利用激光斑点对比成像标准评估人体皮肤微循环系统微血管功能的方案

摘要

本方案描述了一种标准化、非侵入性的方法，利用激光斑点对比成像结合药理离子传送和生理刺激，评估人体皮肤微循环中的全身微血管功能，以评估临床研究环境中的微血管反应性。

摘要

激光斑点对比成像（LSCI）是一种高分辨率、非侵入性的光学技术，能够实现微血管灌注的实时全场可视化。本方案提出了一种标准化的方法，用于利用LSCI评估人体皮肤微循环中的全身微血管功能。由于该技术所得的测量对环境和生理混杂因素高度敏感，该方案强调严格的标准化程序，以提高重复性和实验可靠性。该协议详细说明了关键的环境控制，包括室温稳定在23°C±1°C、参与者定位、适应过程以及在图像采集过程中尽量减少外部干扰。该方法结合LSCI与两种互补的诱发性操作，以评估皮肤微血管反应性。闭塞后反应性充血用于评估整合性微血管反应性，而离子置换驱动的药理学挑战则用于评估内皮功能。具体来说，乙酰胆碱用于评估内皮依赖性血管扩张，硝基苷钠用于评估内皮非依赖性血管扩张。该逐步可视化方案旨在促进临床和转化研究环境中采用标准化LSCI方法论。该方法已成功应用于多种临床疾病的微血管损伤，包括难治性高血压、糖尿病和冠心病。通过实现对微血管反应性的可重复且无创评估，该方法为研究全身血管健康、监测疾病进展以及评估针对微血管干预措施的有效性提供了宝贵工具。

引言

该方案的主要目标是提供一种标准化、可重复的方法，用于利用激光斑点对比成像（LSCI）结合生理和药理学诱导操作，评估全身微血管功能和反应性。微循环由直径约100微米的小于100微米的末端血管——小于动脉、毛细血管和静脉——组成，是代谢交换的主要部位，也是决定外周血管阻力的关键因素²。这些小血管内皮功能障碍通常先于宏观血管改变，并作为心血管疾病（包括高血压、糖尿病和冠状^{动脉疾病）}的早期生物标志物3。重要的是，虽然微血管损伤对终末器官损伤有显著贡献，但它与大血管动脉粥样硬化和系统性慢性炎症共同作用，形成多因素疾病过程。因此，对微血管反应性的非侵入性评估对于早期诊断和^{转化研究中}治疗疗效监测至关重要。

使用皮肤微循环作为系统血管健康的替代方法的理由在于其可及性以及作为全球内^{皮功能代表}窗口的作用 ^5,6。传统上，激光多普勒流量测量（LDF）被认为是非侵入性皮肤评估的金^标准7。然而，LDF因空间分辨率较差而受限，因为它提供的点测量对皮肤灌注的固有异质性极为^敏感。相比之下，LSCI通过提供组织灌注的全场实时可视化，具有高时间和空间分辨率⁹，具有显著优势。通过分析激光光散射产生的干涉图样，LSCI能够同时评估多个血管区域，无需物理接触或外源染料^10,11。

在更广泛的文献中，LSCI与离子导引的药理诱导（如乙酰胆碱（ACh）和硝基苯钠（SNP）的结合已被验证为评估内皮依赖性和内皮非依赖性血管扩张通路的有力方法（^12,13）。此外，闭塞后反应性充血（PORH）综合评估了涉及内皮介质、神经源性感觉神经和血管平^{滑肌功能的}微血管反应性。尽管具有优势，LSCI对环境和生理变异的高度敏感性要求严格的标准化程序。该方案通过详细说明关键环境控制措施，包括室温稳定在23°C±1°C及标准化参与者位置，以提升受试者内外的重复性¹⁰。该方法适用于寻求方法学基础、非侵入性方法，以研究不同患者群体微血管病理生理的临床和转化研究者。

方案

所有涉及人类参与者的操作均遵循巴西卫生部国家心脏病学研究所的伦理标准，符合国家法规（国家伦理研究委员会（INAEP）根据2024年5月第14874号法律）及赫尔辛基宣言（2024年修订）。

