使用激光散斑对比成像对人类皮肤微循环进行系统性微血管功能标准化评估的方案

摘要

本方案描述了一种标准化、非侵入性的方法，用于在临床研究环境中利用激光散斑对比成像结合药理学离子导入和生理刺激，评估人体皮肤微循环中的系统性微血管功能。

摘要

激光散斑衬比成像（LSCI）是一种高分辨率、非侵入性的光学技术，可实现微血管血流灌注的实时、全场可视化。本实验方案提供了一种利用LSCI评估人体皮肤微循环系统性微血管功能的标准化方法。由于该技术获得的测量结果对环境和生理干扰因素高度敏感，本方案强调严格的标准化操作流程，以提高实验的可重复性和可靠性。方案详细说明了必要的环境控制措施，包括将室温稳定控制在23°C ± 1°C、受试者的体位安排、适应性调节程序，以及在图像采集过程中尽量减少外界干扰。该方法结合LSCI与两种辅助性激发试验，用于评估皮肤微血管反应性。其中，缺血后反应性充血用于评估整体微血管反应性，而离子导入介导的药理学刺激则用于评估内皮功能。具体而言，使用乙酰胆碱（Acetylcholine）评估内皮依赖性血管舒张功能，使用硝普钠（sodium nitroprusside）评估内皮非依赖性血管舒张功能。本逐步可视化实验方案旨在促进标准化LSCI方法在临床及转化研究中的推广应用。该方法已成功应用于多种临床状况下微血管功能障碍的识别，包括难治性高血压、糖尿病和冠状动脉疾病。通过实现对微血管反应性的可重复、非侵入性评估，该技术为系统性血管健康的研究、疾病进展的监测以及针对微血管系统的干预措施疗效评价提供了有力工具。

引言

本实验方案的主要目标是提供一种标准化、可重复的方法，用于评估系统性微血管功能及反应性，该方法结合激光散斑对比成像技术（LSCI）与生理学和药理学激发操作。微循环由终末血管——直径小于约100 µm的微动脉、毛细血管和微静脉——组成¹，是代谢交换的主要场所，也是外周血管阻力的关键决定因素²。这些小血管中的内皮功能障碍通常早于大血管结构改变，是高血压、糖尿病和冠状动脉疾病等心血管疾病的早期生物标志物³。重要的是，尽管微血管功能受损在终末器官损伤中起着重要作用，但它是在多因素疾病过程中与大血管动脉粥样硬化及系统性慢性炎症共同作用的结果。因此，在转化医学研究中，对微血管反应性进行无创评估对于早期诊断和治疗效果监测均至关重要⁴。

利用皮肤微循环作为全身血管健康替代指标的依据在于其易于获取，并且能够代表整体内皮功能的一个观察窗口^5,6。传统上，激光多普勒血流仪（LDF）被认为是无创皮肤评估的金标准⁷。然而，LDF受限于空间分辨率较差，因其提供的点式测量结果对皮肤灌注固有的异质性高度敏感⁸。相比之下，激光散斑成像（LSCI）具有显著优势，可实现对组织灌注的全场、实时可视化，且具有高时间分辨率和空间分辨率⁹。通过分析激光散射产生的干涉图样，LSCI能够在无需物理接触或外源性染料的情况下，同时评估多个血管区域^10,11。

在更广泛的研究文献中，激光散斑衬比成像（LSCI）与离子电渗疗法驱动的药理学刺激（如乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP））相结合，已被证实为评估内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张通路的一种可靠方法^12,13。此外，缺血后反应性充血（PORH）可综合评估涉及内皮介质、神经源性感觉神经以及血管平滑肌功能的微血管反应性¹²。尽管该方法具有诸多优势，但LSCI对环境和生理变异的高度敏感性要求必须实施严格的标准操作程序。本方案通过详细说明关键的环境控制措施，包括将室温稳定控制在23°C ± 1°C以及标准化的受试者体位，以提高个体内部和个体之间的可重复性¹⁰。该方法适用于临床和转化研究人员，为其在不同患者群体中研究微血管病理生理学提供一种方法学严谨、无创的技术手段。

方案

所有涉及人类参与者的操作均遵循巴西国家心脏病研究所（卫生部）的伦理标准，符合国家法规（根据2024年5月第14,874号法律设立的国家研究伦理委员会——INAEP）以及《赫尔辛基宣言》（2024年修订版）。

