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使用氢氧化钠和脱氧胆酸钠制备去细胞人外周神经移植物

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DOI：

10.3791/71578

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2026年9月1日

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种标准化的碱辅助脱细胞方法，该方法结合氢氧化钠处理与蠕动泵驱动的溶液置换系统，以制备脱细胞化的人外周神经移植物，可有效去除细胞成分并保留天然的细胞外基质结构。

摘要

周围神经损伤通常需要移植物材料为轴突再生提供结构引导。尽管自体神经移植仍是临床金标准，但其应用受限于供区并发症和可用组织有限。这些局限性促使人们日益关注去细胞化人周围神经移植物作为神经再生的替代生物材料。然而，常用的基于去污剂的去细胞化方案可能会破坏细胞外基质（ECM）结构，并残留具有细胞毒性的物质，从而影响移植物质量。本文介绍了一种标准化的制备去细胞化人周围神经移植物的方案，采用碱辅助去细胞化方法。该方法首先使用氢氧化钠（NaOH）处理以有效破坏细胞成分，随后采用温和的脱氧胆酸钠（SDC）步骤，去除残留的细胞和免疫原性成分，同时保留天然的ECM结构。该策略减少了去污剂暴露，有助于维持天然ECM架构。操作流程包括供体神经准备、可控的NaOH处理、后续温和的SDC处理，以及在蠕动泵驱动系统中通过持续溶液交换进行充分洗涤，以促进去除残留加工试剂。进一步的后处理步骤用于维持结构完整性，并为移植物的最终包装和灭菌做好准备。通过组织学分析和残留DNA定量评估去细胞化效率，利用扫描电子显微镜检测ECM结构的保留情况。通过细胞毒性测试确认了处理后移植物中无残留SDC及其生物相容性。该方案为开展周围神经再生研究及转化应用提供了实用的去细胞化人周围神经移植物制备方法。

引言

周围神经损伤可导致严重的功能障碍，在再生医学和重建外科领域仍是重大的临床挑战。节段性神经缺损的再生需要移植物材料，这些材料不仅要能够桥接损伤间隙，还需提供结构引导和生化信号，以支持轴突再生和神经再支配。自体神经移植被广泛认为是临床金标准，因其能够保留天然的细胞外基质（ECM）结构，并为神经再生提供有利的微环境1,2。然而，其临床应用受限于供体组织来源有限、需要额外手术操作以及供区并发症等问题3,4。这些局限性推动了替代性移植物材料的开发，特别是去细胞化周围神经移植物，这类材料在最大限度减少免疫原性细胞成分的同时，保留了天然的ECM结构5,6,7,8。

脱细胞神经移植物的性能在很大程度上取决于脱细胞过程。传统方法通常依赖基于去垢剂的试剂，如 Triton X-100 和脱氧胆酸钠（SDC），这些试剂通过溶解脂质膜来去除细胞成分9,10,11。然而，长时间暴露于这些去垢剂可能破坏细胞外基质（ECM）的微观结构，并残留具有细胞毒性的物质，从而对细胞活力和再生效果产生不利影响12,13。因此，目前正积极研究能够在有效去除细胞的同时保持 ECM 完整性的替代脱细胞策略14。使用氢氧化钠（NaOH）进行碱性脱细胞已成为一种潜在的替代方法，因为极端 pH 条件可高效降解细胞成分、核酸和脂质15,16,17。然而，强碱性条件的非受控暴露可能损害 ECM 的完整性，凸显了精确控制处理条件的重要性16,18。

本文介绍了一种标准化的碱辅助去细胞化方法，用于人外周神经移植物的制备，并结合了由蠕动泵驱动的连续溶液交换系统。与传统的静态浸泡方法相比，该动态过程能够实现持续的溶液更换，有助于清除细胞碎片及残留的处理试剂。文章通过可视化方式逐步展示了完整的操作流程，包括供体神经的准备、可控的碱辅助去细胞化处理，以及利用蠕动泵驱动系统进行的连续溶液交换。所得移植物通过组织学分析、残留DNA定量和扫描电子显微镜（SEM）进行评估，以确认去细胞化的高效性及细胞外基质（ECM）超微结构的保留。通过对关键技术步骤的清晰展示，本文为去细胞神经移植物的制备以及后续工艺的放大提供了明确的操作框架。

