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一种用于免疫功能正常乳腺肿瘤小鼠的蒽环类药物诱导心脏毒性的 cardio-oncology 小鼠模型

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DOI：

10.3791/71633

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2026年10月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

具有临床相关性的阿霉素诱导心脏毒性小鼠模型较为稀缺。本文提出一种使用携带肿瘤并接受抗肿瘤治疗的免疫功能健全小鼠的模型，以模拟癌症患者的临床治疗方案。

摘要

欧洲心脏病学会关于癌症治疗相关心脏功能障碍的临床前模型的最新更新，凸显了对更具代表性与转化性的模型的迫切需求 体内 模型。该研究强调了开发采用免疫健全、荷瘤动物模型的必要性，应纳入多种品系及两性动物，以更准确地模拟临床人群中的异质性。因此，本研究构建了一种在荷乳腺肿瘤动物中具有临床相关性的蒽环类药物诱导心肌毒性（AIC）模型。根据小鼠的遗传背景，分别将4T1Luc细胞（20万个细胞）或PY8119细胞（20万个细胞）接种于Balb/c小鼠或C57Bl/6J小鼠的雌雄个体皮下低位乳腺组织。通过生物发光成像和触诊监测肿瘤生长。在肿瘤细胞接种后2周，当肿瘤可通过触诊检测到时，开始给予抗肿瘤药物多柔比星治疗。小鼠对多柔比星的耐受性具有品系依赖性。在实验方案开始前（基线水平）及之后每周，对氯胺酮麻醉小鼠进行心脏超声检查以评估心功能。心肌毒性定义为左心室短轴缩短率较基线下降至少10%，或绝对值 <50%，以及心率 >300 BPM。该方案可重复，肿瘤形成成功率达99%，且 >80% 小鼠存活率。观察到心脏毒性。 >90%的荷瘤小鼠经阿霉素治疗后。

引言

心血管肿瘤学旨在改善癌症患者在化疗前、化疗期间及化疗后的心血管结局。临床前模型在深入理解这两种疾病相互作用方面发挥了重要作用。最近，一项具有范式转变意义的研究发现，天生易发自发性肠道息肉的小鼠在发生心肌梗死并经历一段心力衰竭（HF）时期后，这些肿瘤的发生数量进一步增加，从而证明了心血管事件对肿瘤生长的直接影响1。此后，大量研究在不同肿瘤类型和小鼠品系中报道了类似发现，常常涉及特定的分子通路或蛋白质，进一步支持了癌症进展可由心血管疾病（CVDs）诱发这一概念2,3,4,5。

相反，癌症对发生心血管疾病（CVD）风险的影响已得到数十年的研究。流行病学数据显示，癌症幸存者更容易罹患心血管疾病，这既归因于这两种疾病共同的危险因素，也归因于已知的多种抗癌 治疗的毒性作用6,7,8,9,10。临床前研究通常采用癌症诱导的恶病质模型，以鉴定可在人体中调节的特定靶点，从而改善长期心血管预后11,12,13,14。然而，有人认为这些模型很难反映常见的临床情况，因为患者通常在发展至这种晚期癌症综合征之前就已接受治疗；但全身性恶病质仍被认为在癌症总体死亡中起着重要作用15。

在欧洲心脏病学会（ESC）发布的首部心血管肿瘤学指南中指出，需要进一步开展研究，以更深入地理解癌症与心血管疾病（CVD）之间的关系16。更具体而言，ESC心血管肿瘤学工作组最近的更新指出，基础研究在弥补这一知识空白方面至关重要，尤其是采用荷瘤动物模型的研究17。此外，还需要加强基础研究与临床研究之间的关联性，因为目前大多数临床研究针对的是在临床前研究中尚未得到充分探索的抗癌治疗手段18。

蒽环类药物（ACs），例如多柔比星（Dox），在多种实体瘤和血液系统肿瘤的化疗中被广泛应用。尽管如今已有更为现代的治疗方法，但由于其价格低廉、不良反应记录明确且疗效显著，这类药物仍将在未来多年内继续使用19,20。大量证据表明，蒽环类药物可导致剂量依赖性心脏毒性，主要表现为左心室功能障碍，这是目前限制其临床应用的主要因素之一，也是肿瘤心脏病学医师常常担忧的问题21,22。相关文献主要来源于乳腺癌研究，因其在人群中的发病率较高，但淋巴瘤、肺癌和白血病的临床研究也提供了类似的观察结果23。因此，数十年来已开展大量临床前研究，以阐明蒽环类药物诱导心脏毒性（AIC）的潜在病理生理机制，研究表明氧化应激、直接与间接DNA损伤、铁死亡以及线粒体损伤在其中起着重要作用23,24。

然而，关于如何预防或治疗蒽环类药物引起的心肌病（AIC）的证据实际上非常有限。常见的心力衰竭（HF）药物已在临床试验中得到测试，但结果不一，且少数潜在有效药物的使用时机也难以确定21,23,25,26,27,28。右雷佐生（Dexrazoxane）是一种调节铁代谢的药物，在预防AIC方面已显示出良好的效果，但目前尚未被系统性地使用21。将蒽环类药物（ACs）以非游离于血液中的形式递送，例如将其包裹在脂质体中，也已显示出良好前景，但仍难以取代传统的蒽环类药物，部分原因是其成本较高21。

造成这一情况的原因之一是缺乏用于研究药物性肝损伤的临床相关动物模型17在人类中，多西环素（Dox）需持续给药 通过 重复注射，且大部分AIC在治疗后的第一年内被观察到。然而，文献中动物实验方案存在较大差异，这一点已在近期发表的一篇综述中有所展示。29一个典型的急性心脏毒性模型是向无肿瘤小鼠单次注射20 mg/kg的阿霉素（Dox）30在典型的慢性心脏毒性模型中，许多研究描述了无肿瘤小鼠每周接受一次5 mg/kg的阿霉素注射，总累积剂量为20 mg/kg29,31该慢性心脏毒性模型在荷瘤动物中以相同的多柔比星剂量也可观察到；然而，目前文献中对此报道仍极为少见29,32.

