由线粒体DNA患者血小板生成跨线粒体胞质杂交细胞：一种优化克隆筛选与功能验证的高效方案

摘要

我们描述了一种优化的源自线粒体DNA患者血小板的跨线粒体细胞融合体生成方案，重点强调了细胞生长参数和克隆分离步骤。该方法能够在统一的细胞核背景下研究不同异质性水平的线粒体DNA变异，从而量化其对电子传递链酶活性及整体呼吸功能的影响。

摘要

线粒体转细胞质杂交细胞系的建立是确定线粒体DNA（mtDNA）变异致病性的金标准方法，可在核基因组和mtDNA背景完全相同的情况下，对特定mtDNA变异在高、低比例（异质性水平）下进行生化分析。传统上，细胞质杂交（cybrid）的构建过程繁琐且效率低下。本文介绍一种高效且可靠的构建线粒体转细胞质杂交细胞系的方案，通过将人血小板与标准的骨肉瘤143B细胞系（其mtDNA已被耗竭，即Rho⁰细胞）融合，从而提供一个同源的核基因组背景。该方法可捕获特定的mtDNA基因组，用于建立具有不同异质性水平的稳定细胞系，或用于比较不同线粒体单倍群的差异效应。由于来自线粒体疾病患者的细胞质杂交系可能难以通过标准方案建立，本方法特别聚焦于电子传递链功能受影响的mtDNA变异的分离。本文证明，通过克隆筛选技术可缩短时间并提高高异质性mtDNA突变型细胞质杂交系的获得率。我们以MT-ND1基因中一个意义未明的变异m.3985G>A（p.E227K）为例，展示了细胞质杂交系的构建过程。我们利用该方案分析了细胞质杂交构建的效率，并通过高分辨率呼吸测定法开展功能研究。结果表明，采用本方案构建的高异质性MT-ND1 m.3985G>A突变型细胞质杂交系，其依赖复合物I的线粒体呼吸功能较野生型对照明显受损，提示m.3985G>A很可能具有致病性。

引言

由于线粒体DNA（mtDNA）突变的罕见性、不同组织中突变型与野生型mtDNA基因组混合比例不一的异质性（heteroplasmy）、多样的病理生理机制以及与核基因组背景的复杂相互作用，确定mtDNA突变的致病性具有挑战性^1,2,3,4。由于这些原因，跨线粒体细胞融合（trans-mitochondrial cybrid）细胞系仍是验证mtDNA变异致病性的金标准方法，其中"cybrids"指的是一个细胞的细胞核与另一个细胞的线粒体融合而成的杂交细胞^5,6,7,8,9,10（图1）。cybrid细胞系具有相同的核基因组背景，并携带特定异质性比例的mtDNA变异线粒体^11,12。因此，可在异质性水平从0%到100%的cybrid细胞系中进行功能检测，例如通过极谱法测定呼吸功能，或通过分光光度法测定电子传递链酶活性，以评估特定mtDNA变异的潜在致病效应，以及不同cybrid细胞系间可能存在的线粒体单倍群的相对影响¹。其他类型的细胞也可用于致病性研究，但最适合作为cybrid构建与功能分析的补充手段，因为每种细胞类型均有其优缺点。患者成纤维细胞直接来源于患者，但受限于固有的异质性水平，且缺乏同源核基因组对照，无法排除核基因的影响。mtDNA编辑技术正变得日益流行，但仍存在脱靶编辑及mtDNA中可编辑位点有限的问题¹³。诱导性多能干细胞（iPSCs）可被分化为不同类型的细胞（如神经元和视网膜神经节细胞），以研究突变在不同细胞类型中的影响，但重编程为多能状态可能导致目标mtDNA变异的丢失，或产生新的de novo变异¹⁴。cybrid研究依赖于一种基于癌细胞系（经典为143B骨肉瘤细胞系）核背景的较为人工化的系统，但其通常生长良好，适用于对候选干预措施进行高通量筛选。高异质性cybrid细胞系的构建受限于血小板质量、起始异质性水平以及突变线粒体的选择性劣势，这些限制因素将在本实验方案中详细讨论。

