星形胶质细胞与神经元之间隧道纳米管及线粒体转移的标准化免疫荧光成像

摘要

本方案标准化了体外可视化星形胶质细胞与神经元之间隧道纳米管及线粒体转移的固定、染色和共聚焦成像方法。

摘要

线粒体是神经细胞中调控能量产生、细胞信号传导和代谢稳态的关键细胞器。隧道状纳米管（TNTs）是一类细长的膜性结构，可介导细胞间的远距离通讯，并促进包括线粒体在内的细胞组分在相互连接的细胞之间转移。由于TNTs结构极为脆弱，且对固定、洗涤和成像条件高度敏感，因此可靠地可视化TNTs及线粒体转移过程需要谨慎处理样品。本实验方案描述了星形胶质细胞及星形胶质细胞–神经元共培养体系中TNTs固定、染色和共聚焦成像的标准化操作流程。该工作流程包括用于TNTs可视化的膜结构与细胞骨架染色、用于追踪线粒体定位的线粒体标记，以及用于Miro1共定位分析的免疫荧光染色。整个操作过程中特别强调了保护TNT形态的关键步骤，如轻柔洗涤和避光操作。本方案还概述了固定细胞样本中TNTs和线粒体的成像分析策略。这些方法为体外研究神经细胞间TNT形成及线粒体转移提供了可重复的实验框架。

引言

线粒体作为细胞的能量工厂，通过生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate）为细胞活动提供所需能量，同时在细胞信号转导和氧化还原平衡中发挥重要作用¹。在神经系统中，线粒体代谢物可增加神经元突起的复杂性和兴奋性，从而支持神经元的生长与发育²。线粒体并非静态的细胞器，而是持续改变其形态、位置和分布，以适应各种细胞内外的应激状态和代谢需求³。在生理条件下，细胞间的线粒体转移有助于维持组织稳态并促进发育；而在病理条件下，该过程参与损伤修复、免疫调节以及疾病进展^4,5。

物质和能量的细胞间通讯对于多种生物学过程至关重要，包括细胞稳态、组织修复以及神经网络调节。目前的研究已揭示了多种细胞间通讯方式，其中隧道纳米管（TNTs）是与细胞间线粒体转移密切相关且被广泛研究的机制之一⁶。TNTs 是基于 F-肌动蛋白的桥状膜结构，呈管状形态，直径在 50 至 200 nm 之间，长度可延伸至数个细胞直径⁷。研究表明，TNTs 可作为神经细胞之间的物理连接，与神经退行性疾病、脑癌及其他疾病的起始和进展密切相关。例如，已有报道指出，小胶质细胞通过 TNTs 向神经元转移线粒体，可挽救受损的神经元细胞^8,9。

目前关于隧道纳米管（TNTs）的研究常面临若干挑战，包括TNTs结构脆弱，容易断裂，从而可能影响实验结果；难以将TNTs与丝状伪足或其他膜突起区分开来；以及在准确量化细胞间TNTs方面存在的困难。为了提高TNT相关研究的可重复性和一致性，需要建立标准化的洗涤、固定、染色和成像方法，以准确评估TNTs的结构和分布，同时尽量减少实验变异。固定前的细胞密度、避光保护、洗涤强度、固定时间以及固定后的染色条件等因素均可能影响TNTs的结构和稳定性。本研究中，我们描述了在星形胶质细胞及星形胶质细胞-神经元共培养体系中，对TNTs及与线粒体相关的TNT结构进行预处理、染色和共聚焦成像的操作流程。

本研究方案可普遍适用于大多数实验室环境。在原代星形胶质细胞和小鼠海马神经元细胞系中的验证结果证实，该方案适用于原代神经细胞和永生化细胞系。然而，本方案仍存在若干局限性。共聚焦显微镜在隧道纳米管（TNT）成像方面的空间分辨率低于超分辨率成像技术，而基于MitoTracker的线粒体转移评估可能受到染料泄漏及非线粒体信号干扰的影响¹⁰。

