用于持续递送神经活性物质的微型输注系统的构建与植入

摘要

随着神经科学研究日益深入，对脑结构和神经回路的探究需要更高的精确度和分辨率。我们开发了一种利用尖端直径为50微米的硼硅酸盐微导管制备和植入脑内慢性输注系统的方法。

摘要

神经活性物质的持续递送在神经科学研究中被广泛应用，但面临诸多技术挑战。在递送过程中，需实现高精度给药，同时尽量减少局部组织损伤和炎症反应。此外，理想情况下应能够根据不同物种和体型的实验动物对递送系统进行定制化调整。本视频展示了适用于任意特定研究动物的灌注系统的构建方法。该递送用微型导管的直径约为目前常用灌注导管的十分之一，从而显著提高给药准确性并降低对目标脑区的创伤。递送导管还可根据动物颅骨表面轮廓进行塑形，使头皮切口能够整齐地闭合于灌注系统之上，无需使用颅骨固定基座，降低感染风险，并提升动物的舒适度。系统组装需在无空气环境中进行，研究人员还需使用热源自行制备玻璃微移液管。这些构建技术需要特殊操作技能，最佳学习方式是通过视频教学进行掌握（本文内容基于首次发表于 J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28 的研究工作）。 关键词：持续递送，神经活性物质，微型导管，脑内灌注，动物模型，玻璃微移液管，无菌组装，中国台湾

方案

引言

直接输注神经活性物质可使特定脑区在绕过血脑屏障的情况下被研究。该方法在神经科学中的应用广泛，包括调节离散亚脑区的脑活动水平（Berretta 等，2004；Gliddon 等，2005；Kim 等，2000）、探究精神类药物的作用机制（Clinton 等，2006；Di Benedetto 等，2004）、建立可控的脑部炎症模型（Hauss-Wegrzyniak 等，1998；Marchalant 等，2007；Rosi 等，2004）、研究成瘾机制（Kim 等，2005；Lockman 等，2005；Zhang 等，2006），以及实现神经营养因子的长期给药（Naert 等，2006；Radecki 等，2005；Takahashi 等，2006）。

慢性递送试剂的标准方法通常使用微型渗透泵（例如 ALZET Osmotic Pumps，加利福尼亚州库比蒂诺），泵中装载神经活性试剂，并通过直径范围为 0.25 mm（Williams 等，1987）至 0.5 mm 的不锈钢套管将试剂递送至脑内，但最常用的直径约为 0.3 mm（Plastics One，弗吉尼亚州罗阿诺克；见图 6A）。尽管此类尺寸的递送套管在许多不需要高精度且微环境损伤不是主要关注问题的应用中可能适用，但在靶向结构本身较小而精细、套管尺寸与靶结构相当甚至更大，或功能不能因创伤性损伤而受损的情况下，这些套管并不理想。

本文介绍了一种用于制备和植入慢性输注系统的操作方法，该系统通过使用尖端直径显著减小的“微导管”将神经活性物质递送至脑内。该技术可靶向较小的脑内亚结构，并减少对目标区域的损伤。因此，本操作流程被推荐为传统方法的一种替代方案，适用于希望尽量减少对研究脑区造成干扰的研究人员。

材料与方法

动物与实验设计

采用18只成年（400–450 g）雄性Sprague-Dawley大鼠来演示该操作流程并测试本方法的功能。其中12只动物植入了微输注系统，用于评估持续功能在4天内的时程变化。另外6只动物用于比较植入标准28号给药导管（N=3）或连接至充满生理盐水的微型渗透泵的微导管（N=3）后第5天的创伤程度和反应性胶质增生情况。动物饲养于透明塑料笼中，维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期，并可自由摄食和饮水。所有实验程序均经麦克莱恩医院机构动物护理与使用委员会批准，符合联邦和地方关于实验动物使用的相关指南。