尽管细胞质杂交（cybrid）技术是确定线粒体DNA（mtDNA）变异致病性的金标准，但目前仅有少数实验室采用该技术用于线粒体疾病的研究^{9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}。相比之下，更多研究将细胞质杂交技术应用于癌症和衰老领域^28,29。本文通过一例疑似线粒体病患者的案例研究，展示了一系列优化策略，以促进从患者血小板来源的mtDNA高效构建细胞质杂交细胞系，包括为建立目标mtDNA变异高异质性与低异质性水平的细胞系所需的选择流程和细胞制备方法。具体而言，我们展示了针对复合体I（CI）亚基基因MT-ND1中m.3985G>A变异构建细胞质杂交细胞系的方法，并通过生化研究证实了该变异的致病性。图2展示了细胞质杂交构建的时间线，其主要方法步骤包括细胞融合、筛选和分离，以获得不同的细胞克隆群体。

方案

血液血小板根据费城儿童医院（CHOP）机构审查委员会（IRB）研究方案 08-6177 获取。

1. 血小板的制备

1. 第1天：采血时将血液吸入含酸-柠檬酸-葡萄糖抗凝剂的采血管中。
   注意：血液采集后应立即置于旋转仪上。血小板最好在采血后最多4小时内进行分离。
2. 记录血液体积。建议采血量为5–6 mL。
3. 在12 °C条件下，以200 × g 离心20分钟。
   注意：12 °C离心有助于保持样本完整性，并防止血小板活化。
4. 将上清液（血浆）转移至新的离心管中。
5. 记录血浆体积。
6. 在12 °C条件下，以1500 × g 离心血浆20分钟。
7. 记录估计的血小板沉淀体积。
   注意：本实验方案中血小板过多可能带来操作困难。在融合后接种Rho⁰细胞与血小板时，过量血小板可能黏附于培养瓶底部，阻碍Rho⁰细胞贴壁。建议用于融合的血小板沉淀体积少于50 µL。若血小板过量，可通过以下步骤分装后冷冻保存。
8. 弃去上清液。
   注意：若沉淀体积较大，可通过抽吸方式去除。某些患者的血小板数量显著减少，且黏附性较差。若出现此情况，应使用移液器缓慢吸除血浆。
9. 若使用新鲜血小板，将沉淀重悬于1 mL Spinner改良最低必需培养基（SMEM）中，并转移至微量离心管。
10. 若需冷冻保存，将沉淀（血小板）重悬于1.05 mL SMEM和450 µL血小板冷冻液（350 µL胎牛血清[FBS] + 100 µL二甲基亚砜[DMSO]）中。
    注意：部分患者血小板在冷冻过程中不稳定，冻存后难以获得高突变率的细胞杂交体。建议优先使用新鲜制备的血小板。
11. 若Rho⁰细胞尚未准备就绪，可将血小板置于37 °C、60 rpm轻度振荡条件下保存。
    注意：理想情况下，应使血小板与Rho⁰细胞同时准备完毕。不建议等待超过2小时。