为缩小这一知识差距，本研究建立了一种实用且具有临床相关性的乳腺肿瘤荷瘤免疫活性小鼠模型，用于研究癌症治疗相关心脏毒性（AIC），即在4T1荷瘤Balb/c小鼠中建立该模型，并在PY8119荷瘤C57Bl/6J小鼠中验证了其可靠性。据作者所知，这是首次在C57Bl/6J品系小鼠中建立以三阴性乳腺癌为基础的心脏肿瘤学模型。该模型能良好地反映肿瘤生长情况 通过 在用多西环素处理动物之前完成了生物发光定量，以评估其心脏毒性，并同时实施器官采集方案，以便在心脏肿瘤学实验过程中研究肿瘤微环境。此外，本研究观察到的结果与文献中报道的品系及性别敏感性特征相似。本研究有望为未来心脏肿瘤学研究中动物实验方案的标准化和优化提供参考，因为C57Bl/6J小鼠在AIC实验中具有较高的存活率，具有重要应用价值29.

该方法的优势在于使用了C57Bl/6J小鼠品系，该品系易于进行基因工程改造，基因组特征明确，获取成本低，并且对累积高剂量的蒽环类药物（ACs）具有耐受性29,33,34。如果特定研究需要对基因进行敲除，该模型非常适合此类实验。此外，使用源自该品系的三阴性乳腺癌模型具有转化医学研究价值，因为三阴性乳腺癌患者正是最有可能接受蒽环类药物治疗且预后最差的人群35。采用该模型有望针对此类患者进一步提升对蒽环类药物诱导的心脏毒性（AIC）的认识。

该模型的优势还在于小鼠预先接种了肿瘤，这能够真正影响心血管重构36,37。此外，该模型介于急性与完全慢性型AIC模型之间，由于动物存活率较高，可延长动物监测时间，若考虑其他AC循环时，这一点具有重要价值。

然而，由于该模型在肿瘤接种方面采用了较为实用的方法，因此在实验方案结束时可能并不最适合用于特定的肿瘤表征。如果肿瘤表征是科学假设的核心内容，则应采用经过调整的肿瘤注射方案。此外，在Balb/c小鼠中注射4T1细胞是一种更为成熟的肿瘤学研究模型，可用于例如转移性研究，但本文未对此进行描述；若转移是科学问题的关键，则应考虑采用该模型38。本模型在成年小鼠中实施；然而，若研究目标是儿童环境下的AIC，则应考虑使用幼龄小鼠，但本研究未探讨该年龄段小鼠对本方案的反应。

方案

所有动物实验均遵循当地动物伦理委员会（Lariboisière-Villemin）的规定，并已获得法国高等教育与研究部（MESRI）批准，批准编号为APAFIS 46086。在实验方案设计过程中充分考虑了3R原则。Balb/c和C57Bl/6J小鼠购自Janvier Labs或Envigo等动物供应商。本方案中，小鼠在纳入实验时的年龄为10至18周，相当于年轻成年个体，与患三阴性乳腺癌的女性患者年龄相仿。动物饲养于12小时明暗循环环境中，每笼2–5只，室温维持在20 °C至24 °C之间，相对湿度控制在30%至70%之间。水和饲料均自由供应（ad libitum）。在实验过程中，需严格遵守方案开始前预先设定的人道终点，具体参见补充表1。为保障使用者安全，应使用异氟烷过滤装置收集废弃气体。在整个实验流程中，操作人员须佩戴手套和护目镜，小心处理动物。所有危险材料的处理均须遵守所在机构的本地规定；本实验中，所有被污染的样品（血液、针头、含多西环素的药瓶等）均丢弃至生物危害医疗废物桶中。实验流程概览见图1A。所用试剂与设备详见材料表。

1. 第0周：细胞准备及向动物体内注射

注意：以下步骤以4T1Luc细胞为例进行描述，PY8119细胞的操作步骤与此相同。然而，针对不同细胞系应根据生产商的建议进行相应调整。为优化实验流程，可由一人负责细胞准备，另一人同时进行动物准备。

