本研究介绍了基于化学遗传学和紫光的策略，以实现可靠的白天昼夜节律相位移动。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在哺乳动物中，由于视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）在白天对光刺激的反应性降低，导致昼夜节律的相位偏移受到限制，从而制约了在此阶段对昼夜节律钟进行实验性调控的能力。因此，建立可靠的诱导白天相位偏移的方法对于研究昼夜节律可塑性及光同步机制至关重要。本文介绍了互补的遗传学与光谱学策略，可用于在白天实现稳健且时间精确的昼夜节律钟调控。第一种方法目前仅限于小鼠，采用化学遗传学策略，通过玻璃体内递送仅由设计药物激活的设计受体（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs, DREADDs），选择性激活内在光敏性视网膜神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cells, ipRGCs）。该方法可实现对视网膜下丘脑通路的可控激活，并在不受环境光照条件影响的情况下诱导可重复的白天相位偏移。第二种方法采用波长特异性光学刺激，作为一种非侵入性替代方案。暴露于紫光可利用ipRGCs的光谱敏感性，减轻去极化阻滞并促进持续性激活，从而在主观白天实现可靠的节律重置。该方法广泛适用于各类哺乳动物系统，无需进行遗传操作或药物干预。本文提供了详细的实验准备、刺激时机、通过运动活动验证相位偏移以及通过c-Fos免疫组织化学评估神经元激活的实验方案。同时列出了关键实验考虑因素，包括昼夜节律时间点、刺激参数和实验对照，以提高实验可重复性。综上，这些方法为诱导白天昼夜节律相位偏移提供了灵活且易于实施的工具，有助于直接探究白天昼夜节律响应机制的基础原理。
引言
视交叉上核（SCN）是哺乳动物大脑的主要昼夜节律起搏器，负责协调生理和行为方面重要的日常节律，包括睡眠-觉醒周期和摄食模式。为了与外部环境保持同步，SCN 接收来自内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs）的直接光信号输入，这些细胞将视网膜的光信息传递至 SCN，从而将内部昼夜节律与太阳日同步1,2。
生物体昼夜节律系统的一个显著特征是其相位依赖性的响应性：在不同的昼夜节律时间施加相同的刺激，可能产生显著不同的效应。在哺乳动物中，夜间光照能够可靠地诱导视交叉上核（SCN）生物钟的相位移动，而在主观白天期间的光照暴露则几乎不会引起或仅引起微弱的重置效应3,4。这种白天不敏感的现象在体内（in vivo）和体外（in vitro） 实验体系中均被持续观察到，其中模拟光信号输入的尝试均未能引发显著的相位移动5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。
白天对光不敏感的现象至少部分归因于视网膜驱动不足，无法有效激活相位重置机制，同时下丘脑视交叉上核（SCN）内部存在昼夜节律门控机制。与此观点一致的是，在明视觉条件下，内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs）的反应并不均一；其中一部分细胞进入去极化阻滞状态，限制了动作电位的持续发放17,18,19。这种生理限制可能降低了传统光刺激在白天的有效性。克服这一限制将有助于直接探究白天生物钟的可塑性，而这一时段传统上被认为对光诱导的相位重置具有抵抗性。
本文描述了两种互补的方法，可在主观白天期间实现生物钟的稳定相位移动。第一种方法采用化学遗传学策略，在不依赖环境光照条件的情况下选择性激活内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs）。具体而言，Opn4Cre/+小鼠通过玻璃体内注射的方式接受腺相关病毒（AAV）注射，该病毒以Cre依赖的方式编码兴奋性设计受体hM3Dq（Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs, DREADD）。在昼夜节律时间4（CT4）给予氯氮平-N-氧化物（CNO），可诱导ipRGCs产生类似爆发式的放电，从而持续激活视网膜下丘脑通路19。通过记录自主运动活动来量化相位移动，同时利用c-Fos免疫组织化学方法评估视交叉上核（SCN）内的分子激活状态。
第二种方法采用波长特异性的光学刺激，作为一种非侵入性策略，具有更广泛的应用性。将野生型小鼠在昼夜节律时间6（CT6）即主观白天的中期暴露于紫光（385 nm）下。与蓝光或白光相比，紫光引起的去极化阻滞较轻，并能支持持续的内在光敏视网膜神经节细胞（ipRGC）激活19。相位偏移的量化方法如上所述。
这两种方法均旨在增强ipRGC驱动的向SCN的信号传递，从而克服主观日间光反应性降低的特征。这些方法共同提供了强大且易于实验操作的策略，可用于在传统上对光重置具有抵抗性的时相中调控昼夜节律钟。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均经国家精神卫生研究所（NIMH）动物护理与使用委员会（ASP-SLCR-01）批准，并遵循其指南进行。所有努力均旨在尽量减少动物疼痛并减少使用动物数量。所用研究工具列于材料表中。
1. 化学遗传学策略
- 在 Opn4Cre/+ 小鼠中进行玻璃体内注射腺相关病毒
- 使用适当的灭菌程序清洁并灭菌立体定位仪台和所有手术器械。设置注射装置，并连接玻璃毛细管注射针。
- 使用异氟烷麻醉小鼠。将氧气流速设定为约 1.5 L/min。诱导麻醉时异氟烷浓度调整为 3%–5%，术中维持麻醉时降低至 1–3%。