方案

捐赠的人类外周神经来自美国组织库，在L&C BIO的独家协议下获取，并符合美国组织银行协会（AATB）和美国食品药品监督管理局（FDA）的法规要求。随组织提供的捐赠者信息包括年龄和性别、病史以及血清学检测结果，均由认证的医疗主管审核并批准。收到组织后，所有样本均进行了入库检验，包括核实捐赠者筛查、血清学检测以及相关病原体检测；仅符合预设接受标准的组织被用于本研究。所有涉及人类样本的操作均遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。由于本研究未直接招募或涉及人类受试者，因此未单独发放机构审查委员会（IRB）批准编号。

1. 准备溶液（第1天）

  1. 在磁力搅拌下，将 10 g 氢氧化钠（NaOH）溶解于 1 L 蒸馏水中，配制 0.25 N 的氢氧化钠（NaOH）溶液。
  2. 在磁力搅拌下，将 40 g 脱氧胆酸钠（SDC）溶解于 1 L 蒸馏水中，配制 4% 的脱氧胆酸钠（SDC）溶液。
  3. 将每种配制好的溶液转移至无菌玻璃瓶中。
    注意：应在化学通风橱内操作脱氧胆酸钠（SDC）。穿戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和护目用具，以防止吸入和皮肤接触。

2. 准备用于脱细胞的外周神经节段

  1. 对包装好的原始外周神经外表面进行消毒，并在无菌条件下打开包装。
  2. 用无菌蒸馏水对外周神经冲洗数次。
  3. 使用无菌剪刀和镊子去除残留的脂肪组织、结缔组织、不必要的分支以及受损的神经组织，并再次用无菌蒸馏水冲洗外周神经。
  4. 将外周神经切成长度为 2–5 cm 的节段。将制备好的节段按长度分为三组：2–3 cm、>3–4 cm 和 >4–5 cm。
    注意：需分别处理每一长度组，因为不同长度的神经节段所采用的 IPA、NaOH 和 SDC 处理时间不同，具体如表 1所示。

3. 建立蠕动泵系统

  1. 将足够长度的耐化学腐蚀硅胶管连接到色谱柱的两端。
  2. 将管的一端连接至蠕动泵。
  3. 使用泵管将管的自由端连接至含有异丙醇（IPA）的 1 L 玻璃瓶，建立一个闭环循环系统。
    注意：务必牢固固定所有管路连接，因为蠕动泵产生的压力和振动可能导致管路从色谱柱或瓶子上脱落。

4. 去除外周神经的脂质

注意：除非另有说明，所有溶液更换步骤均需在室温（20–25 °C）下进行，使用蠕动泵，流速根据管路配置设定为 90–186 mL/min。每次处理过程中应保持所选流速恒定。

  1. 打开层析柱的一端，并用异丙醇（IPA）溶液部分填充层析柱，以确保神经组织插入后能立即浸没于溶液中。
  2. 使用无菌镊子轻轻夹住单个已制备的外周神经节段一端的外层组织，避免直接压迫或夹持神经主干。小心将神经节段放入层析柱内的溶液中。
  3. 用镊子轻轻将神经节段拉直，并使其沿纵向平行于液体流动方向放置。确保神经节段未发生折叠、卷曲，或紧贴层析柱内壁或出口滤膜。
  4. 关闭层析柱，并将其出口端略微抬高，使整体呈轻微上倾状态，出口略高于入口。此方向有助于防止神经节段沉降并贴附于任一端的滤膜，尤其是出口端滤膜。
    注意：每次操作每根层析柱仅处理一个外周神经节段。无需额外的物理固定装置。神经组织的自然浮力和相对温和的液体流速有助于维持其悬浮和伸展状态。在处理过程中应检查组织位置，若发现其粘附于柱壁、滤膜或自身，需用无菌镊子轻轻调整位置。
  5. 将异丙醇（IPA）溶液连接至蠕动泵系统。对长度为 2–3 cm 的神经节段，持续通过层析柱进行溶液交换 1.5 小时；对长度为 >3–4 cm 的节段，交换 2 小时；对长度为 >4–5 cm 的节段，交换 2.5 小时。
  6. 将层析柱中的溶液排空。
  7. 向层析柱中加入 40 mL 无菌蒸馏水。轻轻倒置或振荡层析柱 5 次，以清洗外周神经。
  8. 重复步骤 4.6 和 4.7，共完成 5 次清洗。
  9. 将装有 5 L 无菌蒸馏水的储液瓶连接至蠕动泵系统，持续通过层析柱进行过夜溶液交换。
    暂停点：完成过夜清洗后，可暂停操作。关闭蠕动泵，将外周神经完全浸没于无菌蒸馏水中，并在 4 °C 下保存最多 24 小时，之后再进行步骤 5.1。
    注意：应尽量减少层析柱内的气泡，以促进溶液高效交换。根据需要调整外周神经节段位置，使其保持悬浮于溶液中，防止其粘附于柱体内壁或滤膜。