1. 受试者准备与环境控制

1. 稳定检测环境
   1. 使用专用恒温器将检测室温度（室温；23°C ± 1°C）保持稳定，以维持恒定的热环境。
   2. 每10分钟使用经校准的数字温度计（精度±0.1°C）监测一次室温。
      ​注意：皮肤微血管功能对温度波动高度敏感。
2. 检测前准备受试者
   1. 指导受试者在检测前24小时内避免吸烟、摄入咖啡因或酒精，以及进行剧烈运动。
   2. 指导受试者在检测前至少禁食2小时，但可饮水。
      ​注意：禁用咖啡因和避免剧烈运动可最大程度减少对外周皮肤血管张力的干扰。咖啡因作为腺苷受体拮抗剂，而运动则通过影响交感神经活性和体温调节，均可引起微血管反应性的持续改变，这种影响在暴露后数小时内仍可存在^4,14。
3. 为图像采集安置受试者体位
   1. 使用体位垫将受试者的非优势手臂置于与心脏水平的位置，使前臂保持水平且稳定。
   2. 以前臂掌侧作为检测部位。
      注意：选择非优势前臂可最大程度减少因日常活动引起的侧化性血管重塑影响。前臂掌侧具有利于光学成像的解剖特征，包括较低的毛发密度和较薄的皮肤厚度，从而减少信号伪影，并提高离子电渗给药的可重复性。
4. 允许心血管系统稳定
   1. 在开始微血管记录前，让受试者静息至少20分钟。
   2. 在静息期间，禁止受试者说话、移动被检测肢体或使用电子设备。
      ​注意：该稳定期可最大程度减少基线数据采集前的自主神经和心血管波动。
5. 减少运动伪影
   1. 将受试者非优势前臂置于真空固定垫系统上。
   2. 调节垫子，使前臂掌侧在整个图像采集过程中保持稳定且水平的位置。
6. 准备皮肤表面
   1. 选择无可见毛发的皮肤区域进行所有测量。
   2. 必要时，在检测前24小时使用外科剪毛器去除毛发。
      ​警告：不得使用剃刀脱毛，因为皮肤刺激可能干扰微血管测量结果。
7. 测量动脉血压
   1. 根据受试者上臂周长选择合适的袖带尺寸。
   2. 使用经校准的自动示波法血压测量仪，连续进行三次血压测量，每次间隔1分钟。
   3. 舍弃第一次测量值，取后两次测量的平均值作为平均动脉压（MAP），依据ESC/ESH和AHA心血管指南。

2. LSCI 系统设置与软件配置

1. 准备激光散斑对比成像（LSCI）系统
   1. 在图像采集前至少10分钟开启LSCI系统，以确保激光光源达到稳定状态。
   2. 在开始记录前，通过软件状态指示器确认激光已稳定。
2. 定位激光探头
   1. 将激光探头置于受试者前臂正上方。
   2. 使用制造商提供的测距工具，将激光探头调整至距离皮肤表面恰好15 cm的位置（图1A）
      注意：保持固定的采集距离可确保最佳图像聚焦，并在不同受试者之间获得一致的视野范围。
3. 配置图像采集软件
   1. 启动图像采集软件，并创建新的研究文件。
   2. 输入受试者的人口统计学信息以及先前计算的平均动脉压（MAP）。
      ​注意：如适用，应在补充材料中包含详细的软件操作说明和代表性截图。
4. 设置采集参数
   1. 将采集采样率设为每秒1帧（1 Hz）。
   2. 将目标采集区域的空间分辨率调整至约0.1 mm/像素。
      ​注意：1 Hz的采样率在时间分辨率与信噪比之间提供了适当平衡，同时足以充分捕捉充血反应和药理学反应的动力学特征。
5. 减少环境光干扰
   1. 根据系统要求，在图像采集前执行背景噪声检测或暗场校正。
   2. 若无法进行暗场校正，则在所有记录过程中调暗室内灯光，并使用遮光窗帘阻挡外部日光。
      注意：标准化的环境光照条件可最小化光学干扰，提高信号的可重复性。
6. 定义感兴趣区域（ROIs）
   1. 在采集软件的实时预览界面上创建至少三个面积约为80 mm²的圆形感兴趣区域（ROIs）。
   2. 将其中两个ROIs置于离子导入电极位置，另一个ROI置于PORH评估部位。
   3. 所有ROIs应位于前臂掌侧，距离肘窝远端约5 cm处，并避开可见的浅表静脉。
      ​注意：标准化ROI面积可减小皮肤灌注空间异质性的影响，并降低与药物递送腔室相关的边缘伪影。
7. 采集基线灌注数据
   1. 在血管刺激前，连续记录5分钟静息状态下的皮肤血流灌注。
   2. 监测实时灌注信号，确认基线采集期间无运动引起的信号尖峰。
   3. 将基线稳定性定义为在连续2分钟时间区间内，灌注信号波动小于<10%。
8. 启用皮肤血管导纳（CVC）分析
   1. 将受试者的平均动脉压（MAP）输入采集软件中。
   2. 在软件设置中启用CVC的自动计算功能。
9. 记录灌注与导纳数据
   1. 配置软件通过将实时灌注值（APU）除以MAP，自动计算CVC。
   2. 在整个实验过程中同步记录原始灌注单位（PU）和计算得到的CVC值。
      
