使用激光散斑对比成像对人类皮肤微循环进行系统性微血管功能标准化评估的方案

摘要

本方案描述了一种标准化、非侵入性的方法，用于在临床研究环境中利用激光散斑对比成像结合药理学离子导入和生理刺激，评估人体皮肤微循环中的系统性微血管功能。

摘要

激光散斑衬比成像（LSCI）是一种高分辨率、非侵入性的光学技术，可实现微血管血流灌注的实时、全场可视化。本实验方案提供了一种利用LSCI评估人体皮肤微循环系统性微血管功能的标准化方法。由于该技术获得的测量结果对环境和生理干扰因素高度敏感，本方案强调严格的标准化操作流程，以提高实验的可重复性和可靠性。方案详细说明了必要的环境控制措施，包括将室温稳定控制在23°C ± 1°C、受试者的体位安排、适应性调节程序，以及在图像采集过程中尽量减少外界干扰。该方法结合LSCI与两种辅助性激发试验，用于评估皮肤微血管反应性。其中，缺血后反应性充血用于评估整体微血管反应性，而离子导入介导的药理学刺激则用于评估内皮功能。具体而言，使用乙酰胆碱（Acetylcholine）评估内皮依赖性血管舒张功能，使用硝普钠（sodium nitroprusside）评估内皮非依赖性血管舒张功能。本逐步可视化实验方案旨在促进标准化LSCI方法在临床及转化研究中的推广应用。该方法已成功应用于多种临床状况下微血管功能障碍的识别，包括难治性高血压、糖尿病和冠状动脉疾病。通过实现对微血管反应性的可重复、非侵入性评估，该技术为系统性血管健康的研究、疾病进展的监测以及针对微血管系统的干预措施疗效评价提供了有力工具。

引言

本实验方案的主要目标是提供一种标准化、可重复的方法，用于评估系统性微血管功能及反应性，该方法结合激光散斑对比成像技术（LSCI）与生理学和药理学激发操作。微循环由终末血管——直径小于约100 µm的微动脉、毛细血管和微静脉——组成¹，是代谢交换的主要场所，也是外周血管阻力的关键决定因素²。这些小血管中的内皮功能障碍通常早于大血管结构改变，是高血压、糖尿病和冠状动脉疾病等心血管疾病的早期生物标志物³。重要的是，尽管微血管功能受损在终末器官损伤中起着重要作用，但它是在多因素疾病过程中与大血管动脉粥样硬化及系统性慢性炎症共同作用的结果。因此，在转化医学研究中，对微血管反应性进行无创评估对于早期诊断和治疗效果监测均至关重要⁴。

利用皮肤微循环作为全身血管健康替代指标的依据在于其易于获取，并且能够代表整体内皮功能的一个观察窗口^5,6。传统上，激光多普勒血流仪（LDF）被认为是无创皮肤评估的金标准⁷。然而，LDF受限于空间分辨率较差，因其提供的点式测量结果对皮肤灌注固有的异质性高度敏感⁸。....

方案

所有涉及人类参与者的操作均遵循巴西国家心脏病研究所（卫生部）的伦理标准，符合国家法规（根据2024年5月第14,874号法律设立的国家研究伦理委员会——INAEP）以及《赫尔辛基宣言》（2024年修订版）。

1. 受试者准备与环境控制

1. 稳定检测环境
   1. 使用专用恒温器将检测室温度（室温；23°C ± 1°C）保持稳定，以维持恒定的热环境。
   2. 每10分钟使用经校准的数字温度计（精度±0.1°C）监测一次室温。
      ​注意：皮肤微血管功能对温度波动高度敏感。
2. 检测前准备受试者
   1. 指导受试者在检测前24小时内避免吸烟、摄入咖啡因或酒精，以及进行剧烈运动。
   2. 指导受试者在检测前至少禁食2小时，但可饮水。
      ​注意：禁用咖啡因和避免剧烈运动可最大程度减少对外周皮肤血管张力的干扰。咖啡因作为腺苷受体拮抗剂，而运动则通过影响交感神经活性和体温调节，均可引起微血管反应性的持续改变，这种影响在暴露后数小时内仍可存在^4,14。
3. 为图像采集安置受试者体位
   1. 使用体位垫将受试者的非优势手臂置于与心脏水平的位置，使....