2. 准备 Rho⁰ 细胞

1. 使用新鲜解冻的143B骨肉瘤Rho⁰ 细胞或 Rho⁰ 接近汇合生长的细胞
   注意：建议使用 Rho⁰ 在培养箱中生长至接近汇合的细胞。 freshly thawed Rho⁰ 可使用细胞，建议使用一管冻存的 Rho⁰ 高密度细胞。融合前让细胞贴壁2小时或更长时间。
2. 用 5 mL PBS 清洗 T75 培养瓶。
3. 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，使其覆盖Rho⁰ 细胞
4. 37 °C 下孵育 5 分钟。
5. 轻轻摇动培养瓶后，用 5 mL SMEM 冲洗培养瓶底部。
6. 收集 Rho⁰ 15 mL 圆锥形管中的细胞
7. 200 × g 离心 g 5 分钟，以浓缩细胞用于计数测量。
8. 移除上清液，并用1 mL SMEM重悬。
9. 计数细胞。
   注意：理想情况下，每次融合应使用150万个细胞；然而，细胞数量少至30,000时也已成功实现融合。
10. 将150万个细胞分装至1.5 mL微量离心管中，并用溶液定容至1 mL。
    注意：请确保准备额外的 "模拟融合" 管。此管仅含有 Rho⁰ 细胞，将用于辅助指导筛选过程。
11. 以 1700 × g 离心血小板 g 室温下孵育15分钟。
    注意：Rho⁰ 细胞对低温敏感。
12. 移除血小板中的上清液。
13. 加入1 mL Rho⁰ 血小板沉淀物上方的细胞
14. 离心 Rho⁰ 细胞和血小板在200 × g 室温下孵育5分钟。

3. 融合

1. 去除 Rho⁰ 细胞和血小板沉淀物的上清液。
2. 加入 150 µL 融合缓冲液（50% 聚乙二醇 [PEG]/10% DMSO），吹打 90 秒以重悬细胞。
   注意：某些沉淀物较为黏稠，除上下吹打外，还需手动搅拌并打散。请记录沉淀物是否具有黏性。
3. 在 T75 培养瓶中加入 12 mL 杂交细胞培养基（DMEM）+ 10% FBS + 50 µg/mL 尿苷。
4. 将 1 mL 融合后的血小板与 Rho⁰ 细胞加入培养瓶中。
5. 细胞在 37 °C、5% CO₂ 及高湿度条件下孵育。
   注意：所有细胞培养步骤均在此条件下进行。

4. 生长

1. 第2天：去除融合细胞培养基，加入12 mL新鲜的融合细胞培养基，含10%胎牛血清（FBS）和50 µg/mL尿苷。
   注意：Rho⁰细胞大约需要一周时间才能整合线粒体DNA（mtDNA）。
2. 第5天：去除融合细胞培养基，加入12 mL新鲜的融合细胞培养基，含10%胎牛血清（FBS）和50 µg/mL尿苷。
   注意：如果Rho⁰细胞达到80%汇合度，则将细胞分至两个培养瓶中。

5. 筛选

1. 第8天：移除培养基，并用5 mL PBS洗涤细胞。
2. 移除PBS，加入1 mL胰蛋白酶。
3. 使胰蛋白酶覆盖培养瓶底部，于37 °C孵育5分钟。
4. 加入5 mL杂交细胞培养基（Cybrid media），含10% FBS和50 µg/mL尿苷（uridine）。
5. 计数细胞。
   注意：筛选应从10%汇合度开始，即T75培养瓶或组织培养处理的培养皿中接种125,000个细胞。若采用克隆挑取法，建议使用培养皿；若采用稀释法，则使用T75培养瓶。
6. 将125,000个细胞接种至合适的容器中，并用筛选培养基（DMEM）补足体积至12 mL。
   注意：筛选培养基用于分离含有线粒体的融合143B细胞与Rho⁰细胞。Rho⁰细胞存活需要丙酮酸盐和尿苷。透析胎牛血清（dialyzed FBS）不含丙酮酸盐和尿苷，仅应用于筛选过程。建议尽可能使用两种不同的筛选培养基：一种含10%透析FBS，另一种条件更宽松，例如含20%透析FBS和50 µg/mL尿苷。对于严重突变株，建议并行使用条件较宽松的筛选培养基。
7. 将剩余细胞分装至两个冻存管中，每管加入1 mL冻存液进行冻存。
   注意：这些为筛选前细胞，后续可尝试不同的筛选条件。
8. 每隔一天更换一次培养基，持续约1周。
   注意：Rho⁰细胞死亡后会漂浮，并在换液时被洗去。可利用"对照"融合细胞来判断筛选是否完成（培养瓶中无残留细胞）。该对照瓶将完全为空，因为所有Rho⁰细胞均已被清除。即使对照瓶已空，也建议再等待一天，因为融合细胞可能向培养基中释放营养物质，帮助其他Rho⁰细胞在瓶中持续存活。若细胞生长超过20%汇合度，需进行传代和重新铺板。过度生长会掩盖筛选效果。