      注意：将微血管灌注表示为CVC可最小化系统性血压波动的混杂影响，从而实现对具有不同血流动力学特征的受试者之间更可靠的比较。

图1。采用激光散斑对比成像（LSCI）结合离子导入法评估皮肤微血管灌注的实验装置。（A）利用激光散斑对比成像和血管扩张剂离子导入法进行皮肤微血管功能评估的典型实验装置示意图。（B）经皮离子导入递送累积剂量乙酰胆碱（ACh）过程中典型的微血管灌注反应。（C）ACh离子导入的代表性图像。（D）含载剂的对照电极的代表性图像。标签所示部件分别为：（1）成像探头；（2）离子导入给药电极；（3）分散电极。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 离子导入与药理学激发

1. 准备皮肤以进行离子导入
   1. 使用无酒精的生理盐水溶液或温和的皮肤清洁剂清洁选定的前臂掌侧皮肤区域。
   2. 在放置电极前轻轻拍干皮肤。
      ​注意：皮肤准备过程中应避免过度机械刺激，因为机械诱导的血管扩张可能干扰基线测量。
2. 定位药物递送电极
   1. 使用双面粘性圆盘将两个药物递送电极固定在已准备好的皮肤部位（图1A）。
   2. 保持电极间距离约为5 cm，以防止电流干扰。
3. 配制乙酰胆碱（ACh）溶液
   1. 向第一个电极室中加入200 µL用0.9%生理盐水配制的2% ACh溶液^14,15。
   2. 使用ACh电极评估内皮依赖性血管扩张。
      ​注意：所选药物浓度已优化，可在诱导显著的剂量依赖性微血管反应的同时，最大限度减少非特异性刺激和电化学伪影。
4. 配制硝普钠（SNP）溶液
   1. 向第二个电极室中加入200 µL用0.9%生理盐水配制的2% SNP溶液。
   2. 使用SNP电极评估内皮非依赖性血管扩张。
      警告：SNP对光敏感。应使用铝箔避光保存，并在配制后4小时内使用，以维持其药理稳定性。
      ​注意：所选SNP浓度有助于实现稳定的平台期血管扩张，同时最大限度减少非特异性电效应。
5. 去除滞留的气泡
   1. 在将电极贴附于皮肤前，检查电极室内是否存在滞留气泡。
   2. 通过轻敲电极室或使用无菌塑料注射器尖端去除可见气泡。
      注意：气泡可能阻碍电流通过，导致药物递送不均。
6. 定位参考电极
   1. 使用导电凝胶或粘合剂，将参考（中性）电极置于距离药物递送电极近端约15 cm处（图1A）。
   2. 在启动离子导入前确认电极接触稳定。
      注意：药理学评估区域与PORH评估区域的空间分离可最大限度减少干扰效应，并防止ACh诱导的轴突反射红斑与PORH测量区域重叠。
7. 连接离子导入系统
   1. 在施加电流前，将所有电极连接至离子导入递送装置。
   2. 在启动实验方案前确认电极极性（ACh为阳极；SNP为阴极）。
      ​警告：电极极性错误可能影响药物递送效率并改变血管反应。
8. 执行离子导入电流方案
   1. 对两种药理学试剂均施加六个递增电流剂量：30、60、90、120、150 和 180 µA。
   2. 每个电流剂量持续施加10秒。
      ​注意：递增电流方案可用于构建剂量-反应曲线，便于评估微血管敏感性和平台期反应¹¹。低电流强度与短刺激间隔的结合可最大限度减少非特异性电致血管扩张。
9. 维持刺激间间隔
   1. 连续电流施加之间保持60秒的间隔。
   2. 在剂量间的稳定期内监测灌注信号。
      ​注意：所选间隔允许微血管反应充分稳定，同时维持局部药物递送而不产生全身效应。
10. 记录微血管反应
    1. 在整个离子导入刺激过程中持续记录微血管灌注信号。
    2. 在最后一次电流施加后继续记录至少10分钟，以捕捉最大平台期反应。典型的剂量依赖性反应见于图2A。

