的外周神经节段一端的外层组织，避免直接压迫或夹持神经主干。小心将神经节段放入层析柱内的溶液中。
  3. 用镊子轻轻将神经节段拉直，并使其沿纵向平行于液体流动方向放置。确保神经节段未发生折叠、卷曲，或紧贴层析柱内壁或出口滤膜。
  4. 关闭层析柱，并将其出口端略微抬高，使整体呈轻微上倾状态，出口略高于入口。此方向有助于防止神经节段沉降并贴附于任一端的滤膜，尤其是出口端滤膜。
    注意：每次操作每根层析柱仅处理一个外周神经节段。无需额外的物理固定装置。神经组织的自然浮力和相对温和的液体流速有助于维持其悬浮和伸展状态。在处理过程中应检查组织位置，若发现其粘附于柱壁、滤膜或自身，需用无菌镊子轻轻调整位置。
  5. 将异丙醇（IPA）溶液连接至蠕动泵系统。对长度为 2–3 cm 的神经节段，持续通过层析柱进行溶液交换 1.5 小时；对长度为 >3–4 cm 的节段，交换 2 小时；对长度为 >4–5 cm 的节段，交换 2.5 小时。
  6. 将层析柱中的溶液排空。
  7. 向层析柱中加入 40 mL 无菌蒸馏水。轻轻倒置或振荡层析柱 5 次，以清洗外周神经。
  8. 重复步骤 4.6 和 4.7，共完成 5 次清洗。
  9. 将装有 5 L 无菌蒸馏水的储液瓶连接至蠕动泵系统，持续通过层析柱进行过夜溶液交换。
    暂停点：完成过夜清洗后，可暂停操作。关闭蠕动泵，将外周神经完全浸没于无菌蒸馏水中，并在 4 °C 下保存最多 24 小时，之后再进行步骤 5.1。
    注意：应尽量减少层析柱内的气泡，以促进溶液高效交换。根据需要调整外周神经节段位置，使其保持悬浮于溶液中，防止其粘附于柱体内壁或滤膜。

5. 进行第一次脱细胞处理（第 2 天）

  1. 将0.25 N NaOH溶液连接至蠕动泵系统。对于长度为2–3 cm的神经节段，通过柱体持续置换溶液6小时；对于长度为>3–4 cm的节段，置换8小时；对于长度为>4–5 cm的节段，置换10小时。
  2. 从柱体中排出溶液。
  3. 按照步骤4.6–4.8所述方法洗涤外周神经。
  4. 将含有5 L无菌蒸馏水的储液瓶连接至蠕动泵系统。通过柱体持续置换溶液过夜。
    暂停节点：完成过夜洗涤后，可暂停操作。关闭蠕动泵，将外周神经完全浸没于无菌蒸馏水中，在4 °C下保存最多24小时，之后再进行步骤6.1。

6. 进行第二次脱细胞处理（第3天）

  1. 将4% (w/v) SDC溶液连接至蠕动泵系统。对于长度为2–3 cm的神经节段，通过柱子持续置换溶液6小时；对于长度为>3–4 cm的节段，置换8小时；对于长度为>4–5 cm的节段，置换10小时。
  2. 从柱子中排净溶液。
  3. 按照步骤4.6–4.8所述方法清洗外周神经。
  4. 将一个装有5 L无菌蒸馏水的储液器连接至蠕动泵系统。通过柱子持续置换溶液过夜。
    暂停点：完成过夜清洗后，可暂停实验流程。关闭蠕动泵，将外周神经完全浸没于无菌蒸馏水中，在4 °C下最多可保存24小时，之后再进行步骤7.1。

7. 对脱细胞外周神经进行灭菌处理（第4天）

  1. 从层析柱中移除少量蒸馏水。在保持脱细胞外周神经悬浮于剩余液体中的同时，小心取出该神经组织。
  2. 将外周神经与无菌蒸馏水一同包装。
  3. 采用伽马辐照（剂量为 25 kGy）对包装后的外周神经进行灭菌。
    注意：切勿将层析柱中的蒸馏水完全排干。应保持神经节段悬浮于足够体积的剩余液体中，以防止其黏附于柱内壁，并便于轻柔操作，同时避免液体溢出。

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结果

脱细胞人外周神经移植物制备流程概述如下 图 1工作流程包括修剪原始外周神经、使用 IPA 进行脱脂、依次使用 NaOH 和 SDC 进行化学脱细胞处理，随后进行充分洗涤和灭菌。图 1).

用于脱脂、脱细胞及清洗的蠕动泵驱动式溶液交换系统如图所示。 图 2A神经的修剪与分段操作演示如下： 图2B–D在完成该过程后，周围神经保持了其整体形态，未见明显的结构破坏。图 2E).

脱细胞效果的组织学评估如图所示 图 3. 苏木精和伊红 (H&E...

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讨论

本研究提出了一种标准化的碱辅助脱细胞方法，用于制备脱细胞人外周神经移植物，以促进外周神经再生。该方法将供体神经预处理、可控化学脱细胞以及蠕动泵驱动的溶液交换系统整合为明确的实验流程，可在有效去除细胞成分和免疫原性成分的同时，保持天然细胞外基质（ECM）的结构完整性。

该方法的一个关键特征是将碱处理与减少的去污剂暴露相结合。传统的基于去污剂的方案，如 Sondell 法（3% Triton X-100 和 4% SDC）和 Hudson 法（sulfobetaine-10、sulfobetaine-16 和 Triton X-200），依赖长时间、多步骤的去污剂处理以实现有效的脱细胞化9,10尽管这些方法能有效去除细胞成分，但长时间的去垢剂暴露可能破坏细胞外基质（ECM）的完整性，并导致与残留去垢剂相关的细胞毒性19,20,

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由韩国产业通商资源部（MOTIE）资助的韩国产业技术振兴院（KIAT）项目（编号P0011947，韩国-捷克双边联合资助研发项目）提供支持。&D 项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BT100-1L 多通道蠕动泵较长型泵BT100-1L用于脱脂、脱细胞及洗涤过程中提供持续循环和溶液更换。
Econo-Column 层析柱，2.5 × 10 cmBio-Rad737-2512用于在持续溶液更换过程中固定外周神经节段。
异丙醇（IPA）Daejeong Chemicals5035-4410用于外周神经组织的脱脂处理。
Masterflex Tygon E-LFL 泵管Thermo Scientific06440-16用于连接蠕动泵、层析柱和溶液储液瓶，实现溶液的持续循环。
脱氧胆酸钠（SDC）Sigma-Aldrich30970-100G作为第二步脱细胞过程中的去垢剂，用于去除残留的细胞成分。
氢氧化钠，NaOHDuksan1636用于细胞裂解。

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