6. 菌落筛选培养法

1. 在含有20%胎牛血清（FBS）和50 µg/mL尿苷的Cybrid培养基中培养细胞，直至菌落肉眼可见。
   注意：将培养皿倾斜并对着光线观察。菌落呈浑浊的圆形。在显微镜下，菌落之间应无大量背景细胞。
2. 在培养瓶底部，对着光线用记号笔圈出独立且不重叠的菌落。
3. 使用P20移液器，在已画好的圈内同时进行刮取（机械性扰动贴壁于培养瓶底部的细胞）和吸取20 µL液体，将所选菌落的细胞收集至P20吸头中。
   注意：手动刮取可使细胞从表面脱离，而吸取20 µL液体则可将细胞收集至移液吸头内。
4. 将每个菌落分别接种至96孔板中的独立孔内。
   注意：该方法的优点在于143B细胞通常具有良好的共生长特性，因此培养时不易出现问题，且可获得更快的结果；缺点是可能存在混合细胞群体。

7. 稀释生长法

1. 当细胞在含20% FBS和50 µg/mL尿苷的Cybrid培养基中达到75%融合度时，用5 mL PBS洗涤细胞。
2. 吸除PBS，加入1 mL胰蛋白酶。
3. 使胰蛋白酶覆盖培养瓶底部，于37 °C孵育5分钟。
4. 加入5 mL含20% FBS和50 µg/mL尿苷的Cybrid培养基。
5. 计数细胞。
6. 将1 × 10⁵个细胞加入20 mL含20% FBS和50 µg/mL尿苷的Cybrid培养基中，转移至50 mL锥形管1。
   注：此浓度为5000个细胞/mL，接种至96孔板时每100 µL含500个细胞。
7. 用100倍稀释液（取200 µL管1中的细胞悬液加入20 mL含20% FBS和50 µg/mL尿苷的Cybrid培养基）制备50 mL锥形管2。
   注：每孔约含5个细胞。
8. 用1:1稀释液（取10 mL管2中的细胞悬液加入10 mL含20% FBS和50 µg/mL尿苷的Cybrid培养基）制备50 mL锥形管3。
   注：每孔约含2.5个细胞。
9. 用1:1稀释液（取10 mL管3中的细胞悬液加入10 mL含20% FBS和50 µg/mL尿苷的Cybrid培养基）制备50 mL锥形管4。
   注：每孔约含1个细胞。
10. 将管2、管3和管4中的细胞悬液以每孔100 µL接种至96孔板。
    注：接种前务必充分混匀细胞。由于细胞需要沉降至孔底并贴壁，因此在接种当天难以准确判断每孔是否仅含一个细胞。该方法的优点是单个细胞可生长为克隆，确保无混合背景；缺点是严重突变体在分离后可能无法存活。
11. 次日，划除明显每孔含多个细胞的孔。
12. 数天后再次检查各孔。
    注：此时应已形成克隆，若孔边缘存在多个细胞则更易识别。若孔内存在多个克隆，则剔除该孔；若无细胞生长，亦剔除该孔。

8. 生长

1. 从96孔板开始，根据需要逐步将细胞转移至更大的培养板中。
   注意：此类细胞在高密度条件下生长最佳，若转移的细胞数量不足可能导致细胞死亡。务必保留上一级培养板中的部分细胞，并标记清楚各孔细胞的来源，以便必要时可回溯。重要的是，143B细胞在过度融合时会死亡并脱落，因此需每天观察这些细胞。