  1. 当细胞培养瓶达到汇合状态（80%–90% 汇合度）时，在 37 °C 和 5% CO2 条件下加入 3 mL 胰蛋白酶消化 5 分钟。
  2. 轻轻敲击培养瓶使所有细胞脱落，避免形成细胞团块，并用细胞培养基重悬细胞。
  3. 使用 Malassez 计数板（或根据可用设备选择其他计数方法）对细胞进行计数。
  4. 以 300 × g 离心 5 分钟，随后用等体积的 PBS 重悬细胞，以便在 100 µL 中注射 200,000 个细胞。
    注意：细胞数量的选择基于文献综述（参见 补充表 2）。
  5. 使用 26 G 注射器轻柔吸取 500 µL 细胞悬液。为避免细胞悬液在注射器中停留时间过长，建议吸取的体积少于 5 只动物所需总量。
  6. 同时（如可能），将小鼠放入异氟烷麻醉舱中，在室温空气下以 1 L/min 流速使用 3% 异氟烷快速诱导麻醉。一旦动物进入睡眠状态，立即将其置于仰卧位，并将鼻部置于含有 1% 异氟烷的面罩中。
  7. 用棉签将温和脱毛膏涂抹于动物胸部及左下腹部皮肤，持续 1 分钟。随后用水清除毛发和脱毛膏，再用纸巾将皮肤擦干。
  8. 通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否充分。
  9. 定位左上腹部乳腺乳头。用镊子轻轻夹住乳头并向上提起（见 图 1B）。
  10. 将注射针头插入皮下，并推进至针头位于乳腺下方。
  11. 注射 100 µL 细胞悬液。乳头下方应形成一个皮下气泡（见 图 1C）。对照组动物应注射 PBS。随机分组可使用随机化软件（例如 RandoMice，一种可免费使用的在线工具），或按照预设的 1:1、2:2（或更高比例）分配处理组。
  12. 轻柔拔出针头，并松开镊子夹持的乳头。
  13. 称量动物体重，以获得实验方案的基线数据。
  14. 让动物在室温空气中苏醒后，再放回笼中。

2. 第1周：利用生物发光控制肿瘤生长

注意：注射后任何一天均可进行此操作以控制生长。此外，若需关注肿瘤生长速率，也可在多个时间点进行检测。然而，由于肿瘤生长过程中自然的肿瘤细胞筛选，10–14 天后信号可能会逐渐减弱。此外，只要在实验开始时正确执行本方案，毛发再生不应影响光子的正常捕获。代表性生物发光定量结果见图 2A、B，分别为肿瘤注射后第 2、5、8 和 11 天的检测结果。

  1. 将动物放入异氟烷麻醉舱中，使用3%异氟烷快速诱导麻醉。
  2. 动物失去意识后，使用26号注射器按10 µL/g体重剂量经腹腔（IP）注射荧光素酶底物（luciferin）。由于肿瘤位于左侧，有时数天后即可触及，因此避免在左侧注射。
  3. 将小鼠仰卧放置于光子成像仪中，以优化光子捕获效率，因为肿瘤位于腹部。将小鼠鼻部置入鼻罩，并将异氟烷浓度降至1%。
    注意：正确放置5只动物进入光子捕获装置需要一定时间；应在开始采集前至少2分钟开始放置。
  4. 在注射荧光素酶底物后10分钟开始进行生物发光成像（luminescence activity）采集，持续采集5分钟（见图2A）。本实验所用设备的采集模式为BLI，每帧曝光89 ms，图像尺寸为220 mm x 165 mm，BVR像素大小为153 µm。
  5. 采集完成后，让动物在室温空气中自然苏醒，然后将其放回笼中。
  6. 根据制造商的建议，使用适用于该光子成像仪的定量分析软件进行数据量化。

第3周：阿霉素处理

注意：应在开始注射多柔比星（Dox）之前进行超声心动图评估。因此，在超声心动图检查后利用动物仍处于麻醉状态的时机进行注射，以减少首次多柔比星注射带来的应激反应。此外，累积剂量应根据小鼠品系进行调整。根据本实验室前期数据及文献报道29，本实验中Balb/c小鼠使用16 mg/kg，C57Bl/6J小鼠使用24 mg/kg（见图3A–C）。

  1. 用生理盐水溶液重悬并稀释阿霉素粉末。稀释液的配制应使每4 mg/kg的阿霉素对应240–360 µL的体积。因此，建议先配制浓度为2 mg/mL的溶液，再用生理盐水溶液进行6倍稀释（终浓度为0.33 mg/mL）。
  2. 肿瘤接种后两周，确认肿瘤位于腹部左下部且可触及，但直径小于1 cm。
  3. 称量动物体重，以监测阿霉素治疗后的体重变化。
  4. 使用26 G注射器，将相应体积的药物注射至腹部右下部腹腔内，使剂量达到4 mg/kg。对照组动物应给予生理盐水溶液。随机分组可参照步骤1.11进行。
  5. 每日重复该操作，连续4天，累计剂量达到16 mg/kg（如需对C57Bl/6J小鼠达到24 mg/kg，可额外增加2天给药）。

第2–5周：心脏毒性监测

注意：此项操作可每周进行一次。更频繁的评估需谨慎实施，因为动物在实验方案的第3周和第4周通常最为脆弱，且部分小鼠品系对全身麻醉敏感，可能导致死亡率升高。超声心动图检查应在氯胺酮麻醉下进行，以提高记录心脏功能障碍的可能性，因为异氟烷会引起心肌抑制。Balb/c小鼠的剂量为40 mg/kg，C57Bl/6J小鼠为80 mg/kg39。建议在肿瘤接种开始前进行一次超声检查，以量化肿瘤生长对心脏功能的潜在影响，从而在化疗开始前获得基线数据。