微输注系统组装

图1展示了微型输注系统的组件及其组装方式。我们建议采用无菌技术进行系统的构建和植入。此外，为防止空气进入系统，组装过程需在生理盐水浴中浸没完成。在本实验中，使用了微型渗透泵（MOPs）（ALZET，型号#1002，美国加利福尼亚州库比蒂诺），其持续时间为14天，流速为0.25 µL/hr，填充容量为98.6 µL。然而，由于过高的流速可能淹没脑内较小的目标区域并造成结构损伤，因此按照制造商的说明，通过用石蜡包覆MOP的一半，将本研究中的流速降低至0.125 µL/hr。在评估局部创伤时，MOP中填充无菌生理盐水。在评估微型输注系统持续功能时，选择快绿（Fast Green，1%生理盐水溶液，Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡Park Lane）作为测试溶液，因其毒性低，可在活性脑组织中扩散，且其分子量（808.84）处于通常适用于慢性输注的“小分子”（<1000）范围的上限（例如蝇蕈醇、苦味毒、氟西汀等）。

图1：微输注系统的组装。（A）系统各组件按组装时的相对位置摆放。注意流量调节管上的凸缘已被移除。我们建议在植入前立即固定对齐导丝（见正文）。（B）连接对齐导丝并准备植入前的已组装微输注系统。

微导管准备

可使用标准的水平或垂直电极拉制仪（Stoelting Co.，Wood Dale，IL）制备微套管，设置参数以拉制出具有长而平缓锥形杆部的玻璃电极（图2A）。适合此用途的为硼硅酸盐玻璃管（型号1B100F-6，1.0 mm，6英寸；World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL），因其熔点相对较低，便于后续通过集中加热进行弯曲。可使用解剖剪刀剪切直型微套管的最远端部分，或使用显微镊子（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL）进行可控断裂，以获得所需的最终尖端直径（本次演示中为50 µm），并可借助显微镜载物台测微尺来引导和确认所需直径。切好的尖端可短暂加热，即“火焰抛光”，以去除粗糙或锋利的边缘。随后，将硼硅酸盐玻璃管置于电极拉制仪的加热丝（或本生灯火焰）中，并在加热过程中用镊子对远端施加轻柔外力，利用加热丝或本生灯在距微套管尖端预定距离处将其弯成直角（图2B）。微套管在弯成直角后其远端的预定长度应根据目标脑区的深度（例如5 mm），并结合颅骨厚度（约1 mm）以及颅骨上方的操作距离（例如1–2 mm）来确定。因此，本次演示中从微套管尖端到弯折直角处的预定距离为7–8 mm。然后使用金刚石刻笔在距直角处近端约8 mm的位置切割硼硅酸盐玻璃管。

图2：微型套管的制备。（A）使用电极拉制仪（Stoelting Co. Wood Dale, IL）制备具有长锥形杆的微型套管。（B）加热线圈可根据使用需要调整方向，将微型套管置于线圈内，在加热玻璃管的同时用镊子形成直角弯曲。

在制备出所需数量的微套管后，建议使用环氧乙烷进行灭菌或采用高压蒸汽灭菌法。微套管最远端的1-2 mm可通过无菌外科标记笔（或在灭菌前使用永久性墨水）染色，以便在手术过程中易于观察微套管尖端。

MOP 的制备

根据制造商的说明制备MOPs。简言之，首先使用剪刀或咬骨钳移除不锈钢MOP导管（“流量调节器”）上的塑料法兰。将一段聚乙烯导管（Plastics One，Roanoke，VA，#C312 VT；外径：1.22 mm；内径：0.72 mm）连接至不锈钢导管原先被法兰占据的区域（约4 mm），方法是将不锈钢导管插入聚乙烯导管的管腔内，并在连接处外周使用合适的粘合剂固定。LumaBond（myNeuroLab, Inc.，St. Louis，MO）尤为适用，因其在聚焦光源（例如光纤灯）照射下数秒内即可固化。导管长度应大致等于动物颅底至肩胛骨最前端的距离（例如，实验室大鼠约为1.5–3.0 cm）。按照说明将泵体充满液体后，将带有聚乙烯导管连接在其末端的不锈钢ALZET导管插入已充满液体的泵体内。此时会有少量液体从泵体与导管接口处外溢（应轻轻吸去），同时也会进入聚乙烯导管的近端区域。将装有导管的充满液体的泵置于无菌生理盐水中，在37°C下孵育12小时。若泵功能正常，在此孵育期后，可见液体已在聚乙烯导管内移动数毫米。