方案

本研究未涉及人类受试者或活体脊椎动物；仅使用了商业获取或已建立的细胞系，无需伦理审批。

1. 星形胶质细胞中隧道纳米管的染色

1. 细胞接种
   1. 将第3代（P3）分离的原代大鼠星形胶质细胞以每皿5 × 10⁴个细胞的密度接种至35 mm玻璃底培养皿中。每皿加入2 mL添加10%胎牛血清（FBS）和1%三联抗生素混合液（青霉素G、链霉素和两性霉素B）的Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F-12）完全培养基。将细胞置于含5% CO₂的湿润培养箱中，37°C培养。
   2. 在细胞贴壁前，于37°C继续孵育约24小时。
2. 预处理与固定
   1. 细胞贴壁后，在避光条件下将培养皿转移至洁净工作台。
      注意：操作过程中应尽量减少不必要的移动和振动，以保持隧道纳米管（TNT）结构的完整性。
   2. 在弱光条件下轻柔吸除培养基。
      注意：吸除培养基时应避免细胞表面完全干燥，否则TNT可能塌陷并附着于培养基质上。
   3. 用500 µL不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.3–7.5）轻柔洗涤细胞一次。沿培养皿壁缓慢加入和吸除PBS，避免洗涤过程中破坏细胞间的TNT结构。
   4. 小心吸除PBS。
   5. 在室温（RT；20°C–25°C）、弱光条件下，使用含多聚甲醛的商用4%组织细胞固定液固定细胞30分钟。
      警告：操作固定液时应佩戴适当的个人防护装备，并严格遵守所在机构的化学品安全指南进行所有操作。
   6. 吸除固定液。
   7. 用PBS洗涤细胞一次。
3. 细胞通透与荧光染色
   1. 在室温下，使用500 µL即用型Triton X-100通透溶液处理细胞20分钟。
      警告：Triton X-100可能破坏脆弱的TNT结构。通透过程中应尽量避免过度振荡。
   2. 吸除通透溶液。
   3. 用PBS洗涤细胞一次。
   4. 染色液需现配现用。将F-肌动蛋白染色染料用PBS稀释至终浓度1 µM，并使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）作为即用型细胞核染色剂。使用前将两种染色液充分混匀。
      注意：基于鬼笔环肽的染色试剂可作为F-肌动蛋白可视化染色的替代方案。
   5. 在避光条件下，将F-肌动蛋白染色液与细胞核染色液按1:1体积比（等体积）混合。
   6. 将配制好的染色液加入培养皿中。
   7. 在37°C避光条件下孵育30分钟。
   8. 吸除染色液。
   9. 每次使用500 µL PBS，洗涤细胞三次，每次1分钟。
   10. 加入1 mL PBS，防止成像前细胞干燥。
4. 共聚焦成像
   1. 使用配备×20物镜的尼康倒置共聚焦显微镜采集图像。DAPI采用405 nm激发光，F-肌动蛋白染色采用488 nm激发光。在室温、避光条件下以1024 × 1024像素分辨率采集图像。
   2. 对每个样本至少随机选取五个视野进行定性评估和手动定量分析。统计每个视野中TNT的数量以及含有一个或多个TNT的TNT阳性细胞数量（图1A 和 1B）。
      注意：染色后应立即采集图像，以尽量减少荧光信号衰减和TNT结构的破坏。

图1：星形胶质细胞中隧道纳米管（TNTs）的荧光染色。 （A）代表性共聚焦显微镜图像，显示在玻璃底培养皿中培养的星形胶质细胞的细胞核和F-肌动蛋白染色情况。（B）A图中方框区域的放大视图。白色箭头指示相邻细胞之间的TNT样结构。（C）代表性图像显示，不当样品处理后TNT样结构被破坏。（D）C图中方框区域的放大视图。黄色箭头指示被破坏的TNT样结构。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 星形胶质细胞通过隧道纳米管向神经元转移线粒体的染色