  1. 称重动物。若观察到明显的体重减轻，则进行后续处理 补充表1.
  2. 使用26 G注射器经腹腔注射氯胺酮对动物进行麻醉，Balb/c小鼠剂量为40 mg/kg，C57Bl/6J小鼠剂量为80 mg/kg，以获得浅麻醉状态。
  3. 将动物置于加热垫上，以防止低体温。
  4. 动物入睡后，按照1.7步骤所述进行剃毛，以获得无毛的胸部区域。
  5. 氯胺酮注射后10分钟内，进行超声心动图检查，持续时间最长不超过5分钟。使用预热的超声耦合剂。根据所用设备，重点采集M型图像和/或进行应变定量分析。
  6. 若使用M型超声，应在胸骨旁长轴切面记录心室中部节段，持续记录至少4秒，重复至少3次，以获得小鼠心脏功能的代表性平均值（参见 图 4A，B）。此处，帧率设置为100帧/秒，发射频率为38.4 MHz（功率100%），接收频率为96 MHz，声速为1538 m/s，扫描速度为1200 Hz。
  7. 大约5分钟后，动物将过于清醒而无法继续进行超声心动图检查。清理超声所用的凝胶后，将其放回笼中。
  8. 盲法评估心脏功能39,40该模型中的相关功能障碍定义为低于基线值10%且达到某一绝对值 <左心室缩短分数（FS）的50%，同时心率保持不变 >300 次/分钟。如果预处理时的 FS 值过低，应考虑将该动物排除在分析之外。
    注意：每个4秒片段的定量分析至少需要3个心动周期，若条件允许，可使用更多心动周期。如有可能，建议由同一操作者完成所有超声心动图检查，并由另一人员进行定量分析，以实现分析过程的盲法。有关超声心动图质量控制的建议已在其他文献中发表。40.
  9. 进行统计分析（见步骤6）。推荐使用双因素方差分析（two-way ANOVA）来分析整个实验过程中两个组别的数据，因为需要比较两个因素：时间和处理方式。
  10. 每周进行一次。心脏功能障碍在仅使用阿霉素治疗1周后即出现。
    注意：如果在多西环素给药后的某个时间点需要采血（例如，检测心肌生物标志物），应在超声心动图检查后立即采血，以避免再次注射麻醉剂，减少动物应激，并优化时间安排。

5. 第5周：处死操作

注意：理想情况下，该器官采集方案应由两人共同完成。

  1. 在第5周完成最后一次超声心动图检查后，以100 mg/kg剂量经腹腔注射再次给予动物氯胺酮。在用于采血的眼部滴加一滴1%丁卡因进行局部麻醉。
  2. 使用肝素毛细管，通过眶后取血法尽可能采集血液至肝素管中（或使用EDTA毛细管采集至EDTA管中）。
  3. 当无法再获取血液时，按照机构批准的规程实施颈椎脱位。立即将采集的血液置于冰上保存，直至后续处理，同时继续执行第5.5步中的处死流程。
  4. 以 2000 x g 离心血液 g 10 min 4 °C 分离血细胞和血浆。使用液氮速冻血浆管，并于 -80 °C 保存。80 °C 直至进一步分析。
  5. 将动物置于覆盖有吸水纸的聚苯乙烯泡沫盖上，并用图钉固定四肢。
  6. 肿瘤应具有一定的大小（至少2 cm）。在肿瘤周围保留较大切缘进行切割，以将其完整剥离。其余器官的采集按步骤5.15所述完成后，可进一步进行解剖。
  7. 在另一区域，用镊子夹住肿瘤，同时用小型锋利剪刀轻轻解剖。为增加张力而不损伤肿瘤，可将多余的皮肤固定在皿盖上，以方便解剖操作。
  8. 肿瘤充分解离后，用 PBS 轻柔清洗以去除血液、毛发及其他游离碎片，称重肿瘤。
  9. 放置一个 22 µm 将尼龙滤网放入5 mL离心管中，轻轻将肿瘤组织置于其上，并置于冰上保存直至离心。
  10. 将试管在 100 x g 10 分钟 4 °C 收集组织间液（参见 图 5A）。获得的体积范围为 1 至 20 µL，通常呈红色样色泽（图5B）。转移至一个 200 µL 微型离心管，并于 -80 °C 直至进一步分析。
    注意：可将剩余的肿瘤组织切成小块，放入储存管中，置于液氮中速冻，然后在 –80 °C 直至进一步分析。
  11. 为收集骨髓，用剪刀剪下右侧腿部，使用解剖刀和镊子分离股骨和胫骨，去除所有肌肉、结缔组织和脂肪。用解剖刀在两根骨头的两端切开骨骺。将清理干净的骨骼置于含PBS的12孔细胞培养板中，并继续按照步骤5.15所述完成小鼠其他器官的采集。
    注意：骨髓分离的更详细步骤已发表于其他文献中41.
  12. 刺穿底部 500 µL 用18号针头将两根骨放入微型离心管中，并将该管置于装有1.5 mL离心管的容器中 400 µL PBS溶液。
  13. 将离心管在 10,000 x g 1 分钟 4 °C1.5 mL 离心管底部可见细胞沉淀；所有沉淀均为骨髓细胞，而骨髓基质则混悬于 PBS 中。将全部上清液（骨髓基质）吸出至另一储存管中，液氮速冻后于 -80 °C.
  14. 用剪刀在横膈膜水平、胸腔下方做一横向切口，沿胸骨纵轴剪开胸骨，以暴露肺和心脏。
    注意：如有进一步分析需要，可在此处用生理盐水进行全血清除。
  15. 收集所有用于生物分子和组织学分析所需的器官，称重后将其切成较小的组织块，以便后续进行生物分子分析。器官切分后，立即将所有试管在液氮中速冻，随后于 -80 °C.
  16. 对于心脏，将心尖与心脏上部分离后置于盛有OCT包埋剂的塑料模具中。将组织放入OCT包埋剂后，先置于冷异戊烷中，再用液氮速冻，并于-80 °C保存。80 °C.