微型输注系统的构建

将连接有导管的泵浸入盛有无菌生理盐水的10 cm培养皿中，使用装有与泵内相同溶液的注射器排出聚乙烯导管内的残余空气，该注射器前端连接有细径导管，可插入聚乙烯导管内部。通过此方法可将溶液注入聚乙烯导管以置换其中的空气。同样，将微导管浸入生理盐水浴中，并通过注入溶液排除空气。此步骤可使用第二个装有溶液的注射器轻松完成，该注射器连接有柔软（例如硅胶）导管，可套接在微导管较粗的一端（近端）。

将硼硅酸盐玻璃管的近端插入聚乙烯管中。注意，此步骤可能需要使用显微镊的闭合尖端用力插入聚乙烯管的管腔，以扩张其开口，便于硼硅酸盐玻璃管顺利插入。随后，将无气泡的灌注系统从生理盐水浴中取出，置于无菌表面，并用纱布或棉签轻轻擦干。使用环形涂布的粘合剂（如 LumaBond）固定微导管与聚乙烯管之间的连接处。

如果系统已正确组装，且微型渗透压泵（MOP）仍保持正常功能，在本操作的最后一步，由于泵内渗透压机制在制备过程中持续发挥作用，通常会有一滴溶液出现在微导管尖端。根据制造商的说明，可通过在适当表面积上涂覆石蜡，成比例地降低MOP的流速。在本次演示中，将每个MOP的50%表面区域浸入熔融石蜡中片刻后取出冷却，从而使其流速减半至0.125 µL/hr。完成的微输注系统随后浸入无菌生理盐水中，并在37°C条件下保存，直至植入使用。

微型输注系统的植入

采用标准的立体定位方法植入微量输注系统，具体步骤如前所述（Cooley，1990）。手术区域准备就绪后，钻取骨孔以便插入微导管。如有需要，可安置颅骨螺钉以增强固定微导管所用粘合剂的稳定性。本实验室使用的粘合剂（Geribond，Den-Mat Inc.，Santa Maria，CA）无需额外锚定，但需用浸有丙酮的棉签清洁颅骨表面进行预处理。在对准导丝的远端制作一个直径1-2 mm的“钩”状结构（见图1），使其能够环绕硼硅酸盐玻璃管的弯曲部分。然后使用LumaBond将其固定，方向与微导管远端部分（即将插入脑组织的部分）保持在同一轴线上（见图3B）。随后将输注系统安装至立体定位仪载体上（图3），并将对准导丝夹紧在固定夹具中。使用无菌缝线将输注泵系于立体定位操作臂的顶端，使其处于悬吊状态，从而避免因泵体重量（及扭矩）导致操作过程中方向偏移（图3B）。通过镊子轻轻弯曲载体夹具远端的对准导丝，可将微导管调整至所需方向（例如完全垂直）。将微导管尖端置于参考点（例如前囟或后囟）上方，随后移动至脑组织穿刺点。本实验中所用动物的定位坐标为：前囟前0.2 mm，外侧3.2 mm，硬膜下5.0 mm，动物头部处于颅骨水平位。

当微导管推进至脑内适当深度后，使用基座粘固剂（例如 Geribond）将系统固定在位。基座可塑形至接近颅骨表面，以利于伤口闭合。待基座粘固剂固化后（约 2 分钟），使用钻头的切割轮将定位导丝齐基座表面切断。可使用少量粘固剂覆盖并平滑导丝切断后残留的倒刺。随后将 MOP 植入皮下，置于动物肩胛骨之间。最后，用无菌生理盐水冲洗伤口，并使用缝线或伤口夹闭合切口（图 3，图版 D）。

图3：微型输注系统的植入。(A) 将微型输注系统放置于立体定位仪上。(B) 使用无菌缝合线将MOP固定，以防止其重量影响微型套管的方向。利用校准丝对微型套管进行定位，以实现精确的垂直脑部穿刺。(C) 将微型输注系统置于动物体内进行植入和固定。(D) 微型输注系统的设计允许切口在低剖面基座上轻松闭合，降低感染风险并尽量减少动物的不适。

标准输注系统的准备与植入

标准输注系统的制备步骤与微输注系统相同，只是将微导管替换为直径300 µm（28 ga；Plastics One，Roanoke，VA，#3300PM/SPC；见图5a）的“渗透泵连接导管”。标准系统的植入方法也与微输注系统完全相同，包括安装定位导丝，以确保导管垂直精确地进入脑部。