1. 星形胶质细胞接种与线粒体标记
   1. 将第3代（P3）分离的原代大鼠星形胶质细胞以每皿3 × 10⁴个细胞的密度接种于35 mm玻璃底培养皿中。加入2 mL DMEM/F-12完全培养基，该培养基补充有10%胎牛血清（FBS）和1%三联抗生素混合物（青霉素G、链霉素和两性霉素B）。将细胞在37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。
   2. 将细胞孵育约24小时，直至细胞贴壁。
   3. 细胞贴壁后，在弱光条件下将培养皿转移至洁净工作台。
      注意：操作过程中应尽量减少不必要的移动和振动，以保持膜纳米管（TNT）的完整性。
   4. 在避光条件下轻柔地移除培养基。在更换培养基时避免破坏膜纳米管。
      注意：更换培养基时应避免细胞表面完全干燥，否则膜纳米管可能塌陷并附着于培养基质上。
   5. 用二甲基亚砜（DMSO）溶解50 µg冻干的MitoTracker染料，配制1 mM储存液，并将储存液保存于−20°C。使用前，将储存液用400 µL补充有10% FBS和1%三联抗生素混合物的完全DMEM/F-12培养基稀释，得到终浓度为50 µM的MitoTracker工作液。
      警告：在配制和孵育过程中应避免荧光染料暴露于直射光下。
   6. 将线粒体染色工作液加入培养皿中。
   7. 在避光条件下，于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育细胞30分钟。
   8. 在避光条件下移除线粒体染色液。
   9. 用500 µL不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.3–7.5）轻柔洗涤细胞一次。沿培养皿壁缓慢加入和移除PBS，以避免洗涤过程中破坏细胞间的膜纳米管。
   10. 小心移除PBS。
2. 星形胶质细胞-神经元共培养
   1. 将第3代（P3）永生化小鼠海马神经元细胞以每皿3 × 10⁴个细胞的密度接种到含有星形胶质细胞的培养皿中。加入总体积为2 mL的培养基，该培养基由等体积的DMEM和DMEM/F-12完全培养基混合而成，并补充有10% FBS和1%三联抗生素混合物。采用直接接触法建立共培养体系，不使用Transwell插件。将细胞在37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。
      注意：加入神经元细胞时应轻柔操作，以尽量减少对已有膜纳米管结构的破坏。
   2. 在标准培养箱条件下维持共培养24小时，操作过程中注意保护样品避免不必要的光照。
3. 固定与通透
   1. 在避光条件下移除培养基。
   2. 用PBS洗涤细胞一次。
   3. 在室温、弱光条件下，用含4%多聚甲醛的组织细胞固定液固定细胞30分钟。
      警告：操作固定液时应佩戴适当的个人防护装备，并严格按照机构化学安全指南进行所有操作。
   4. 移除固定液。
   5. 用PBS洗涤细胞一次。
   6. 在室温、弱光条件下，用500 µL即用型Triton X-100通透液处理细胞20分钟。
      警告：Triton X-100可能破坏脆弱的膜纳米管结构。通透过程中应尽量减少过度震荡。
   7. 移除通透液。
   8. 用PBS洗涤细胞一次。
4. 荧光染色与成像
   1. 使用前立即配制染色液。将F-肌动蛋白染色染料用PBS稀释至终浓度1 µM，并使用DAPI作为即用型核染染料。使用前充分混匀染色液。
      注意：可使用基于鬼笔环肽的染色试剂替代F-肌动蛋白可视化。
   2. 使用前立即在避光条件下将F-肌动蛋白染色液与核染色液按1:1比例（等体积）混合。
   3. 将配制好的染色液加入培养皿中。
   4. 在37°C黑暗条件下孵育细胞30分钟。
   5. 移除染色液。
   6. 用PBS洗涤细胞三次，每次500 µL，每次洗涤1分钟。
   7. 加入1 mL PBS，以防止成像准备过程中细胞干燥。
   8. 使用配备×20物镜的尼康倒置共聚焦显微镜进行图像采集。DAPI使用405 nm激发光，F-肌动蛋白染色使用488 nm激发光，MitoTracker染色使用665 nm激发光。在室温、避光条件下以1024 × 1024像素分辨率采集图像。
   9. 每样本随机选取至少五个视野进行定性评估。评估细胞间膜连接中是否存在类似膜纳米管的结构以及线粒体相关的荧光信号（图2A 和 2B）。
      注意：染色后应立即采集图像，以尽量减少荧光衰减和膜纳米管结构的破坏。