6. 统计分析

注意：所有统计分析和图表均使用统计与绘图软件完成，并遵循统计指南建议42。

  1. 数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
  2. 所有分数缩短率图表应使用相同的比例尺。
  3. 每个图表上均需显示每个独立的实验单位（小鼠）。
  4. 采用Shapiro-Wilk检验评估各实验组数据分布的正态性，显著性水平α设为 p = 0.05。
  5. 两组间比较时，根据数据分布的正态性选择使用Welch检验或Mann-Whitney检验（若两组数据均呈正态分布，则使用Welch检验；若一组或两组数据为非正态分布，则使用Mann-Whitney检验）。选择双尾检验，置信水平设为95%。
  6. 在某一特定时间点对两组以上进行比较时，同样需按照步骤6.4判断各组数据分布是否正态。若分布呈正态，采用单因素方差分析（ANOVA），并使用Holm-Sidak法进行多重比较校正。
    注意：若分布非正态，则应采用Kruskal-Wallis检验，并使用Dunn法进行多重比较校正。以0.05作为整体显著性阈值（family-wise alpha threshold）来判断显著性。
  7. 对于纵向数据，采用重复测量的双因素方差分析（ANOVA），并使用Sidak法进行多重比较校正，以检验特定时间点的组间差异。整体显著性阈值（family-wise alpha threshold）设为0.05以判断显著性。

结果

本方案，如图所示 图1A，是一项为期5周的实验方案，最终形成以下实验分组：非荷瘤且无多西环素处理小鼠、非荷瘤但多西环素处理小鼠、荷瘤且无多西环素处理小鼠，以及荷瘤且多西环素处理小鼠。若同时使用两种性别的小鼠，分组数量可相应加倍。在开始多西环素（Dox）处理前的前2周肿瘤生长期，当向小鼠体内注射200,000个细胞后，足以使肿瘤充分生长th 动物的左侧乳腺图1B通过轻轻注射肿瘤细胞悬液，在乳头下方出现气泡即可确认皮下注射成功（图1C). 表1 简要总结了每种小鼠品系实验方案的关键参数，以及下文将讨论的主要结果。

图2A 图中所示为一只无肿瘤小鼠（左侧）和一只荷瘤小鼠（右侧）注射荧光素酶底物（luciferin）后，采集5分钟光子信号所获得的生物发光信号的代表性图像。该分析要求肿瘤表达荧光素酶基因（luciferase gene），以便在注射荧光素后产生光子信号。总共对33只注射4T1Luc细胞的Balb/c小鼠进行了为期11天的生物发光监测，同时设置了9只对照小鼠。 图2B 证实肿瘤生长迅速，但信号强度在第8天后开始趋于平稳，且与雄性Balb/c小鼠相比，雌性Balb/c小鼠的肿瘤在早期似乎生长更快，如图所示 图 2C. 45只Balb/c小鼠中仅1只在5周后未出现肿瘤，而所有C57Bl/6J小鼠在5周后均出现肿瘤（图 2D).

图3A  和 图3B 证明多柔比星（Dox）的累积剂量减少可改善给药开始后3周的生存率：在荷瘤Balb/c小鼠中，24 mg/kg剂量下无一存活，而在16 mg/kg剂量下有50%存活。然而，荷瘤C57Bl/6J小鼠对Dox的耐受性更强，即使在24 mg/kg剂量下仍表现出更高的生存率，因为 >80%的患者在化疗开始后能存活3周图3D）。性别对结果有重要影响：在Balb/c小鼠中，雌性小鼠的存活率明显高于雄性小鼠（29只雌性中有16只存活，而16只雄性中仅有3只存活）。 图3C 展示了接受16 mg/kg多柔比星（Dox）的Balb/c小鼠中的性别差异（由于雄性数量较少，未进行统计学检验）。在C57Bl/6J小鼠中，两性之间的生存率无统计学显著差异（见 图3E).

通过超声心动图在多柔比星治疗前评估的小鼠心脏功能健康的代表性图像如图所示 图4A，以及一例阿霉素处理后出现心脏功能障碍的小鼠图像如图所示 图4B. 在经24 mg/kg阿霉素治疗的17只荷瘤C57Bl/6J小鼠中，通过M型超声测量的FS在治疗两周后显著下降（治疗前为59.3%） 与 44.3% 脱离多西环素后， p < 0.0001, 图 4C）。12只存活小鼠中仅有1只（8%）未达到预设的心脏毒性标准。心率从多柔比星处理前的623次/分钟略微但显著地降低至处理后的569次/分钟（p < 0.05, 图 4D）。M型超声所测量的所有参数均可在 补充表3。

通过宏观和微观分析可确认阿霉素的心脏毒性作用。图6A、B显示，在少数存活的荷瘤雌性Balb/c小鼠中，阿霉素处理后绝对心脏重量显著降低，但将心脏重量标准化为总体重后仅呈现下降趋势。在非荷瘤C57Bl/6小鼠的实验中，24 mg/kg阿霉素处理启动一周后，可诱导心脏mRNA发生预期变化：Atrogin 和 Murf1 上调，提示萎缩倾向；NQO1 上调，提示氧化应激增强；Bax 上调，提示促凋亡状态（图6C–F）。