- 通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度。当未观察到回缩或抽动反射时，视为动物已充分麻醉。
- 将小鼠置于加热垫上，以在整个操作过程中维持其体温。
- 拉制玻璃毛细管针。在体视显微镜下使用细头记号笔在距针尖 2.0 mm 处做标记，以确保每次穿刺深度一致。
- 使用钝头镊子轻轻按压下眼睑，使眼球轻微突出并暴露上方角膜缘。采用上方入路，将针头与眼球表面呈切线方向插入，于角膜缘后方 0.5–1 mm 处穿透巩膜，同时避开血管化区域。
注意：小鼠玻璃体内注射过程中不使用眼科软膏，因其可能污染或堵塞注射针头，意外进入玻璃体腔导致组织损伤，并增加眼内感染或炎症的风险。 - 将针头插入玻璃体腔至预定深度。稍作回撤以释放眼内压，防止组织堵塞针尖。
- 注射总体积为 1.5 µL 的 AAV 溶液（浓度为 2.4 × 1013 GC/mL），分五次连续注射，每次 300 nL（注射速率为 50 nL/s）。每次注射之间暂停 10 s，以利于扩散并减少反流。最后一次注射后，等待 30 s 再缓慢拔出针头。对对侧眼重复相同操作，使用相同参数，并注意尽量减少创伤和反流。
- 手术后立即皮下注射酮洛芬（10 mg/kg）。
- 让小鼠恢复至少 2 周，以确保病毒充分表达，然后再转移至行为学实验设施。
- 转轮活动记录与 CNO 给药（图 1A）
- 将小鼠单独饲养于配备转轮的笼具中。使用自动化数据采集系统记录转轮活动。
- 使小鼠适应 12:12 小时明暗循环 4–7 天。确认节律稳定同步后，将动物转入恒定黑暗环境（DD）。
- 使用分析软件确定活动起始时间。在夜行性啮齿类动物中，将活动起始定义为 CT12，并据此计算 CT4 时间点。
- 在 DD 条件下的第 8 天，在微弱红光下于 CT4 时间点对小鼠进行腹腔注射 CNO（1 mg/kg）或生理盐水。
- 将动物放回原笼，并保持在恒定黑暗条件下。连续记录 8 天的运动活动。
- 确定活动起始时间，并对注射前后时间段进行回归分析。相位偏移量通过预期活动起始时间与实际观察到的活动起始时间之差计算得出。
- 化学遗传学激活后 SCN 区域 c-Fos 免疫组织化学检测
- 使小鼠适应 12:12 小时明暗循环后转入恒定黑暗环境。在 DD 的第二天于 CT6 时间点给予 CNO，注射后 30 分钟进行灌注固定。
注：行为学实验中选择 CT4 是为了尽量避免 CNO 的效应延续至主观夜晚，因为 CNO 可维持数小时活性；而免疫染色实验中选择 CT6 是为了评估 CNO 对生物钟的急性作用，并在注射后 30 分钟进行灌注。 - 取出脑组织，在 4 °C 条件下用 4% 多聚甲醛后固定过夜。用 30% 蔗糖进行冷冻保护直至组织沉底。冠状切片厚度为 40 µm。
- 将切片在封闭液中孵育，随后在 4 °C 下与一抗孵育过夜。洗涤后与二抗在室温下孵育 1 小时。用 DAPI 复染，封片。
- 使用一致的显微镜参数采集图像。使用分析软件处理图像。通过 mCherry 阳性细胞确定 AAV 感染区域。
- 使小鼠适应 12:12 小时明暗循环后转入恒定黑暗环境。在 DD 的第二天于 CT6 时间点给予 CNO，注射后 30 分钟进行灌注固定。
2. 光谱策略
- 将野生型小鼠转移至行为学实验设施，并如上所述将其单独饲养在配备跑轮的笼子中。将动物维持在持续黑暗（DD）条件下，以监测其自由运行的昼夜节律活动。
- 在持续黑暗条件下的第8天，于昼夜时间6（CT6）时，将笼子从避光柜中取出，并对小鼠施加15分钟的光脉冲刺激。
- 对小鼠施加蓝光脉冲（λmax = 470 nm；1.8 × 1014–2.2 × 1014 光子/cm2/s）或紫光脉冲（λmax = 385 nm；1.45 × 1014–3.3 × 1014 光子/cm2/s），光照强度在笼子中心及四个角落、动物眼睛水平位置进行测量。
- 在两种波长条件下，均将小鼠保留在其原笼中，移除笼盖。将笼子直接置于固定光源下方，使光束中心与笼子中心对齐，以确保光照均匀。
- 光照结束后立即将笼子放回原位，继续处于持续黑暗环境中。持续不间断记录跑轮活动，用于相位偏移分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在CT4时间点注射生理盐水的表达AAV-DREADD的Opn4Cre/+小鼠，其转轮活动未出现显著的相位移动（n = 5；图1B）。相比之下，在CT4时间点给予CNO后，小鼠活动起始时间出现显著的相位延迟（平均值 ± 标准误：5.03 ± 0.48 小时；n = 5；图1C，D），表明在此昼夜节律时间点激活DREADD可改变运动活动节律。实验设计示意图见图2A。在同一小鼠中，与生理盐水对照组相比，注射CNO后30分钟，视交叉上核（SCN）中c-Fos表达增加（图2B vs 图2C，D），提示在主观白天期间SCN神经元被急性激活。
接下来检测了特定波长的光刺激（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
结果表明，在主观白天期间激活内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs）可诱导小鼠产生昼夜节律相位移动，这一时段通常对光刺激的敏感性较低。通过化学遗传学方法可选择性地激活ipRGCs，且不依赖于外界光照，从而在转轮跑动行为中产生显著的相位延迟。该激活还诱导了视交叉上核（SCN）中急性c-Fos表达，证实了中央昼夜节律起搏器被激活。这些发现表明，强烈的由ipRGC驱动的视网膜下丘脑通路刺激足以克服昼夜节律系统在白天反应性降低的状态。
特定波长的光学刺激为实现白天相位重置提供了一种互补且非侵入性的策略。短暂的紫光脉冲可引起显著的相位延迟，而强度和持续时间相当的蓝光脉冲则无此效果。这些结果表明，在主观白天期间，光的光谱特性对调节昼夜节律时相的能力具有关键影响。与化学遗传学操控不同，特定波长的刺激无需病毒表达或药物干预，因而更具可及性，并具有更广泛的应用潜力。