图2：星形胶质细胞-神经元共培养系统中线粒体和隧道纳米管（TNTs）的荧光染色。（A）代表性共聚焦显微镜图像，显示在玻璃底培养皿中培养的星形胶质细胞和神经元的细胞核、线粒体及F-actin染色情况。星形胶质细胞呈现不规则的星状或多边形形态，并具有延伸的细胞突起，而神经元细胞则呈圆形或椭圆形，带有细长的类似神经突的结构。（B）A图中框选区域的放大视图。白色箭头指示细胞间与线粒体相关的类似隧道纳米管（TNT-like）结构。两种细胞群体主要根据其典型的细胞形态进行区分。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 线粒体与TNTs中Miro1的免疫荧光共定位染色

1. 星形胶质细胞接种与线粒体标记
   1. 将第3代（P3）分离的原代大鼠星形胶质细胞以每皿3 × 10⁴个细胞的密度接种至35 mm玻璃底培养皿中。每皿加入2 mL DMEM/F-12完全培养基，该培养基补充有10%胎牛血清（FBS）和1%三联抗生素混合物（青霉素G、链霉素和两性霉素B）。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。
   2. 将细胞孵育约24小时，直至细胞贴壁。
   3. 细胞贴壁后，将培养皿转移至弱光条件下的洁净工作台。
      注意：操作过程中应尽量减少不必要的移动和振动，以保持膜纳米管（TNT）的完整性。
   4. 在避光条件下轻柔地移除培养基。移除培养基时应避免破坏TNTs。
      注意：移除培养基时应避免细胞表面完全干燥，否则TNTs可能塌陷并附着于培养基质上。
   5. 用DMSO溶解50 µg冻干的MitoTracker染料，配制1 mM储存液，并将储存液于−20°C保存。使用前，将储存液用400 µL补充有10% FBS和1%三联抗生素混合物的完全DMEM/F-12培养基稀释，获得终浓度为50 µM的MitoTracker工作液。
      警告：在配制和孵育过程中应避免荧光染料暴露于直射光下。
   6. 将线粒体染色工作液加入培养皿中。
   7. 在避光条件下，将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育30分钟。
   8. 在避光条件下移除线粒体染色液。
   9. 用500 µL不含钙、镁离子的PBS（pH 7.3–7.5）轻柔洗涤细胞一次。沿培养皿壁缓慢加入和移除PBS，以避免洗涤过程中破坏细胞间的TNTs。
   10. 小心移除PBS。
2. 星形胶质细胞-神经元共培养
   1. 将第3代（P3）永生化小鼠海马神经元细胞以每皿3 × 10⁴个细胞的密度接种至含有星形胶质细胞的培养皿中。加入总体积为2 mL的培养基，该培养基为DMEM与DMEM/F-12完全培养基（1:1）的混合液，并补充有10% FBS和1%三联抗生素混合物。采用直接接触法建立共培养体系，不使用Transwell插件。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。
      注意：应轻柔加入神经元细胞，以尽量减少对已有TNT结构的破坏。
   2. 在标准培养箱条件下维持共培养24小时，操作过程中应避免样品暴露于不必要的光照下。
3. 固定与通透
   1. 在避光条件下移除培养基。
   2. 用PBS洗涤细胞一次。
   3. 在弱光条件下，室温下用含4%多聚甲醛的商品化组织细胞固定液（pH 7.2–7.4）固定细胞30分钟。
      警告：操作固定液时应佩戴适当的个人防护装备，并严格遵守机构化学安全指南进行所有操作。