5. 进行第一次脱细胞处理（第 2 天）

  1. 将0.25 N NaOH溶液连接至蠕动泵系统。对于长度为2–3 cm的神经节段，通过柱体持续置换溶液6小时；对于长度为>3–4 cm的节段，置换8小时；对于长度为>4–5 cm的节段，置换10小时。
  2. 从柱体中排出溶液。
  3. 按照步骤4.6–4.8所述方法洗涤外周神经。
  4. 将含有5 L无菌蒸馏水的储液瓶连接至蠕动泵系统。通过柱体持续置换溶液过夜。
    暂停节点：完成过夜洗涤后，可暂停操作。关闭蠕动泵，将外周神经完全浸没于无菌蒸馏水中，在4 °C下保存最多24小时，之后再进行步骤6.1。

6. 进行第二次脱细胞处理（第3天）

  1. 将4% (w/v) SDC溶液连接至蠕动泵系统。对于长度为2–3 cm的神经节段，通过柱子持续置换溶液6小时；对于长度为>3–4 cm的节段，置换8小时；对于长度为>4–5 cm的节段，置换10小时。
  2. 从柱子中排净溶液。
  3. 按照步骤4.6–4.8所述方法清洗外周神经。
  4. 将一个装有5 L无菌蒸馏水的储液器连接至蠕动泵系统。通过柱子持续置换溶液过夜。
    暂停点：完成过夜清洗后，可暂停实验流程。关闭蠕动泵，将外周神经完全浸没于无菌蒸馏水中，在4 °C下最多可保存24小时，之后再进行步骤7.1。

7. 对脱细胞外周神经进行灭菌处理（第4天）

  1. 从层析柱中移除少量蒸馏水。在保持脱细胞外周神经悬浮于剩余液体中的同时，小心取出该神经组织。
  2. 将外周神经与无菌蒸馏水一同包装。
  3. 采用伽马辐照（剂量为 25 kGy）对包装后的外周神经进行灭菌。
    注意：切勿将层析柱中的蒸馏水完全排干。应保持神经节段悬浮于足够体积的剩余液体中，以防止其黏附于柱内壁，并便于轻柔操作，同时避免液体溢出。

结果

脱细胞人外周神经移植物制备流程概述如下 图 1工作流程包括修剪原始外周神经、使用 IPA 进行脱脂、依次使用 NaOH 和 SDC 进行化学脱细胞处理，随后进行充分洗涤和灭菌。图 1).

用于脱脂、脱细胞及清洗的蠕动泵驱动式溶液交换系统如图所示。 图 2A神经的修剪与分段操作演示如下： 图2B–D在完成该过程后，周围神经保持了其整体形态，未见明显的结构破坏。图 2E).

脱细胞效果的组织学评估如图所示 图 3. 苏木精和伊红 (H&E) 对天然外周神经的染色显示存在丰富的细胞核，而在脱细胞样本中细胞核基本消失。图 3A）。残留DNA的定量分析（以ng DNA/mg干组织表示）显示，脱细胞处理后DNA含量显著降低。图 3B).

利用扫描电子显微镜（SEM）进行超微结构分析的方法如下： 图 4脱细胞处理后，细胞外基质（ECM）的纤维结构依然清晰可见，表明其天然ECM结构得以保留。图 4).

残留洗涤剂评估与细胞相容性检测结果如下 图 5洗涤步骤后，残留的SDC水平极低。图 5A)。细胞毒性测试显示，暴露于脱细胞周围神经移植物中的培养细胞未出现显著的细胞毒性反应。图 5B).