1. 参与者准备与环境控制

1. 稳定检查环境
   1. 使用专用恒温器稳定检查室温（RT;23°C±1°C），以维持稳定的热环境。
   2. 使用校准的数字温度计每10分钟监测一次RT（精度为±0.1°C）。
      注意：皮肤微血管功能对温度变化极为敏感。
2. 评估前准备参与者
   1. 指示参与者在评估前24小时内戒烟、戒咖啡因或酒精，并进行剧烈运动。
   2. 指导参与者在评估前禁食至少2小时，同时允许饮水。
      注意：戒断咖啡因和剧烈运动可最大限度减少皮肤血管张力的外部干扰。咖啡因作为腺苷受体拮抗剂，运动通过对交感神经驱动和体温调节的影响，可以诱导微血管反应性持续变化，这些变化在暴露后持续数小时 ^4,14。
3. 将参与者定位以便图像采集
   1. 将参与者的非惯用手臂置于心脏高度，使用身体垫保持前臂水平稳定。
   2. 使用前臂腹面作为评估点。
      注意：非主导前臂可最大限度减少与日常活动相关的外侧血管重塑影响。腹前臂为光学成像提供了有利的解剖特征，包括减少毛发密度和减少皮肤厚度，从而减少信号伪影并提高离子分离药物递送的可重复性。
4. 促进心血管稳定
   1. 在开始微血管记录前，保持参与者至少休息20分钟。
   2. 限制参与者在休息期间说话、移动被评估肢体或使用电子设备。
      注意：稳定期可最大限度减少基线获得前的自主神经和心血管波动。
5. 最小化运动伪影
   1. 将参与者的非惯用前臂放在真空垫系统上。
   2. 调整垫子，使腹前臂表面在整个成像过程中保持稳定的水平位置。
6. 准备皮肤表面
   1. 所有测量都选择无毛发的皮肤部位。
   2. 如有需要，在评估前24小时使用外科剪刀拔除毛发。
      注意：不要使用剃须刀进行脱毛，因为皮肤刺激可能会干扰微血管测量。
7. 测量动脉血压
   1. 根据参与者的臂围选择袖口尺寸。
   2. 使用校准的自动示波仪连续测量三次血压，测量间隔1分钟。
   3. 舍弃第一次测量，计算最后两次测量的平均值，以确定平均动脉压（MAP），根据ESC/ESH和AHA心血管指南。

2. LSCI系统设置与软件配置

1. 准备LSCI系统
   1. 在图像采集前至少10分钟开启LSCI系统，以稳定激光源。
   2. 在开始录制前，请使用软件状态指示器验证激光稳定。
2. 定位激光头
   1. 将激光头直接放置在参与者前臂上方。
   2. 使用制造商提供的距离测量工具，将激光头调整到距离皮肤表面恰好15厘米的距离（见图1A）
      注意：保持固定的拍摄距离能确保图像对焦最佳，参与者之间的视野一致。
3. 配置采集软件
   1. 启动图像采集软件并创建新的研究文件。
   2. 输入参与者的人口统计信息和之前计算的MAP。
      注意：如适用，请附上详细的软件操作说明和代表性截图作为补充材料。
4. 配置采集参数
   1. 将采集采样率设置为1图像/秒（1 Hz）。
   2. 将目标获取区域的空间分辨率调整为约0.1毫米/像素。
      注意：1 Hz采样率在时间分辨率与信噪比之间提供了适当的平衡，同时充分捕捉了高氧和药理反应动力学。
5. 最小化环境光干扰
   1. 在图像采集前，根据系统要求进行背景噪声检查或暗帧减法。
   2. 当无法使用暗帧减法时，所有录制时会调暗房间灯光并用遮光帘阻挡外部阳光。
      注意：标准化环境光可减少光学干扰并提高信号重现性。
6. 定义关注区域（ROI）
   1. 在采购软件的实时预览界面上创建至少三个约80 mm² 的圆形投资回报率。
   2. 在离子游离电极位置放置两个ROI，在PORH评估位置放置一个ROI。
   3. 将所有ROI放置在腹侧前臂，距离肘前窝约5厘米处，同时避免露出浅表静脉。
      注意：标准化ROI区域可最大限度减少空间异质性对皮肤灌注的影响，并减少与药物递送腔相关的边缘伪影。
7. 获取基线灌注记录
   1. 在静脉刺激前，连续记录静息皮肤血灌注5分钟。
   2. 监测实时灌注信号，确认基线采集过程中无运动引起的峰值。
   3. 将基线稳定性定义为连续2分钟间隔内灌注信号变化<10%。
8. 实现皮肤血管电导（CVC）分析
   1. 将参与者的MAP输入到获取软件中。
   2. 在软件设置中启用自动计算CVC。
9. 记录灌注和电导数据
   1. 配置软件通过将实时灌注值（APU）除以MAP来自动计算CVC。
   2. 在整个方案中，同时记录原始灌注单位（PU）和计算出的CVC值。
      