在人体中，白天的光照通常只会引起微小的相位移动，尽管在某些实验条件下，昼夜节律系统可能对明亮的白光或蓝光产生反应20,<...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | 编码兴奋性DREADD（hM3Dq）与mCherry融合蛋白的Cre依赖型病毒载体，用于选择性激活ipRGC |
| 抗c-Fos抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 2250S | 用于检测c-Fos以标记神经元激活的一抗 |
| 抗tdTomato抗体（山羊） | LSBio | LS-C340696 | 用于检测mCherry/tdTomato报告基因表达的一抗 |
| 蓝色LED驱动器 | Thorlabs | LEDD1B | 用于控制蓝色LED强度和输出的电源 |
| 蓝色LED光源 | Thorlabs | M470L5 | 发射蓝光（λmax ≈ 470 nm）的LED光源，用于光刺激 |
| ClockLab软件 | Actimetrics | 版本 6.0.53 | 用于采集和分析昼夜运动活动数据的软件 |
| 氯氮平-N-氧化物（CNO） | Sigma-Aldrich | C0832-5MG | 用于在体内激活hM3Dq DREADD受体的配体 |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | 用于标记细胞核的荧光核染料 |
| 驴抗山羊Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21432 | 用于检测山羊一抗的荧光二抗 |
| 驴抗兔Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 用于检测兔一抗的荧光二抗 |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | 用于保存组织切片中荧光信号的封片介质 |
| ImageJ（Fiji）软件 | NIH | 版本 2.16.0/1.54g | 用于图像处理和定量分析的开源软件 |
| Opn4cre小鼠 | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:035925 | 用于化学遗传学激活实验的小鼠 |
| 紫色LED驱动器 | Mightex | SLA-1000-2 | 用于控制紫色LED输出的电源 |
| 紫色LED光源 | Mightex | BLS-LCS-0385-04-22 | 发射紫光（λmax ≈ 385 nm）的LED光源，用于波长特异性刺激 |
| 野生型小鼠 | The Jackson Laboratory | Jackson品系 #101043 | 用于紫光实验的小鼠 |
参考文献
- Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
- Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
- Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
- Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
- Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
- Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
- Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
- Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
- Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
- Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
- Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
- Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
- Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
- de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
- Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
- Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
- Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
- Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
- Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
- Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
- Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
