非动脉化大鼠肝移植模型中长期存活经验分享

摘要

本方案旨在分享建立非动脉化大鼠肝移植模型的优化手术经验，重点介绍可确保动物长期存活超过100天的技术改进。

摘要

在实验性肝移植中，大鼠模型是研究移植免疫学和代谢过程的金标准；然而，重建极为纤细的肝动脉（约0.5 mm）是一项重大的技术挑战。为规避这一难题，简化型非动脉化大鼠肝移植（NArLT）模型被广泛应用。遗憾的是，由于缺乏动脉供血，受体常出现严重的胆道并发症，如胆汁漏出和缺血性胆管炎，这往往限制了受体的长期存活。这一障碍显著制约了对关键科学问题的研究，包括长期宿主-移植物免疫相容性和慢性排斥反应。本文介绍一种经过优化的NArLT模型操作方案，通过多项关键技术改进，成功克服了上述缺血性胆道损伤问题。关键改进包括显著缩短无肝期、“无触碰”胆道分离技术、彻底的胆道冲洗以及优化的内置胆道支架置入方法。采用该改进方案后，在100天的观察期内，受体存活率超过94%。最终，该优化方案为研究长期移植耐受机制提供了一个高度可重复且稳健的实验平台，从而有助于推动移植医学中新治疗策略的发展。

引言

大鼠肝移植模型是基础移植研究中最广泛使用的实验平台。然而，由于其众所周知的学习曲线极为陡峭，该模型的更广泛应用常常受到限制，这可能会显著阻碍下游实验研究的进展^1,2。此外，传统的大鼠肝移植模型通常存在手术成功率不高和长期存活率低的问题。通过对手术步骤进行关键性简化，精细优化操作细节，并在直视下完成血管和胆道重建，可显著缩短这一复杂显微外科模型的学习曲线^3,4。肝移植目前仍是终末期肝病唯一的治愈性治疗手段，因此建立大鼠肝移植模型对科学研究具有重要意义^5,6。

非动脉化的 大鼠肝移植（NArLT）模型在实验外科中具有显著优势：它避免了显微血管动脉吻合这一极具挑战性的技术难点，缩短了总体手术时间，并减少了大鼠的麻醉时长。尽管该模型缺失动脉血液供应，但其胆道反应为研究缺血性胆道损伤提供了独特的视角。然而，传统的 NArLT 模型术后胆道并发症发生率高达 30%⁷，严重影响长期存活率。在传统经典的大鼠肝移植模型中，受体动物的长期存活率不足 70%–85%^8....

方案

本研究中的所有动物实验和手术均经青岛大学实验动物伦理委员会批准（编号：20260301SD5020260401065）。应尽一切努力减少动物的痛苦。

1. 术前准备

1. 实验动物
   1. 选用8–10周龄、体重220–250 g的成年雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠作为供体。确保受体体重略大于供体，体重差在50 g以内。
   2. 将大鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，控制温度为22°C ± 2°C，相对湿度为50% ± 10%。
   3. 维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环，每笼饲养2–3只大鼠。
   4. 提供标准实验室啮齿类动物饲料。手术前至少让大鼠在实验室环境中适应1周。
   5. 手术前禁食12小时，可自由饮水。
      ​注：术前禁食有助于降低麻醉期间发生误吸的风险，并防止胃扩张，后者可能影响呼吸功能并妨碍手术视野暴露。
2. 手术器械与材料
   1. 使用移植手术所需器械，如图1所示。手术所用耗材的详细信息列于材料表中。
   2. 根据导管外径与体重为220–250 g雄性SD大鼠目标血管生理内径的匹配情况，选择5F和6F硬膜外导管鞘。
   3. ....

结果

为确保NArLT模型中外科手术质量的一致性和可重复性，所有手术均由同一位经验丰富的显微外科医生完成。在研究期间共完成了50例大鼠肝移植手术。各手术阶段的平均持续时间为：供体手术25.3 ± 2.6分钟，离体移植物准备13.1 ± 2.1分钟，受体手术43.0 ± 1.6分钟，无肝期15.7 ± 1.2分钟。

接受优化NArLT手术的受体在100天观察期内的存活率达到94%（47/50），该计算包括围手术期死亡。共有3只受体大鼠死亡。尸体解剖显示，其中1例死于流出道梗阻，1例死于肝下 inferior vena cava（SHIVC）部位出血，另1例在术后恢复期间死亡且未发现明确病因。所有存活的受体大鼠均完成了完整的100天观察期，并在研究结束时接受了尸体解剖。长期存活者中未观察到严重的胆道并发症，如胆漏、胆道梗阻或缺血性胆管炎。所有重建的胆道均保持机械通畅性和功能完整性，尸体解剖证实无管腔梗阻、胆汁积聚或胆管扩张。大体检查进一步显示肝脏形态完整，无黄疸或胆道炎症表现。组织病理学评估被用作评估胆道完整性的金标准。胆道并发症的缺失依据以下标准确认：（1）上皮完整性得以保留，无脱落现象；.......