组织学与分析

为了评估微输注系统持续递送快绿（Fast Green）的能力，在术后12小时、1天、2天和4天分别处死三只动物为一组进行观察。实验动物通过腹腔注射戊巴比妥钠（120 mg/kg）进行深度麻醉，随后经心脏灌注200 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），接着灌注400 mL含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液。灌注液保存在4°C，pH值为7.4，并使用蠕动泵以每分钟50 mL的速度进行灌注。为了在不损伤死后脑组织的情况下移除导管，将灌注后的动物固定在立体定位仪上，将基座用粘合剂固定于连接至操作臂夹具的刚性金属丝上，然后使用牙科钻小心去除基座周围颅骨。由此可沿导管植入时的相同轨迹整体移除基座及其下方的导管。随后将脑组织从颅骨中取出，并浸入相同的固定液中固定12小时。

为了评估快绿持续灌注效果，使用振动切片机（myNeuroLab，St. Louis，MO）切割厚度为200 µm的脑组织切片，并将其湿封于载玻片上。选取代表性切片，采用佳能CanoScan LiDE 600F扫描仪进行成像。为了评估局部创伤及反应性胶质增生，先将70 µm的振动切片机切片湿封后直接拍照，避免因组织学处理过程（如干燥、染色和脱水）引起的组织变形。随后，将同一组切片自然干燥附着于明胶包被的载玻片上，经苏木精和伊红（H&E）染色，梯度酒精脱水，并用Permount封片剂封片。

相邻的70 µm切片经过标准免疫荧光程序，以检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP），该蛋白在创伤后反应性胶质增生过程中由星形胶质细胞表达（Ding等，2000；Ma等，1991）。简言之，游离切片用PBS漂洗后，在含10%正常驴血清（NDS）和3%牛血清白蛋白的0.1 M PBS缓冲液（含0.3% Triton X-100，简称PBS/Triton）中于室温封闭1小时，随后在4°C下与兔抗GFAP抗体（1:500；Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO）孵育12小时，抗体溶于含1% NDS的PBS/Triton溶液中。切片再次用PBS漂洗后，在室温下与Alexa Fluor® 594标记的驴抗兔二抗（1:500；Molecular Probes, Inc.，Eugene, OR）在含5% NDS的PBS中孵育1小时。随后切片充分用PBS漂洗，并用NeuroTrace®绿色荧光尼氏染料（1:500溶于PBS，染色5分钟；Molecular Probes, Inc.，Eugene, OR）进行复染。最后一次PBS漂洗后，切片贴附于明胶包被的载玻片上，用Slow-Fade封片剂（Molecular Probes）加盖盖玻片封固。所有显微图像均使用配备AxioVision软件的蔡司Axioskop显微镜（Carl Zeiss, Inc.，Thornwood, NY）采集。

结果

体外测试

在动物实验评估之前，将三种微灌注系统的含快绿染料的MOP置于一个容器（15 ml锥形管）中，同时将其微套管置于另一个容器（1 ml Eppendorf管）中，两个容器均装有37°C的无菌生理盐水。每种系统在12小时的观察期间均表现出染料的持续流动。图4展示了典型系统在3小时内的运行情况。

图4：微灌注系统功能的体外验证。（A）在体外测试开始时，快速绿染料从微导管中顺畅流出，清晰可见。（B）随着流动持续进行，储液端溶液逐渐饱和（B），最终呈现不透明的着色状态（C）。

体内微灌注系统的评估

灌注后，仔细检查了取出的微型套管及其连接部位，所有部件均完整无损。因此，在组织内未发生硼硅酸盐玻璃的断裂，系统组件的连接处也未发现任何缺陷。使用一个装有10 µL生理盐水的Hamilton注射器，其针头连接一段较短的硅胶管，对连接在微型套管上的聚乙烯导管的切断端施加轻柔的液体流动。全部十二个微型套管均能持续流通，未见阻塞现象。此外，在将每个微型渗透压泵（MOP）从动物体内取出后，测量了其中剩余溶液的体积，结果表明其体积与MOP的流速（0.125 µL/hr）以及其实际工作时间相符。

