多阶段遗传学、转录组学与单细胞证据在胶质母细胞瘤铁死亡相关基因中优先筛选出MAP1LC3A

摘要

一个基于遗传锚定的多阶段框架，整合了孟德尔随机化、肿瘤转录组学和单细胞分析，将MAP1LC3A优先确定为与胶质母细胞瘤易感性相关的铁死亡相关基因，并可作为未来实验验证的候选基因。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）仍是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，铁死亡相关基因在疾病易感性中的作用尚未完全阐明。本研究采用基于遗传学的多阶段分析框架，以筛选与GBM相关的铁死亡相关基因。从FerrDb V2数据库整理的483个基因中，有315个基因在eQTLGen数据库中具有候选的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs），250个基因在连锁不平衡剔除后至少保留三个独立工具变量，226个基因利用包含6,183例病例和18,169例对照的GBM全基因组关联研究数据获得了有效的逆方差加权（IVW）孟德尔随机化估计。34个基因满足探索性发现标准，即P < 0.05且Benjamini–Hochberg错误发现率（BH-FDR）< 0.20，并具有方向一致的贝叶斯加权孟德尔随机化（BWMR）估计值。使用GTEx V10全血cis-eQTL数据进行的复制阶段孟德尔随机化分析支持了四个基因：ATG7、RPTOR、MAP1LC3A和CHMP6。在三个独立的肿瘤–对照转录组队列中评估发现，MAP1LC3A在肿瘤组织中持续下调，并显示出显著的随机效应合并估计值（log₂倍数变化，−1.273；95%置信区间，−1.625至−0.920；错误发现率 = 0.016），而其余三个基因缺乏跨队列的统计学支持。随后，在来自20例成人IDH野生型GBM肿瘤的4,916个合格细胞中选取2,400个恶性细胞组成的患者平衡子集中进行了单细胞虚拟敲除分析。在五次独立设置的运行中，分别识别出ATG7、RPTOR、MAP1LC3A和CHMP6的3、15、4和7个稳健的下游基因。最终形成的共识基因集合包含17个独特基因，其中RND3在所有四个靶基因中均被共享。基因本体（Gene Ontology）分析显示细胞黏附和细胞表面相关过程富集，但在多重检验校正后，无KEGG或Reactome通路仍具显著性。综上所述，这些发现将MAP1LC3A列为未来实验研究的重点基因，同时强调了遗传关联、肿瘤表达一致性及计算扰动分析与因果性或机制性确证证据之间的区别。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）仍然是治疗抵抗性恶性肿瘤的典型代表。尽管分子分型和多学科诊疗不断精细化，患者预后的长期改善仍然有限¹。对于身体状况适合治疗的患者，目前的标准治疗方案是在安全的前提下尽可能切除肿瘤，随后进行放疗联合同步及辅助替莫唑胺治疗；该方案源于一项具有里程碑意义的随机对照试验，并被现行临床指南所采纳^1,2。然而，肿瘤的弥漫性浸润以及广泛的细胞和分子异质性限制了持久的疾病控制，大多数患者最终会出现疾病进展或复发，而目前尚无普遍有效的标准治疗方案^1,3。疾病特征认知的不断进步与临床疗效之间的持续差距，凸显了识别具有生物学意义的分子依赖性的重要性，这些依赖性可能为GBM的新型治疗策略提供依据。

铁死亡是一种依赖铁离子的程序性细胞死亡形式，其特征是不受控制的磷脂过氧化以及细胞抗氧化防御系统的失效，这在机制上区别于凋亡及其他经典的细胞死亡途径^4,5。该过程在胶质母细胞瘤（GBM）中尤为重要，因为基因改变和代谢可塑性会重塑铁稳态、氧化还原平衡以及脂质代谢。整合基因组学与脂质组学分析表明....

方案

本研究已获得肇庆市第一人民医院医学伦理委员会的伦理审查豁免（参考编号：B2026-08-03）。本研究使用了回顾性收集的、去标识化的汇总水平基因组和转录组数据，包括经数据获取委员会批准的受控访问数据（来自EGAD00010001657）以及根据其适用的数据访问和使用条件从GEO、eQTLGen和GTEx获取的数据集。本研究未招募任何新参与者，未收集任何生物样本，也未访问任何可识别的个体水平数据。原始研究的伦理批准和知情同意由各数据提供方获得，受控访问数据的使用符合相应的数据访问协议要求。

研究设计

本研究采用多阶段框架，对与胶质母细胞瘤（GBM）易感性相关的铁死亡相关基因进行优先排序，并评估其与疾病相关的转录效应（图1）。首先，利用FerrDb V2中整理的铁死亡相关基因，结合顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）数据和一项大规模GBM全基因组关联研究（GWAS），通过双样本孟德尔随机化（MR）进行评估。以逆方差加权（IVW）MR作为主要筛选方法，贝叶斯加权孟德尔随机化（BWMR）提供对结果稳健性的补充评估，并使用一个独立的eQTL数据集进行复制阶段的MR分析。其次，对遗传学分析支持的基因，在三个独立的肿瘤–对照转录组队列中进行评估，并进一步开展跨队列的荟萃分析。第三，利用患者来源的单细胞转录组数据，在恶性细胞中进行虚拟基因扰....