图 2。离子导入和闭塞后反应性充血（PORH）期间皮肤微血管灌注的代表性记录。（A）使用激光散斑对比成像（LSCI）在离子导入2%乙酰胆碱过程中获得的皮肤微血管血流灌注代表性记录，采用递增阳极电流（30、60、90、120、150和180 µA）进行，每次持续10秒，间隔1分钟。（B）在PORH评估期间获得的代表性记录。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 闭塞后反应性充血（PORH）

1. 放置阻塞袖带
   1. 将一个标准的气动袖带（宽度约为 12 cm）放置在用于 LSCI 记录的同一肢体的上臂部位。
   2. 将袖带置于选定的微血管评估部位的近端。
2. 定义 PORH 评估区域
   1. 在前臂掌侧、离子导入电极位点附近创建第三个感兴趣区域（ROI）。
   2. 将 ROI 置于无药物处理的皮肤区域，以避免药理学干扰。
      ​注意：保持药理学刺激位点与 PORH 评估区域之间的空间分离，以确保血管反应的独立性。
3. 获取 PORH 基线记录
   1. 在动脉阻塞前连续记录 5 分钟的静息皮肤灌注。
   2. 监测基线灌注信号，确认袖带充气前信号稳定。
4. 诱导动脉阻塞
   1. 使用自动充气装置或手动充气球，在 < 5 秒内迅速充气袖带。
   2. 将袖带压力升高至比受试者先前测得的收缩压（SBP）高 50 mmHg 的水平。
      ​警告：在开始阻塞期前需确认完全动脉阻塞，因为不完全阻塞可能影响充血反应。
5. 维持阻塞期
   1. 持续维持动脉阻塞，时间精确为 3 分钟。
   2. 通过确认 LSCI 信号下降至生物学零值平台期（< 10 APU）来验证完全阻塞。
      ​注意：生物学零值信号反映了与定向血流无关的血细胞残余运动，包括布朗运动。
6. 释放阻塞袖带
   1. 使用快速排气阀瞬时释放袖带压力。
   2. 允许血流立即恢复，以启动反应性充血反应。
7. 记录充血反应
   1. 在袖带释放后继续 LSCI 记录至少 5 分钟。
   2. 捕捉峰值灌注反应以及随后向基线灌注水平恢复的过程。典型的 PORH 反应见 图 2B。
8. 量化 PORH 反应
   1. 在图像采集软件中计算峰值 CVC。
   2. 使用分析软件计算充血反应信号的曲线下面积（AUC）。

5. 数据提取与统计分析

1. 打开并验证记录的数据
   1. 使用图像分析软件打开记录的采集文件。
   2. 验证所有预定义的感兴趣区域（ROI）是否仍正确位于相应的测量位点上方。
      ​注意：仅当运动伪影或采集漂移影响原始位置时，才重新调整 ROI 位置。
2. 定义分析区间
   1. 在灌注和 CVC 趋势图上确定特定的分析区间。
   2. 选择首次血管刺激前紧邻的连续 60 秒基线区间。
   3. 选择离子导入刺激后每个 60 秒区间的最后 30 秒，以捕捉微血管反应的平台期。
      注意：为最小化血管运动振荡和运动伪影对数据分析的影响，将基线稳定性定义为灌注信号的变异系数（CV）< 5%。
3. 识别 PORH 反应变量
   1. 在 PORH 协议的动脉闭塞阶段识别生物学零信号。
   2. 识别放气后立即出现的 CVC 峰值。
4. 计算区间平均值
   1. 使用图像分析软件计算每个预定义分析区间的平均 CVC 值。
   2. 在确认最终计算值前，验证无运动伪影存在。
5. 整理提取的数据
   1. 将平均原始 PU 值和平均 CVC 值导出或手动转录至结构化电子表格中。
   2. 根据研究组别和血管刺激类型（包括乙酰胆碱、硝普钠和 PORH 反应）整理数据集。
      ​注意：在整个数据处理过程中保持一致的文件命名和受试者识别代码，以最小化转录错误。
6. 计算次要血管结局指标
   1. 计算从基线灌注或 CVC 值上升的百分比，以确定血管反应性。
   2. 在需要进行次要终点分析时，计算曲线下面积（AUC）。
7. 进行统计分析
   1. 使用统计分析软件分析数据。
      注意：如适用，将代表性截图或基于软件分析的工作流程说明作为补充材料提供。
   2. 评估数据分布
      1. 使用 Shapiro-Wilk 检验评估数据正态性。
      2. 正态分布数据以均值 ± 标准差（SD）表示。
      3. 非正态分布数据以中位数和四分位距（IQR）表示。
   3. 比较微血管反应
      1. 当满足正态性假设时，使用独立样本 t 检验比较两组数据集。
      2. 使用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 事后检验比较多组数据。
   4. 定义统计显著性标准
      1. 将统计显著性定义为 p < 0.05。
      2. 对因运动伪影导致的缺失数据，采用成对删除法或从受影响分析中剔除。
         注意：在所有研究组中一致应用相同的缺失数据处理策略，以保持分析的完整性。