      注意：将微血管灌注表达为CVC可最大限度减少全身性血压波动的混杂影响，并实现不同血流动动力学特征参与者间更可靠的比较。

图1。利用激光斑点对比成像（LSCI）结合离子传导评估皮肤微血管灌注的实验装置。（A）用于皮肤微血管评估的代表性实验装置，利用激光斑点对比成像和血管扩张剂离子流出。（B）在经皮电离子输送中，代表性地产生了叠加剂量乙酰胆碱（ACh）的微血管灌注反应。（C）AC离子游离的代表性图像。（D） 载具控制电极的代表性图像。标签显示以下组件：（1）成像头;（2）离子推送药物递送电极;以及（3）色散电极。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 离子传导与药理诱导

1. 准备皮肤进行离子渗透
   1. 使用无酒精生理盐水或温和的皮肤清洁剂清洁选定的腹侧前臂皮肤部位。
   2. 轻轻拍干皮肤后放置电极。
      注意：皮肤准备时避免过度机械刺激，因为机械诱导的血管扩张可能干扰基线测量。
2. 定位药物递送电极
   1. 使用双面粘附盘将两个药物递送电极连接到预备的皮肤部位（见图1A）。
   2. 保持电极间距约5厘米，以防止电流干扰。
3. 准备ACh溶液
   1. 在第一个电极腔室中注满200微升2%ACh溶液，用0.9%^{盐水制备。}
   2. 使用AC电极评估内皮依赖性血管扩张。
      注意：所选药物浓度经过优化，旨在诱导强健的剂量依赖微血管反应，同时最大限度减少非特异性刺激和电伪影。
4. 准备SNP解
   1. 在第二个电极腔室中注入200微升2%的2%SNP溶液，并以0.9%盐水制备。
   2. 使用SNP电极评估内皮非依赖性血管扩张。
      注意：SNP对光敏感。用铝箔保护溶液免受光照照射，并在准备后4小时内使用，以保持药理稳定性。
      注意：所选SNP浓度有助于稳定的平台性血管扩张，同时最大限度减少非特异性电效应。
5. 清除被困的气泡
   1. 在接皮前检查电极腔是否有气泡困住。
   2. 通过轻敲电极腔或使用无菌塑料注射器尖端去除可见的气泡。
      注意：气泡可能阻碍电流流动，导致药物传递不均匀。
6. 定位参考电极
   1. 使用导电凝胶或粘合剂将参考（中性）电极靠近药物递送电极约15厘米处（见图1A）。
   2. 在启动离子渗透前，确认电极接触稳定。
      注意：药理评估区与PORH评估区之间的空间分离可最大限度减少混杂相互作用，防止ACh诱导的轴突反射发作与PORH测量区重叠。
7. 连接离子流转系统
   1. 在电流施加前，将所有电极连接到离子输送装置。
   2. 开始操作前确认电极极性（ACh用阳极，SNP用阴极）。
      注意：电极极性错误可能影响药物递送效率并改变血管反应。
8. 执行离子置体当前方案
   1. 分别给药6次增量电流剂量，分别为30、60、90、120、150和180 μA。
   2. 每次当前剂量持续10秒。
      注意：增量电流方案能够构建剂量-反应曲线，并便于评估微血管敏感性和平台反应¹¹。低电流幅度和短刺激间隔的结合最大限度地减少了非特异性电血管扩张。
9. 保持刺激间隔
   1. 保持连续电流间隔60秒。
   2. 在剂量间稳定期监测灌注信号。
      注意：所选间隔可稳定微血管反应，同时保持局部药物递送且无系统性影响。
10. 记录微血管反应
    1. 在所有离子传送刺激过程中，持续记录微血管灌注信号。
    2. 在最终电流应用后至少持续记录10分钟，以捕捉最大平台响应。图 2A展示了具有代表性的剂量依赖反应。