图5A 是肿瘤间质液采集流程的示意图。图5B 显示了所收集液体的代表性图像：获得的体积较小。

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图1：实验方案的代表性示意图。（A）实验方案的示意图概览。由BioRender制作（许可证编号 JE29USE7LU）。（B）皮下肿瘤接种的示意图。由BioRender制作（许可证编号 SO29JHW7R6）。（C）成功皮下肿瘤植入的示意图。由BioRender制作（许可证编号 SO29JHW7R6）。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：生物发光成像与肿瘤植入率。（A）对照小鼠（左）和荷瘤小鼠（右）的代表性生物发光图像。（B）随时间变化的生物发光信号（均值 ± 标准误；重复测量双因素方差分析 [ANOVA]；*P < 0.05）。（C）雄性和雌性 Balb/c 小鼠之间生物发光信号的比较（均值 ± 标准误）。（D）两种小鼠品系的肿瘤植入成功率。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：荷瘤小鼠的生存分析。（A）经24 mg/kg阿霉素（Dox）处理的Balb/c小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。（B）经16 mg/kg Dox处理的Balb/c小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。（C）比较经16 mg/kg Dox处理的雄性和雌性Balb/c小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。由于雄性小鼠数量有限，未进行统计学分析。（D）经24 mg/kg Dox处理的C57BL/6J小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。（E）比较经24 mg/kg Dox处理的雄性和雌性C57BL/6J小鼠的Kaplan–Meier生存曲线（log-rank检验，P = 0.86）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：阿霉素诱导的心脏毒性超声心动图评估。（A）健康小鼠的代表性M型超声心动图。（B）阿霉素诱导心脏毒性小鼠的代表性M型超声心动图。（C）C57BL/6J小鼠在阿霉素处理前及处理后14天的短轴缩短率（FS）。（D）C57BL/6J小鼠在阿霉素处理前及处理后14天的心率（HR）。数据来自 n = 17 只小鼠。统计学比较采用Welch's t-test。*P < 0.05；****P ≤ 0.0001。缩写：FS，短轴缩短率；HR，心率。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图 5：器官取样流程。（A）肿瘤间质液采集流程的示意图。使用 BioRender 制作（许可证编号：HV29USD91R）。（B）器官取样过程中采集肿瘤间质液的代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6阿霉素诱导的心脏毒性. (A) 荷瘤Balb/c小鼠在开始16 mg/kg阿霉素治疗3周后的心脏重量测量。B) 荷瘤Balb/c小鼠经16 mg/kg阿霉素治疗3周后，以心脏重量与总体重的比值进行标准化。C) C57BL/6J 小鼠在开始接受 24 mg/kg 阿霉素治疗 1 周后心肌中 Atrogin mRNA 的表达水平。D) C57BL/6J小鼠在开始接受24 mg/kg阿霉素治疗1周后心肌中Murf1 mRNA的表达。E) C57BL/6J 小鼠在开始接受 24 mg/kg 阿霉素治疗 1 周后心肌组织中 NQO1 mRNA 的表达水平。 (F) C57BL/6J小鼠在开始接受24 mg/kg阿霉素治疗1周后心肌中BAX mRNA的表达水平。统计分析采用Welch's t检验。 t检验 或根据数据分布情况选用 Mann–Whitney U 检验。ns， P > 0.05; *P < 0.05；**P < 0.01. 请点击此处查看此图的放大版本。

小鼠品系Balb/cC57Bl/6J
使用的细胞系4T1LucPY8119
注射细胞数量200 000200 000
使用的性别雄性和雌性雄性和雌性
注射天数46
每日剂量4 mg/kg4 mg/kg
累积阿霉素剂量16 mg/kg24 mg/kg
氯胺酮剂量40 mg/kg80 mg/kg
心脏毒性发生率>90%>90%
存活率19/4516/19

表1：各小鼠品系的关键实验方案参数。Balb/c 与 C57BL/6J 小鼠实验方案中使用的主要实验变量和试剂浓度的比较。

补充表 1：动物福利终点指标。 请点击此处下载该文件。

补充表 2：4T1 实验方案的文献综述。 请点击此处下载该文件。

补充表3：采用M型超声心动图测量的17只接受24 mg/kg阿霉素治疗的荷瘤C57BL/6J小鼠的心脏超声参数。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文建立了一种乳腺肿瘤荷瘤小鼠中由阿霉素诱导的心脏毒性模型，该模型被认为对未来的心血管肿瘤学研究具有重要的临床相关性。研究目的是模拟患者从因确诊癌症入院直至接受潜在心脏毒性化疗这一临床过程。该实验方案采用实用化设计，并使用全球范围内均可获得的免疫功能健全小鼠，从而便于其他研究团队在不同实验室中重复该方案。由于其高肿瘤植入成功率，该模型有望成为未来心血管肿瘤学毒性研究的理想候选模型。

本方案中常见的问题包括对心率较低的小鼠进行超声心动图检查，这可能导致射血分数（FS）的人为偏低。在进行超声心动图评估前，让小鼠从麻醉剂最初的负性变时效应中恢复，有助于确保FS测量的准确性。在Balb/c小鼠中，如果死亡率仍然较高，可能需要进一步降低麻醉剂量。整个研究过程中应由同一实验人员完成所有超声心动图评估，因为不同观察者之间的变异性可能显著43。在肿瘤接种过程中，注射时回撤注射器可能形成条带状肿瘤，其体积可能大于正确注射方式产生的肿瘤。准确注射至目标乳腺乳头也至关重要，因为若误注入腹部上方乳头，可能在肿瘤发育后期干扰超声心动图的评估。建议在注射前对细胞悬液进行人工计数，并充分混匀，以确保每只小鼠接种的细胞数量相近，从而在实验结束时最小化肿瘤大小的差异。当需要每周采集血液样本时，应严格控制采血量，因为小鼠在接受阿霉素治疗后会变得更加脆弱。建议每次采血时间点的总血量不超过50 µL，采血量过大可能增加实验过程中的死亡率。采血频率和采血量还应符合当地的动物伦理要求及机构动物设施的指导原则。采血后通过皮下注射等量生理盐水补充所采血液体积，有助于补偿采血引起的体液丢失。