结果

成功应用本方案将获得稳定的基线，随后对每种血管刺激产生清晰且可区分的微血管反应。在技术成功的实验中，基线记录应显示稳定的灌注信号，波动极小，定义为标准差（SD）< 平均信号的10%。在乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）离子电渗过程中，预期出现APU的逐步升高，反映剂量依赖性血管扩张。成功的反应性充血（PORH）表现为动脉阻塞期间灌注迅速下降至稳定的生物学零值，随后在解除袖带压迫后立即出现显著的高灌注峰值，在健康受试者中通常达到基线水平的数倍。图1A展示了采用激光散斑衬比成像（LSCI）结合离子电渗进行皮肤微血管评估的实验装置。图1B–1D显示了典型的离子电渗反应及电极放置位置。图2A呈现了乙酰胆碱离子电渗过程中典型的剂量依赖性微血管反应，而图2B则展示了一个典型的PORH反应。

次优或技术上不成功的记录通.......

讨论

激光散斑衬比成像（LSCI）提供了一种标准化且非侵入性的方法，可用于高空间和时间分辨率下评估系统性微血管功能。与仅限于单点测量且对皮肤灌注空间异质性高度敏感的激光多普勒血流仪（LDF）相比，LSCI能够实现全场成像，并对多个感兴趣区域（ROI）进行同步评估。这一特性显著提高了测量的可重复性，并降低了临床微血管研究中的变异系数。此外，LSCI的非接触特性最大限度地减少了探头类技术常伴随的局部压力伪影，从而提升了其在转化医学和临床研究中进行重复评估的适用性。

该方案的一个关键步骤是将灌注数据标准化为平均动脉压（MAP），以计算皮肤血管传导率（CVC）。由于皮肤血流灌注受全身灌注压的显著影响，单独解读原始APU值可能导致严重混杂，尤其是在血流动力学特征发生改变的人群中，例如高血压或血脂异常患者。因此，本方案建议同时报告原始PU值和标准化后的CVC值，以提高在不同生理和病理条件下对微血管功能的解读准确性。该方案的另一个关键环节是严格控制环境条件并保持受试者状态稳定，包括控制室温、尽量减少运动伪影以及采用标准化的受试者体位，这些措施对于获得可重复的记录结果至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>仪器设备
自动示波法血压监测仪	欧姆龙健康医疗	HEM-7120	用于基线平均动脉压（MAP）评估（3 次测量）
数字校准温度计	Delta OHM	HD2301.0	准确性 ± 0.1°用于室温监测的 C
分散（参考）电极	Perimed AB	PF 384	大表面积中性电极
药物递送电极	Perimed AB	PF 383 / LI 611	非侵入性离子导入室（约 80 mm²)
离子电渗电源控制器	Perimed AB	PeriIont 微血管诊断系统	双通道电流控制器（最高200） µA)
激光散斑对比成像（LSCI）系统	Perimed AB	PeriCam PSI NR	高分辨率血流灌注成像仪
医用级真空垫	AB Germa	N/A	用于将前臂稳定地置于心脏水平位置
单手操作真空泵	AB Germa	N/A	用于抽空真空垫内的空气
快速袖带充气器	D.E. Hokanson, Inc.	E20 快速袖带充气装置	用于标准化的3 min动脉阻断
<强>试剂与耗材
乙酰胆碱氯化物（ACh）	Sigma-Aldrich	A6625	2%浓度制备的内皮依赖性血管扩张剂
酒精消毒片	Becton Dickinson	326895	用于皮肤准备的70%异丙醇消毒垫
去离子水	Sigma-Aldrich	38796	用于电极的最终冲洗
氯化钠（0.9% 生理盐水）	本地供应商	N/A	药物配制和皮肤清洁用溶剂
硝普钠（SNP）	Sigma-Aldrich	S0501	2% 的非内皮依赖性血管扩张剂制备
无菌纱布	本地供应商	N/A	清洁后用于干燥皮肤表面
<强>软件
灌注分析软件	Perimed AB	PIMSoft	激光散斑衬比成像数据采集与感兴趣区域分析软件
统计分析软件	GraphPad Software	Prism 10	用于剂量-反应曲线拟合和曲线下面积（AUC）计算