9. 遗传学验证

1. 将分装的细胞在 450 ×g 离心 5 分钟。
2. 弃去上清液。
3. 加入 5 µL DNA 提取缓冲液（50 mM NaOH）。
   注意：如果细胞数量较多，此数值可调整。细胞沉淀较多时可使用 10 µL 缓冲液。
4. 在 95 °C 下孵育 30 分钟。
5. 向提取缓冲液中加入等体积的 DNA 稳定缓冲液（0.1 M Tris-HCl；pH 8）。
6. 根据酶的说明书进行聚合酶链式反应（PCR）。
   注意：某些点突变可利用限制性内切酶区分对照细胞与患者细胞。其他点突变则无法通过此法区分，需进行测序。在此情况下，为获得高质量结果，应使用不含染料的 PCR 混合液。可采用 Sanger 测序或高通量测序。2.5 µL DNA 足以进行 25 µL 的反应体系。
7. 使用针对该突变特异的 PCR 扩增产物进行 Sanger 测序。
   注意：PCR 扩增产物已送交 Sanger 测序。突变异质性水平在克隆扩增后及功能分析后均得到了确认。

10. 使用高分辨率呼吸测定法进行高分辨率呼吸测定

1. 按照呼吸仪（例如 Oroboros Instruments）的指南进行空气校准。
2. 用 PBS 清洗 T75 培养瓶中的胞质杂交细胞（cybrids）。
   注意：细胞不应过度融合；70%–80% 融合度为最佳。
3. 加入 1 mL 胰蛋白酶，孵育 4 分钟。
4. 加入 5 mL 胞质杂交细胞培养基并计数细胞。
5. 将 500,000 个细胞加入离心管中，在 450 × g 条件下离心 5 分钟。
   注意：呼吸仪所用的细胞数量和体积适用于 0.5 mL 检测室。
6. 用 PBS 重悬细胞进行洗涤，再次离心。
7. 将细胞重悬于 510 µL MiR05 缓冲液中，并加入空检测室。
8. 待信号稳定后，加入 0.65 µL 桔霉素（digitonin，50 mg/mL）、0.8 µL 苹果酸（malate，2.5 M）和 2 µL 丙酮酸（pyruvate，2.5 M）。
   注意：在加入桔霉素之前，此处测量基础呼吸（basal respiration）。后续每一步操作均需在信号稳定后进行。
9. 加入 12 µL 二磷酸腺苷（ADP，0.25 M）。
10. 加入 4 µL 谷氨酸（glutamate，2.5 M）。
11. 加入 12 µL 琥珀酸（succinate，1.25 M）。
12. 加入 1 µL 寡霉素（oligomycin，1 mg/mL）。
13. 加入 1 µL 羰基氰化对三氟甲氧基苯腙 [FCCP]（0.2 mM）。
    注意：需分多次滴定加入，直至无进一步增加（通常为 3–5 次）。
14. 加入 1 µL 鱼藤酮（rotenone，2 mM）。
15. 加入 1 µL 抗霉素 A（antimycin A，1 mg/mL）。
16. 加入 0.5 µL 抗坏血酸（ascorbate，0.8 M）和 0.5 µL 四甲基对苯二胺 [TMPD]（0.2 M）。
17. 打开检测室并插入间隔器，静置 20 分钟。
18. 关闭检测室，稳定 5 分钟。
19. 加入 22.5 µL 叠氮化钠（azide，4 M）。
20. 收集细胞，使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。
21. 在氧消耗速率稳定后进行计算，并以蛋白含量进行归一化。基础呼吸是指细胞加入检测室后氧消耗速率稳定时的数值。
    注意：所有其他测量值均在添加指定底物或抑制剂后获取。
22. 计算 OXPHOS_CI：(谷氨酸 - 抗霉素 A)/(FCCP - 抗霉素 A)。
23. 计算 OXPHOS_CI+CII：(琥珀酸 - 抗霉素 A)/(FCCP - 抗霉素 A)。
24. 计算 ETS_CI+CII：(FCCP - 抗霉素 A)。
25. 计算 ETS_CII：(鱼藤酮 - 抗霉素 A)/(FCCP - 抗霉素 A)。
26. 计算 LEAK_CI+CII：(寡霉素 - 抗霉素 A)/(FCCP - 抗霉素 A)。
27. 计算 OXPHOS_CIV：(TMPD/ASC - 叠氮化钠)/(FCCP - 抗霉素 A)。
28. 呼吸测定实验至少使用 4–6 个生物学重复。