为了比较这种多柔比星（Dox）处理方案，最近发表的一篇关于AIC动物模型的综述指出，大多数临床前研究（88%）采用多次注射多柔比星，并在数周后进行结局评估（通常通过超声心动图）29。大多数文章报道使用了C57Bl/6J品系（73.8%），这可能归因于其较强的适应性和较低的成本29。遗憾的是，大量研究在注射蒽环类药物（ACs）前忽视了肿瘤对动物生物学特性的影响17,29。在736项研究中，仅有46项报道使用了荷瘤模型，其中12项在Balb/c小鼠中使用了4T1细胞系（类三阴性乳腺癌），仅有一项是在C57Bl/6J小鼠中建立的乳腺癌模型（更具体地说是类EGFR2阳性乳腺癌）29。另一项研究虽在C57Bl/6J小鼠中使用了类EGFR-2阳性乳腺癌模型，但在化疗开始前未允许肿瘤充分生长，这限制了该模型的转化应用价值32。

使用免疫缺陷小鼠的异种移植模型虽可采用人类肿瘤细胞系，但缺乏功能性免疫系统，这限制了对免疫介导心脏毒性机制的研究，尤其在免疫检查点抑制剂相关心脏毒性日益重要的背景下，成为主要局限。大型动物模型在肿瘤心脏病学领域正逐渐兴起，但始终存在成本高昂和基因工程操作能力有限等缺点。44. 体外 以及基于人源细胞的二维/三维系统（例如，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏类器官）可实现高通量的机制性与毒理学筛选，但无法重现整体生物体水平的整合生理功能（如血流动力学、神经激素调节、免疫相互作用），而这些功能可由 体内 模型相比，这种同基因型、免疫健全且荷瘤的模型在研究肿瘤负荷与化疗诱导的心脏毒性之间相互作用时，提供了更具临床相关性的研究背景，但其代价是生物变异性更大，某些品系的小鼠死亡率更高，通量低于更简单的模型。 体外 或非荷瘤 体内 模型

迄今为止，大多数研究使用的非荷瘤AC心脏毒性模型具有高可重复性、低成本以及更易于进行超声心动图和生存评估的优点，但这类模型无法反映肿瘤负荷、癌症相关性炎症及恶病质对心脏的全身性影响，而这些因素正日益被认识到是患者心脏毒性的重要混杂因素17,45。此外，心脏的代谢重编程及其收缩功能可能受到肿瘤分泌的癌代谢物（如D-2-羟基戊二酸或琥珀酸）的影响而发生改变14。因此，若要构建用于多组学（例如蛋白质组学和代谢组学）心脏生化分析的心脏肿瘤学模型，化疗前存在肿瘤是必不可少的条件。目前也有部分证据表明，肿瘤本身即可诱发明显的心功能障碍，尽管这一结论在文献中尚不一致。一些模型显示肿瘤接种对短轴缩短率（FS）或电传导参数具有不利影响，而另一些研究则发现肿瘤的存在可保护小鼠免受横主动脉缩窄诱导的心脏重构11,13,46。然而，根据初步假设的不同，非荷瘤动物模型仍然是必要的。它们是唯一能够将化疗药物对心脏的直接毒性作用与肿瘤本身的混杂影响相分离的实验体系，这对于确立因果关系并阐明药物特异性的作用机制至关重要。这些动物将作为对照，用于评估抗癌治疗本身及其与肿瘤相互作用对心脏毒性的影响。若缺乏此类对照，将无法区分所观察到的心脏表型中哪些部分归因于药物、哪些归因于肿瘤本身，或二者之间的相互作用。这种区分不仅对机制理解至关重要，也对心脏保护策略的合理设计具有重要意义。因此，必须认识到，上述每种模型均针对不同且互补的科学问题，单独任一模型均不足以全面再现临床心脏肿瘤学的复杂性；通常需要联合或序贯使用两种模型，才能得出可靠且具有转化价值的机制性结论。

根据2022年欧洲心脏病学会（ESC）心血管肿瘤学指南，本方案将心脏毒性定义为：与癌症治疗相关、无症状的中度心脏功能障碍，表现为左心室射血分数（LVEF）降低 >左室射血分数在40%至49%之间占10%16然而，准确的左心室射血分数（LVEF）定量需要超声设备配备3D模块39为避免对心脏收缩功能的错误评估，并保持实验方案的简洁性以便在使用较早期超声设备的实验室中实施，本研究优先选择短轴缩短率（FS）作为心功能障碍的指标。该指标可通过M型超声在小鼠中准确且便捷地获得，其测量标准与欧洲心脏病学会（ESC）规定一致。采用本方案后，90%存活小鼠均符合心脏毒性标准，表明该模型是未来转化研究的有力候选。多柔比星（Dox）的心脏毒性效应已在Balb/c小鼠中通过大体解剖评估（心脏重量减轻）得到证实。本研究未设置C57Bl/6小鼠的单纯肿瘤对照组，因此该品系中尚无相关比较数据。此外，在无肿瘤的C57Bl/6小鼠中，Dox剂量所诱导的改变与既往关于蒽环类药物心脏毒性机制的文献报道一致，表现为心肌萎缩加重、氧化应激增强以及细胞凋亡增加。19,20.