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图 1脱细胞人外周神经移植物制备流程示意图。 捐赠的人类周围神经节段首先通过修剪和分段处理，去除周围的结缔组织。随后，神经节段在蠕动泵驱动的系统中，于第1天使用异丙醇（IPA）基溶液进行连续交换以完成脱脂处理。在第2天和第3天，分别使用氢氧化钠（NaOH）和脱氧胆酸钠（SDC）在连续溶液交换条件下进行序贯脱细胞处理。处理后的移植物随后在第4天进行包装和灭菌，最终获得脱细胞周围神经移植物。缩写：IPA = 异丙醇；NaOH = 氢氧化钠；SDC = 脱氧胆酸钠。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 2周围神经处理工作流程的代表性图像。 (A蠕动泵驱动的溶液交换系统，用于脱脂、脱细胞及洗涤。B) 修剪前的人体捐赠外周神经。C) 修剪过程中的外周神经。D) 修剪并分段后的外周神经。E) 完成整个脱细胞过程后的外周神经。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 3脱细胞效率评估。 (A) 代表性苏木精和伊红 (H&经伊红（E）染色的天然与脱细胞人外周神经组织图像，显示脱细胞处理后细胞成分减少。比例尺 = 100 µm.B) 天然与脱细胞神经组织中残留DNA含量的定量分析，以ng DNA/mg干组织表示。数据以平均值呈现。 ± SDn = 3). *p < 0.05. 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 4神经微结构的扫描电子显微镜 (SEM) 分析。 左侧为天然人外周神经组织，右侧为脱细胞后人外周神经组织的代表性扫描电镜图像，显示脱细胞处理后细胞外基质结构得以保留。比例尺 = 2 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 5残留洗涤剂与细胞毒性评估。 (A) 用于评估残留洗涤剂的十二烷基硫酸钠标准品色谱图（左）与脱细胞神经移植物提取物色谱图（右）。红色方框标示了对应于十二烷基硫酸钠保留时间（约3.2分钟）的区域。B) 依据 ISO 10993-5 标准，使用 L929 成纤维细胞对脱细胞神经移植物提取物进行细胞毒性评估。孵育 48 小时后的代表性图像显示了试剂对照组、脱细胞神经移植物提取物组、阴性对照组和阳性对照组。比例尺 = 50。 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。

神经节段长度（cm）IPA处理（小时）NaOH处理（小时）SDC处理（小时）
2–31.566
>3–4288
>4–52.51010

表1：本研究评估范围内不同长度外周神经节段的处理时长。

讨论

本研究提出了一种标准化的碱辅助脱细胞方法，用于制备脱细胞人外周神经移植物，以促进外周神经再生。该方法将供体神经预处理、可控化学脱细胞以及蠕动泵驱动的溶液交换系统整合为明确的实验流程，可在有效去除细胞成分和免疫原性成分的同时，保持天然细胞外基质（ECM）的结构完整性。

该方法的一个关键特征是将碱处理与减少的去污剂暴露相结合。传统的基于去污剂的方案，如 Sondell 法（3% Triton X-100 和 4% SDC）和 Hudson 法（sulfobetaine-10、sulfobetaine-16 和 Triton X-200），依赖长时间、多步骤的去污剂处理以实现有效的脱细胞化9,10尽管这些方法能有效去除细胞成分，但长时间的去垢剂暴露可能破坏细胞外基质（ECM）的完整性，并导致与残留去垢剂相关的细胞毒性19,20,21相比之下，本方案采用 NaOH 以增强细胞去除效果，同时限制 SDC 的暴露，从而降低整体去污剂负担，并有助于维持天然 ECM 结构的完整性。

本方案的另一个关键方面是采用蠕动泵驱动的溶液交换系统。与可能对组织施加内部压力并导致结构破坏的灌注式方法不同21，该系统可在色谱柱内实现连续且可控的溶液交换。多种分析结果均证实了该方法的有效性。组织学分析及残留DNA定量结果表明细胞成分被高效去除，而扫描电镜（SEM）分析则显示天然细胞外基质（ECM）结构得以保留。此外，较低的残留十二烷基硫酸钠（SDC）水平以及良好的细胞相容性结果进一步支持所获得移植物具有良好的生物相容性。综合来看，这些结果表明该方案在有效脱细胞与结构完整性保持之间实现了良好平衡。

若干技术步骤对于减少操作变异性并维持受控的处理条件至关重要。首先，在修剪、转移和洗涤过程中对神经节段的精细操作十分关键。外周神经组织力学性能脆弱，过度压迫、折叠或牵拉可能破坏其内部结构，影响细胞外基质（ECM）的保存19,20。因此，整个操作过程中应始终保持组织湿润，并轻柔处理。其次，柱内溶液的均匀交换是决定工艺性能的关键因素。应尽量减少柱内气泡的产生，且组织需始终完全浸没并悬浮于溶液中，避免贴附于柱壁或滤膜上。组织贴附可能导致溶液交换不均，降低洗涤效率，并造成处理试剂暴露不一致21,22。第三，蠕动泵驱动系统必须在整个操作过程中稳定运行。脱脂、脱细胞及洗涤过程均需持续循环，因此所有管路连接必须牢固固定，以防因泵产生的压力或振动导致连接脱落。在样本回收过程中，应避免柱体完全排空。保持足够的液体体积有助于防止组织贴附，并便于收集时的轻柔操作。