结果

为了展示方法学差异及实验方案优化的路径，我们呈现了从一名疑似线粒体疾病患者中生成胞质杂交细胞（cybrid）的结果，该患者在线粒体电子传递链复合物I（CI）的MT-ND1基因中携带一个意义未明的变异（VUS）。在两个不同的CLIA认证的临床诊断实验室对多个组织进行临床线粒体DNA全基因组高通量测序后，唯一可疑具有致病性的变异为MT-ND1 m.3985G>A。该患者血液中MT-ND1 m.3985G>A（p.E227K）突变的异质性水平为50%。通过为该个体构建cybrid细胞系，我们获得了多项实验方案优化的关键见解（表1）。此前尝试使用冻存的血小板生成cybrid均未成功，或仅获得了野生型（0%异质性）的cybrid细胞系（表1）。相比之下，使用新鲜分离的血小板取得了更好的结果。研究发现，患者血小板在加入SMEM后稳定性较差，这可能是冻存血小板无法恢复异质性的原因。重要的是，我们研究团队在尝试构建其他复合物I疾病患者来源的cybrid时，也观察到更广泛的线粒体疾病患者血小板稳定性问题。在培养基和筛选培养...

讨论

本文介绍了一种利用线粒体DNA（mtDNA）患者血小板高效构建转线粒体杂交细胞系的实验方案。我们通过一个意义未明的MT-ND1基因变异案例，展示了该方法的适用性，并强调了在实验中需仔细考虑细胞生长与筛选参数的重要性。一旦这些关键问题得到优化，即可成功筛选出携带可能损害呼吸链功能的mtDNA变异的杂交细胞。该方案可用于构建携带mtDNA突变的杂交细胞系。

本案例研究的时间线表明，从血小板分离开始，胞质杂交细胞（cybrid）的生成大约需要2.5个月（图2）。从实际操作时间来看，第1天和第20天耗时最长。将细胞从96孔板转移至较大孔板所需时间存在波动，具有挑战性；同时需要每天检查细胞，因为143B细胞的培养存在困难：细胞过度融合或密度过低均可能导致细胞脱落和死亡。集落挑选法可将大量细胞转移至一个孔中，使其快速生长并迅速传代，因此其时间线比稀释法更短，但存在较高风险被具有不同异质性水平的其他胞质杂交细胞污染。相比之下，稀释法由于将细胞单独分离至孔中，许多细胞可能无法生长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ADP	西格玛奥德里奇	A5285-1G
抗霉素A	西格玛奥德里奇	A8674-25MG
抗坏血酸	西格玛奥德里奇	11140-250G
叠氮化物	西格玛奥德里奇	S2002-100G
透析胎牛血清	赛默飞世尔科技	35071CV
毛地黄皂苷	西格玛奥德里奇	D141-100MG
DMEM	康宁	10-013-CV	细胞融合培养基
DMEM	康宁	10-017-CM	筛选培养基
胎牛血清	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
谷氨酸	西格玛奥德里奇	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	西格玛奥德里奇	P7306	融合缓冲液
苹果酸	西格玛奥德里奇	M1000-100G
MiR05缓冲液	Oroboros Instruments	60101-01
O2K呼吸测定仪	Oroboros Instruments	C-0050
寡霉素	西格玛奥德里奇	O4876-5MG
丙酮酸	西格玛奥德里奇	P2256-100G
鱼藤酮	西格玛奥德里奇	R8875-1G
SMEM	西格玛	M8167
琥珀酸	西格玛奥德里奇	S2378-100G
TMPD	西格玛奥德里奇	T3134-5G
0.25%胰蛋白酶-EDTA	Thermo Scientific	25200056
尿苷	西格玛奥德里奇	U3750-25G