然而，由于技术原因，本研究未对患者中较新的指标（如斑点追踪全局纵向应变（GLS））进行量化。如果条件允许，量化GLS将具有额外价值，因为该指标通常被认为更敏感，可用于检测早期心脏损伤23。循环心脏生物标志物（如肌钙蛋白）也可用于提高心脏毒性检测的可靠性；然而，传统小鼠分析这些指标所需的血浆量可能受限，因为小鼠的总血容量较低。此外，多柔比星（Dox）处理后小鼠体质虚弱，可能增加采血期间或采血后的死亡率。最后一个限制因素是这些检测方法对相关生物标志物的灵敏度，这常常影响结果的解读。

尽管所有超声检查均由同一位经验丰富的实验人员完成，但在未接受治疗的情况下，同一批 Balb/c 小鼠仍表现出较高的周间变异。这可能是由于该品系对氯胺酮麻醉较为敏感所致47。事实上，最初观察到麻醉过程中的高死亡率，导致进入实验终点的小鼠数量较少，因此将 Balb/c 小鼠使用的氯胺酮剂量从 80 mg/kg 降低至 40 mg/kg。观察接受多柔比星（Dox）处理的 Balb/c 小鼠的生存曲线可以发现，部分死亡发生在麻醉时（每周进行超声心动图检查），但大多数死亡发生在动物设施中且无任何主动操作，这表明 Dox 是导致这些小鼠死亡的主要因素。然而，在比较两种或多种品系的生存曲线时，仍需注意麻醉相关死亡的影响。为降低麻醉相关死亡风险，也可对清醒状态的小鼠进行超声心动图检查，但这需要在将小鼠纳入实验方案前进行训练和适应性驯化。关于 Dox 处理，即使在降低剂量后，仍有近一半的 Balb/c 小鼠未能完成整个实验流程。可尝试使用更低剂量的 Dox 诱导心脏毒性，但存在达到心脏毒性标准的小鼠数量减少的风险。另一种策略是在每次注射 Dox 后延长动物恢复时间，本研究未采用此方法，但已有文献报道该方法可改善生存率29。

在构建该模型过程中观察到，Balb/c小鼠对多柔比星（Dox）的敏感性高于C57Bl/6J小鼠，且雌性小鼠对Dox的耐受性高于雄性小鼠，这些结果与既往文献报道一致29。此外，在两种小鼠品系中获得的相似且可重复的结果进一步证实了该模型的稳健性。通过在较短时间内给予中等偏高的每日剂量以达到较高的累积剂量，实现了高发生率的心脏毒性同时保持高存活率。在C57Bl/6J小鼠中建立乳腺癌模型（PY8119为类三阴性乳腺癌）将对后续研究具有重要意义，因为该品系是转基因模型主要的遗传背景之一34。肿瘤接种的高成功率也表明所选注射方法有效，对该模型的应用前景有利。同时，这些小鼠对Dox的高耐受性为开展更长期的研究提供了可能，例如进行Dox再激发实验，以模拟临床上常见的继发性肿瘤或转移情况。最后，器官取材方案可系统性收集所有实体器官、肿瘤及其间质液，以及骨髓及其基质，从而实现对该模型的全面深入分析。

该模型存在一些局限性。由于其务实的设计以及为避免侵入性手术，通过皮下注射无法精确控制肿瘤的位置（例如，准确位于乳腺组织而非皮下脂肪），而肿瘤位置可能因所研究的科学问题不同而具有重要意义48。如果需要精确的癌症部位注射，可能更适合采用更为复杂的手术方法进行原位注射，尽管这种操作的重要性主要体现在计划对肿瘤进行生化分析时，因为在肿瘤体积、潜伏期和发生率方面，不同注射方法所得结果相似48。此外，有人可能会指出，仅使用蒽环类药物（ACs）与临床实际情况并非完全一致，因为在临床上患者通常接受联合治疗方案，例如环磷酰胺或多西他赛。这确实可能是本方案下一步的改进方向；然而，针对每种化疗药物的剂量调整需谨慎进行。此外，Balb/c小鼠在多柔比星（Dox）治疗开始3周后死亡率仍超过50%，这一比例非常高；降低剂量可能有助于提高生存率，但或许会以减弱心脏毒性表现为代价。同时，关于本模型所使用的剂量，应注意这些剂量高于目前人类临床常用的剂量，这可能限制该模型的转化应用潜力。

披露

作者声明本稿件不存在利益冲突。

致谢

感谢动物设施团队在动物福利日常监测方面提供的帮助。感谢Léanne Borges、Elias Ait Assa和Clémence Chabaud在动物实验方案制定过程中给予的支持。感谢法国国家健康与医学研究院（INSERM）第932研究单位的Julie Helft博士惠赠PY8119细胞。特别感谢Sylvain Provost博士及其学生Mel Gavens在生物发光检测方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4T1Luc 细胞ATCCCRL-2539
多柔比星粉末Cliniscience23214-92-8
超声心动图仪Visual SonicsVEVO LT-200
荧光素Perkin Elmer E1605
尼龙筛网MerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
PY8119 细胞由 Julie Helft 博士惠赠

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