图2。离子推测期间皮肤微血管灌注的代表性记录及闭塞后反应性充血（PORH）。（A） 利用LSCI在离子输送过程中获得的2% ACh皮肤微血管血通量的代表性记录，阳极电流为30、60、90、120、150和180 μA，间隔10秒，间隔1分钟。（B） PORH评估期间获得的代表性记录。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 闭塞后反应性充血（PORH）

1. 定位闭塞袖带
   1. 将一个标准气动袖带（宽度约12厘米）放在用于LSCI记录的同一肢体上臂上。
   2. 将袖带靠近选定的显微血管评估部位。
2. 定义PORH评估区域
   1. 在靠近离子游动电极的位置腹前臂建立第三个ROI。
   2. 将ROI置于无治疗皮肤区域，以避免药物干预。
      注意：保持药物刺激部位与PORH评估区之间的空间隔离，以保持独立的血管反应。
3. 获取PORH基线记录
   1. 记录静息皮肤灌注连续5分钟，然后动脉堵塞。
   2. 监测基线输注信号以确认信号稳定性，然后再充气。
4. 诱导动脉阻塞
   1. 使用自动充气器或手动充气球，在5秒内快速充气气<。
   2. 将袖带压力提高到比参与者先前测量的收缩压（SBP）高出50 mmHg。
      注意：在开始闭塞期前，请确认动脉完全闭塞，因为不完全闭塞可能会影响充血反应。
5. 保持闭塞期
   1. 保持动脉阻塞持续3分钟。
   2. 通过确认LSCI信号降至生物学上的零点（<10 APU）来验证完全闭塞。
      注意：生物零信号反映的是血细胞的残余运动，且不依赖于定向血流，包括布朗运动。
6. 松开闭合袖带
   1. 通过快速排气阀瞬间释放袖口压力。
   2. 立即恢复血流，启动反应性充血反应。
7. 记录充血反应
   1. 松开袖带后，继续录制LSCI至少5分钟。
   2. 捕捉灌注响应峰值及其随后回归基线灌注水平的过程。图 2B展示了代表性的PORH反应。
8. 量化PORH反应
   1. 在图像采集软件中计算峰值CVC。
   2. 使用分析软件计算超电感响应信号曲线下的面积（AUC）。

5. 数据提取与统计分析

1. 打开并核实记录的数据
   1. 使用图像分析软件打开录制的采集文件。
   2. 确认所有预定义的投资回报率（ROI）都正确地放置在相应的测量点上。
      注意：只有在运动伪影或获得漂移影响了原始放置时，才会重新定位ROI。
2. 定义分析区间
   1. 确定灌注和心血管趋势图上的具体分析区间。
   2. 选择一个连续的60秒基线间隔，紧接着第一个血管刺激发生。
   3. 选择每个60秒间隔的最后30秒，以捕捉平台微血管反应。
      注意：在数据分析前，将基线稳定性定义为变异系数（CV）<灌注信号的5%，以最大限度减少血管运动振荡和运动伪影的影响。
3. 识别PORH响应变量
   1. 在PORH协议的动脉阻塞阶段识别生物零信号。
   2. 在袖带释放后立即确定CVC峰值值。
4. 计算区间平均值
   1. 使用图像分析软件计算每个预定义分析区间的平均CVC值。
   2. 在确认最终计算值之前，先确认没有运动伪影。
5. 整理提取的数据
   1. 导出或手动转录平均原始 PU 和平均 CVC 值到结构化电子表格中。
   2. 根据研究组和血管刺激（包括乙酰胆碱、硝基丙啶钠和PORH反应）组织数据集。
      注意：在数据处理过程中，请保持一致的文件命名和参与者识别码，以最大限度减少转录错误。
6. 计算次级血管结局
   1. 计算基线灌注或CVC值的百分比增加，以确定血管反应性。
   2. 在需要进行二级终点分析时计算AUC。
7. 进行统计分析
   1. 使用统计分析软件分析数据。
      注意：如适用，请附上代表性的软件分析截图或工作流程说明作为补充材料。
   2. 评估数据分布
      1. 使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。
      2. 将正态分布数据表示为均值±标准差（SD）。
      3. 将非正态分布数据表示为中位数和四分位数范围（IQR）。
   3. 比较微血管反应
      1. 当正态性假设成立时，使用独立的t检验比较两组数据集。
      2. 先用单因子方差分析和Tukey事后检验比较多组。
   4. 定义统计显著性标准
      1. 定义统计显著性为p < 0.05。
      2. 通过成对删除或排除受影响分析，处理因运动伪影引起的缺失数据。
         注意：在所有研究组中保持一致地采用相同的缺失数据策略，以保持分析完整性。