结果

铁死亡相关基因的筛选及遗传工具的选择

从 FerrDb V2 共获取 483 个与铁死亡相关的基因图1）。其中，315个基因与eQTLGen数据集匹配，并至少含有一个候选顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）。经过连锁不平衡剔除后，250个基因保留了至少三个独立的候选工具变量。在完成结局-变异体查询、等位基因匹配及质量控制后，226个基因获得了有效的逆方差加权（IVW）估计值，并被纳入发现阶段的孟德尔随机化（MR）分析。补充文件 1）。在发现阶段分析中保留的全部 3,578 个工具变量的 F 统计量 >10（最小值为29.72；中位数为70.76），表明无弱工具变量偏倚的证据。在34个发现阶段的候选基因中，F统计量的中位数为67.22，最小值为29.72。

发现阶段的 MR 鉴定出与胶质母细胞瘤易感性相关的铁死亡相关基因

讨论

本研究整合了遗传关联分析、复制阶段孟德尔随机化（MR）、肿瘤转录组学以及患者来源的单细胞建模，以筛选与胶质母细胞瘤（GBM）易感性相关的铁死亡相关基因。通过在包含6,183例病例和18,169例对照的GBM全基因组关联研究（GWAS）中筛选483个经过整理的基因，确定了34个发现阶段候选基因，其中ATG7、RPTOR、MAP1LC3A和CHMP6在使用独立表达数量性状位点（eQTL）资源进行的复制分析中获得支持。在遗传分析之后，证据逐渐变得更加具有选择性。MAP1LC3A在三个独立的肿瘤队列中均持续下调，并在跨队列的荟萃分析中仍具有显著性。该肿瘤表达模式与MR分析中观察到的保护性关联相互补充，尽管这两种方法针对的是疾病生物学的不同方面。RPTOR和CHMP6显示出方向一致但结论性较弱的转录组学证据，而ATG7缺乏可重复的组织水平支持。虚拟敲除进一步揭示了恶性细胞中具有靶点特异性但部分重叠的转录响应。总体而言，这些逐层递进的分析通过区分具有不同程度疾病相关支持的候选基因，进一步优化了初始的MR发现，其中MAP1LC3A成为综合支持最强的候选基因。

将铁死亡与胶质瘤关联的现有大量人类证.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BWMR	R 包	BWMR	贝叶斯加权孟德尔随机化
DESeq2	Bioconductor	版本 1.46.0	RNA测序差异表达分析
FerrDb V2	FerrDb	版本 2	483 个经人工审编的铁死亡相关基因来源
胶质母细胞瘤整体微阵列	NCBI 基因表达综合数据库	GSE4290	转录组学评估队列
胶质母细胞瘤全基因组关联研究汇总统计	欧洲基因组-表型组数据库	EGAD00010001657	受控访问结局数据；6,183 例病例和 18,169 例对照
胶质母细胞瘤 Smart-seq2 单细胞 RNA 测序	NCBI 基因表达综合数据库	GSE131928	恶性细胞虚拟敲除分析
4 级胶质瘤整体 RNA 测序	NCBI 基因表达综合数据库	GSE196533	转录组学评估队列
GTEx 全血顺式表达数量性状位点汇总统计	基因型-组织表达项目	GTEx V10	复制阶段暴露数据
limma	Bioconductor	版本 3.62.2	微阵列差异表达分析
metafor	R 包	版本 4.8-0	随机效应元分析
R	统计计算 R 基金会	版本 4.4.2	统计计算环境
scTenifoldKnk	R 包	版本 1.0.3	单细胞虚拟敲除分析
肿瘤核心及瘤周整体微阵列	NCBI 基因表达综合数据库	GSE116520	转录组学评估队列
TwoSampleMR	R 包	版本 0.6.29	两样本孟德尔随机化
全血顺式表达数量性状位点汇总统计	eQTLGen 联盟	eQTLGen	发现阶段暴露数据