讨论

NArLT 模型由于避免了复杂的微血管动脉吻合，已成为实验性移植研究的基石¹¹。然而，传统的 NArLT 方法历来存在较高的胆道并发症发生率——高达 30%——这严重限制了长期存活率，并阻碍了慢性免疫学研究的开展²。本研究所提出方法的意义在于能够规避这些缺血性胆道损伤。在本研究中，100 天存活率达到 94%，高于以往大鼠肝移植研究中报道的短期存活率⁸。

本方案中有多个关键步骤对于确保移植物存活和受体生存至关重要。首先是在供体准备过程中采用“不触碰”胆道分离技术。通过严格避免对胆总管（CBD）进行过度剥离，可保留胆管周围结缔组织、神经丛以及微血管网络。这种保留对于早期侧支循环的建立及后续胆道愈合至关重要^12,13。此外，尽量缩短无肝期也极为重要。在肝切除前通过门静脉（PV）用5%葡萄糖溶液轻柔冲洗肝脏，是术中一项关键操作，旨.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 可吸收缝线	Ethicon	W9109H	用于肌筋膜层（白线）的关闭
4-0 丝线缝线	Ethicon	VCP304H	用于皮肤缝合
7-0 或 8-0 缝线 / 丝线结扎线	Ethicon	Z1711E	用于血管结扎（例如左膈静脉）
22G 静脉导管	B. Braun	4252098B	修剪至 5–7 mm，末端呈斜面，用于制备胆道支架
23G 头皮静脉针	山东勤凯医疗器械有限公司	MDLSSVS	用于插入腹主动脉进行肝脏灌注
布托啡诺	天津药物研究院药业有限公司	H12020275	术后皮下注射用于镇痛
棉签	Aoocn	216-236	用于在解剖过程中轻柔抬起肝脏
碎冰	N/A	N/A	用于离体准备期间维持移植物温度
弹性拉钩	N/A	N/A	用于开腹术中牵拉腹壁
硬膜外导管鞘	江苏麦创医疗器械有限公司	20173084015	规格为 5F 和 6F；用作门静脉和肝下下腔静脉的套管
纱布	中元医疗器械有限公司	CH-1001	浸润生理盐水；用于覆盖和保护肠道
葡萄糖溶液（5%）	四川科伦药业股份有限公司	H20044307	用于受体肝切除期间冲洗肝内血液
肝素盐水	深圳生命生物科技有限公司	H2012003	100 IU/mL；用于浸泡胆道支架
留置针	B. Braun	4254074B	用于冲洗肝下下腔静脉以在完成吻合前排除空气
异氟烷	济南广盛源生物科技有限公司	153107015	5% 浓度；用于麻醉诱导
微血管夹	上海医疗器械有限公司	JCZ200	用于手术期间血管阻断
蚊式止血钳	上海医疗器械有限公司	J31010	用于精细操作和套管制备
生理盐水（0.9%）	四川科伦药业股份有限公司	H20044304	用于冲洗和浸湿纱布（37°C）
戊巴比妥（1%）	上海远思科技有限公司	P0500000	40–45 mg/kg；用于手术麻醉
外周插入式静脉导管（PIVC）	Covidien	8888145015	用于冲洗带套管的门静脉并确认通畅性
聚维酮碘	山西天瑞达生物技术有限公司	41836054	用于手术部位消毒
橡胶带（来自外科手套）	Ansell	N/A	用于受体手术期间肝下下腔静脉的牵引
Sprague–Dawley 大鼠	华阜康（北京）生物科技有限公司	22001A	成年雄性大鼠，8–10 周龄，220–250 g
无菌培养皿（10 cm）	山东恩优生物科技有限公司	H905001	用于离体准备期间在 UW 溶液中盛放移植物
注射器（20 mL）	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	20163141593	用于控制肝脏灌注（3–3.5 mL/min）
UW 保存液	Bridge to Life	BTL-UW-1L	维持在 4°C；用于供体肝脏灌注和移植物保存