结果

成功应用本方案将获得稳定的基线，随后对每种血管刺激产生清晰且可区分的微血管反应。在技术成功的实验中，基线记录应显示稳定的灌注信号，波动极小，定义为标准差（SD）< 平均信号的10%。在乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）离子电渗过程中，预期出现APU的逐步升高，反映剂量依赖性血管扩张。成功的反应性充血（PORH）表现为动脉阻塞期间灌注迅速下降至稳定的生物学零值，随后在解除袖带压迫后立即出现显著的高灌注峰值，在健康受试者中通常达到基线水平的数倍。图1A展示了采用激光散斑衬比成像（LSCI）结合离子电渗进行皮肤微血管评估的实验装置。图1B–1D显示了典型的离子电渗反应及电极放置位置。图2A呈现了乙酰胆碱离子电渗过程中典型的剂量依赖性微血管反应，而图2B则展示了一个典型的PORH反应。

次优或技术上不成功的记录通...

讨论

激光散斑衬比成像（LSCI）提供了一种标准化且非侵入性的方法，可用于高空间和时间分辨率下评估系统性微血管功能。与仅限于单点测量且对皮肤灌注空间异质性高度敏感的激光多普勒血流仪（LDF）相比，LSCI能够实现全场成像，并对多个感兴趣区域（ROI）进行同步评估。这一特性显著提高了测量的可重复性，并降低了临床微血管研究中的变异系数。此外，LSCI的非接触特性最大限度地减少了探头类技术常伴随的局部压力伪影，从而提升了其在转化医学和临床研究中进行重复评估的适用性。

该方案的一个关键步骤是将灌注数据标准化为平均动脉压（MAP），以计算皮肤血管传导率（CVC）。由于皮肤血流灌注受全身灌注压的显著影响，单独解读原始APU值可能导致严重混杂，尤其是在血流动力学特征发生改变的人群中，例如高血压或血脂异常患者。因此，本方案建议同时报告原始PU值和标准化后的CVC值，以提高在不同生理和病理条件下对微血管功能的解读准确性。该方案的另一个关键环节是严格控制环境条件并保持受试者状态稳定，包括控制室温、尽量减少运动伪影以及采用标准化的受试者体位，这些措施对于获得可重复的记录结果至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>仪器设备
自动示波法血压监测仪	欧姆龙健康医疗	HEM-7120	用于基线平均动脉压（MAP）评估（3 次测量）
数字校准温度计	Delta OHM	HD2301.0	准确性 ± 0.1°用于室温监测的 C
分散（参考）电极	Perimed AB	PF 384	大表面积中性电极
药物递送电极	Perimed AB	PF 383 / LI 611	非侵入性离子导入室（约 80 mm²)
离子电渗电源控制器	Perimed AB	PeriIont 微血管诊断系统	双通道电流控制器（最高200） µA)
激光散斑对比成像（LSCI）系统	Perimed AB	PeriCam PSI NR	高分辨率血流灌注成像仪
医用级真空垫	AB Germa	N/A	用于将前臂稳定地置于心脏水平位置
单手操作真空泵	AB Germa	N/A	用于抽空真空垫内的空气
快速袖带充气器	D.E. Hokanson, Inc.	E20 快速袖带充气装置	用于标准化的3 min动脉阻断
<强>试剂与耗材
乙酰胆碱氯化物（ACh）	Sigma-Aldrich	A6625	2%浓度制备的内皮依赖性血管扩张剂
酒精消毒片	Becton Dickinson	326895	用于皮肤准备的70%异丙醇消毒垫
去离子水	Sigma-Aldrich	38796	用于电极的最终冲洗
氯化钠（0.9% 生理盐水）	本地供应商	N/A	药物配制和皮肤清洁用溶剂
硝普钠（SNP）	Sigma-Aldrich	S0501	2% 的非内皮依赖性血管扩张剂制备
无菌纱布	本地供应商	N/A	清洁后用于干燥皮肤表面
<强>软件
灌注分析软件	Perimed AB	PIMSoft	激光散斑衬比成像数据采集与感兴趣区域分析软件
统计分析软件	GraphPad Software	Prism 10	用于剂量-反应曲线拟合和曲线下面积（AUC）计算