体内递送

对用快绿染料灌注的组织冠状切片进行评估，结果显示，在任一时间点（12小时、1天、2天和4天），组内动物之间的染料分布差异很小。图5展示了在这些时间点上快绿染料扩散的代表性区域，显示四天内染料渗透逐渐增加。需要注意的是，先前使用较高浓度快绿染料（例如5–15%）的实验导致实质组织迅速浑浊，从而掩盖了对微灌注系统功能随时间变化的准确评估。尽管在肉眼观察下准确判断1%染料扩散的完整范围可能存在困难，但在2.5倍放大下，渗透区域清晰可辨，并在图5中以虚线标示。

图5：体内持续微灌注快绿染料的演示。(A) 纹状体内植入负载快绿染料的微灌注系统12小时后，可见染料向微导管周围实质组织扩散。(B) 1天、(C) 2天和(D) 4天的观察结果显示，快绿溶液持续释放，染料浸润范围逐渐扩大。扩散最远边界在低倍显微镜下观察确定，图中以虚线标示。比例尺：2 mm。

创伤与反应性胶质增生的评估

对新鲜切割、未经染色的组织切片进行大体观察显示，微灌注系统可减少给药部位的局部创伤。标准套管 invariably 导致更大范围的组织破坏和移位（图 6B 和 C），在 H & E 高倍镜下观察更为明显（图 6D 和 E）。此外，标准灌注部位常可见血液积聚（图 6D），提示血管结构受损程度更大，表明血脑屏障完整性降低。

与标准套管相比，使用微灌注系统后，反应性胶质增生显著减少，这通过微套管灌注周围区域GFAP免疫反应性降低得以证实（图6G vs 图6F）。尽管微套管引起的GFAP染色强度高于正常水平（图6H），但在使用微灌注系统时，并未观察到标准套管植入和灌注所导致的反应性胶质增生的显著加剧现象（图6F）。

图6：微导管与标准递送导管在生理盐水输注5天后引起的局部创伤对比。(A) 由硼硅酸盐玻璃管拉制而成的微导管，其尖端直径为50 µm，可实现大多数神经活性物质的自由、无阻碍流动，且其尺寸仅为标准递送导管（28 ga，0.30 mm）的1/6。(B, C) 未染色的湿封冠状切片（厚度70 µm），显示标准导管（B）相比微导管（C）造成更严重的局部组织损伤（箭头所示）。(D, E) 分别对应B和C中H&E染色切片的高倍光学显微照片。标准导管造成的创伤性损伤更为广泛，如图D所示，其推移了更大范围的组织，并因病灶腔内积血（箭头所示）而对血管系统造成更严重的损害。相比之下，微导管所致病灶明显更小，对输注部位组织的破坏也更轻微。(F, G, H) 针对GFAP的免疫荧光染色显示，在标准导管病灶周围（F）GFAP阳性星形胶质细胞数量显著增加，而微导管周围（G）及正常无损伤纹状体（H）中则明显较少。比例尺：A & B，1 mm；D - H，250 µm。

讨论

多项研究已表明，通过减小脑内输注所用导管的尺寸，可减少对组织的损伤以及对血脑屏障的破坏（Perry 等，1993），降低炎症反应并减弱免疫应答（Finsen 等，1991），并减轻反应性胶质增生（Nikkhah 等，1994）。本文介绍一种通过微型导管向脑内长期递送神经活性物质的方法，该导管直径较常规使用的递送导管减小了6倍。我们已证实，该系统能够稳定地随时间递送代表性溶液，且局部损伤和反应性胶质增生显著减少。这些研究中所使用的递送导管末端尖端直径为50 µm；然而，也可采用更小的尖端直径。此类微输注系统的主要优势在于，能够在对输注周围区域造成最小创伤的前提下，将药物递送至非常微小且特定的靶区。

我们所描述的输注系统中使用的微导管可根据预设的长度和尖端直径轻松定制。该微输注系统设计为贴合动物颅骨表面，可实现稳固、低轮廓的固定，无需使用较大的颅骨基座。因此，手术切口可轻松缝合于流线型的微输注基座之上，从而减轻动物的不适并降低感染风险。此外，该系统固定于颅骨所需骨面面积较小，因此可在不受到较大基座干扰的情况下进行其他或后续操作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微型渗透泵 (MOPs)	工具	ALZET	型号 #1002
电极拉制仪	工具	Stoelting Co.
硼硅酸盐玻璃管	手术	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-6
显微镊	手术	World Precision Instruments, Inc.
聚乙烯导管	手术	Plastics One	#C312 VT
LumaBond	试剂	myNeuroLab, Inc