长度为2–3 cm的神经节段分别使用IPA、NaOH和SDC处理1.5、6和6小时；长度为>3–4 cm的节段分别处理2、8和8小时；而长度为>4–5 cm的节段则分别处理2.5、10和10小时。因此，IPA脱脂步骤的处理时间范围为1.5至2.5小时，每个脱细胞步骤的处理时间为6至10小时。所有其他处理参数，包括试剂浓度、溶液体积和洗涤程序，在不同长度组间均保持一致。根据管路配置，流速设定在指定范围内，并在整个处理过程中保持恒定。特定长度的处理条件总结于表1中。基于神经直径、厚度、束状结构或细胞与基质组成的调整尚未进行系统性评估，仍需进一步研究23,24。对于放大应用，可采用多通道蠕动泵系统以提高处理通量；然而，应仔细验证各通道间流体条件的一致性，以确保处理的均一性。

仍有一些因素需要考虑以进一步优化。尽管本方案显著减少了总体去污剂的暴露，但仍包含SDC，未来改进的方向可能是尽量减少或替代去污剂的使用，同时保持脱细胞效率和细胞外基质（ECM）的保存25,26。此外，由于神经束结构、直径、厚度以及细胞和基质成分的差异，外周神经组织本身难以标准化23,24。在大规模生产过程中，这些差异以及组织载量和流体条件的变化可能导致批次间的变异性。然而，本研究并未系统评估供体间和批次间的可重复性。因此，有必要利用来自多个供体的组织以及独立的生产批次进行进一步验证，以建立适当的组织接受标准，实现工艺标准化，并确保批次间的可重复性。

另一个局限性涉及移植物长度。再生能力随着移植物长度的增加而下降，这种长度依赖性的限制在去细胞神经异体移植物中可能比自体移植物更为显著3,27。由于去细胞神经异体移植物缺乏存活的施万细胞，其轴突再生依赖于宿主施万细胞的迁移和增殖27。Saheb-Al-Zamani 等人报道，在较长的去细胞神经异体移植物中再生能力受限，与施万细胞衰老增加相关27。

然而，先前的一项体内研究表明，在15 mm兔坐骨神经缺损模型中，采用NaOH脱细胞处理的人神经移植物可支持与自体移植相当的功能和结构恢复28。Contreras等人也在绵羊70 mm腓神经缺损模型中证实了脱细胞神经同种异体移植物可促进轴突再生和功能恢复29。这些研究支持脱细胞神经移植物具有促进再生的潜力，但仍需进一步评估采用本方案制备的移植物在临床相关移植物长度下的效果。此外，自体移植受限于供体神经的可获得性，且需要额外的取材手术，导致出现第二个手术部位及供区并发症4。因此，当自体组织不足或难以获取供体神经时，无细胞神经同种异体移植物可能提供一种具有临床应用价值的替代方案。

综上所述，本方案为制备去细胞外周神经移植物提供了一个实用且可调节的框架。该方案强调减少去污剂暴露、控制溶液更换以及流程标准化，可支持外周神经再生领域的研究应用及潜在的转化应用。未来的研究应集中于进一步开发无去污剂的方法、系统的可扩展性，以及对再生性能进行系统的体内评估。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由韩国产业通商资源部（MOTIE）资助的韩国产业技术振兴院（KIAT）项目（编号P0011947，韩国-捷克双边联合资助研发项目）提供支持。&D 项目。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BT100-1L 多通道蠕动泵较长型泵BT100-1L用于脱脂、脱细胞及洗涤过程中提供持续循环和溶液更换。
Econo-Column 层析柱，2.5 × 10 cmBio-Rad737-2512用于在持续溶液更换过程中固定外周神经节段。
异丙醇（IPA）Daejeong Chemicals5035-4410用于外周神经组织的脱脂处理。
Masterflex Tygon E-LFL 泵管Thermo Scientific06440-16用于连接蠕动泵、层析柱和溶液储液瓶，实现溶液的持续循环。
脱氧胆酸钠（SDC）Sigma-Aldrich30970-100G作为第二步脱细胞过程中的去垢剂，用于去除残留的细胞成分。
氢氧化钠，NaOHDuksan1636用于细胞裂解。

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