结果

成功应用该方案可获得稳定基线，随后对每个血管刺激产生清晰且可区分的微血管反应。在一项技术上成功的实验中，基线记录显示灌注信号稳定且波动最小，定义为平均信号的标准差<10%。在AC和SNP的离子穿透过程中，预期APU会逐步增加，反映剂量依赖性血管扩张。成功的PORH反应表现为动脉阻塞期间灌注迅速降至稳定的生物零值，随后在解开袖带后立即出现急剧充血峰值，健康受试者通常达到基线数倍的数倍。 图1A 展示了利用LSCI和离子传送进行皮肤显微血管评估的实验装置。 图1B–1D 展示了具有代表性的离子流响应和电极位置。 图2A 在AC离子顶穿期间呈现了具有代表性的剂量依赖性微血管反应，而 图2B 则展示了具有代表性的PORH反应。

次优或技术不成功的录音通常...

讨论

LSCI提供一种标准化且非侵入性的方法，用于评估系统性微血管功能，具有高空间和时间分辨率。与仅限于单点测量且对皮肤灌注空间异质性高度敏感的LDF相比，LSCI实现了全场成像和多重投资回报率的同时评估。这一特性显著提高了测量的可重复性，并降低了临床微血管研究中的变异系数。此外，LSCI的无接触特性最大限度地减少了探针技术常见的局部压力伪影，提升了其在转化和临床研究环境中反复评估的适用性。

该协议的一个关键组成部分是将灌注数据归一化为MAP以计算CVC。由于皮肤血灌注受全身灌注压力强烈影响，仅解释原始APU可能导致显著混杂，尤其是在血流动动力学特征改变的人群中，如高血压或血脂异常。因此，该方案建议同时报告原始PU和归一化后的CVC值，以改善对不同生理和病理条件下微血管功能的解读。协议的另一个关键方面是严格的环境和参与者稳定，包括室温控制、减少运动伪影以及标准化的参与者位置，这些都是实现可重复录音的关键。

还必须考虑LSCI的若干局限性。该技术主要评估约0.5–1毫...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
自动示波血压监测器	Omron Healthcare	HEM-7120	用于基线平均动脉压（MAP）评估（3次测量）
数字校准温度计	Delta OHM	HD2301.0	室温监测精度± 0.1°C
分散（参考）电极	Perimed AB	PF 384	大表面中性电极
药物输送电极	Perimed AB	PF 383 / LI 611	非侵入性离子导入室（约80 mm²）
离子导入电源控制器	Perimed AB	PeriIont微血管诊断系统	双通道电流控制器（最高200 µA）
激光斑点对比成像（LSCI）系统	Perimed AB	PeriCam PSI NR	高分辨率血流灌注成像仪
医用真空垫	AB Germa	N/A	用于稳定前臂在心脏水平位置
单手操作真空泵	AB Germa	N/A	用于真空垫的抽气
快速袖带充气器	D.E. Hokanson, Inc.	E20快速袖带充气器	用于标准化3分钟动脉闭塞
试剂和耗材
乙酰胆碱氯化物（ACh）	Sigma-Aldrich	A6625	内皮依赖性血管扩张剂，配制成2%
酒精准备垫	Becton Dickinson	326895	用于皮肤准备的70%异丙醇垫
去离子水	Sigma-Aldrich	38796	用于电极的最终冲洗
氯化钠（0.9%生理盐水）	本地供应商	N/A	用于药物配制和皮肤清洁的溶剂
硝普钠（SNP）	Sigma-Aldrich	S0501	内皮非依赖性血管扩张剂，配制成2%
无菌纱布	本地供应商	N/A	用于清洁后皮肤表面的干燥
软件
灌注分析软件	Perimed AB	PIMSoft	用于LSCI数据采集和ROI分析的软件
统计分析软件	GraphPad Software	Prism 10	用于拟合剂量反应曲线和曲线下面积（AUC）计算