   4. 移除固定液。
   5. 用PBS洗涤细胞一次。
   6. 在弱光条件下，室温下用500 µL即用型Triton X-100通透液处理细胞20分钟。
      警告：Triton X-100可能破坏脆弱的TNT结构。通透过程中应尽量减少过度震荡。
   7. 移除通透液。
   8. 用PBS洗涤细胞一次。
4. 封闭与免疫荧光染色
   1. 在弱光条件下，室温下用5%山羊血清封闭细胞1小时。封闭液通过将山羊血清以1:20比例稀释于PBS中配制而成。
   2. 移除封闭液。
   3. 将兔单克隆抗Miro1抗体用PBS按1:100比例稀释。将稀释后的初级抗体溶液加入培养皿中，于4°C孵育过夜（12–16小时）。
      注意：在整个染色过程中应避免荧光标记样品暴露于直射光下。
   4. 移除初级抗体溶液。
   5. 用PBS洗涤细胞三次，每次500 µL，每次洗涤1分钟。
   6. 将荧光标记的山羊抗兔IgG二抗用PBS按1:100比例稀释。每培养皿加入500 µL稀释后的二抗溶液，在避光条件下孵育1小时。
      注意：本研究未设置无一抗对照。未来实验应纳入适当的免疫荧光对照，以进一步验证染色特异性。
   7. 移除荧光二抗溶液。
5. 荧光复染与成像
   1. 染色液需在使用前立即配制。将F-肌动蛋白染色染料用PBS稀释至终浓度1 µM，并使用DAPI作为即用型核染剂。使用前充分混匀染色液。
      注意：基于鬼笔环肽的染色试剂可作为F-肌动蛋白可视化的替代方案。
   2. 将染色液加入培养皿中。
   3. 在37°C避光条件下孵育30分钟。
   4. 移除染色液。
   5. 用PBS洗涤细胞三次，每次500 µL，每次洗涤1分钟。
   6. 加入1 mL PBS，以防止成像准备过程中细胞干燥。
   7. 使用配备×20物镜的尼康倒置共聚焦显微镜进行图像采集。采用5 µm步长，在总成像范围40 µm内采集Z轴层扫图像（共8个光学切片）。DAPI使用405 nm激发光，F-肌动蛋白染色使用488 nm激发光，Miro1免疫染色使用594 nm激发光，MitoTracker染色使用665 nm激发光。在避光条件下、室温下以1024 × 1024像素分辨率采集图像。
   8. 每样本随机选取至少五个视野进行定性评估。评估内容包括类TNT结构、线粒体相关荧光信号，以及细胞间膜连接中Miro1与线粒体相关染色之间的明显共定位（图3A–3C）。
      注意：染色后应立即采集图像，以尽量减少荧光衰减和TNT结构的破坏。

图3：星形胶质细胞-神经元共培养系统中线粒体与Miro1在隧道纳米管（TNTs）内的共定位染色。（A）代表性共聚焦显微镜图像，显示在玻璃底培养皿中培养的星形胶质细胞和神经元的细胞核、线粒体、Miro1及F-actin染色结果。白色箭头指示在线粒体相关信号与Miro1在类似隧道纳米管（TNT-like）结构内明显共定位的区域。（B）相邻细胞间形成的类似隧道纳米管结构的三维重建Z轴层扫图像。（C）同一Z轴层扫图像的侧视图重建，显示相邻细胞间延伸的类似隧道纳米管结构。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在星形胶质细胞单培养体系中，经F-actin和细胞核染色后可观察到相邻细胞之间存在细长的膜突起（图1A 和 1B）。在邻近的星形胶质细胞之间检测到多个类似隧道纳米管（TNT-like）的结构，单个星形胶质细胞常与周围多个细胞形成连接。TNT样结构的成功保存与洗涤和固定过程中操作轻柔密切相关。在更换培养基或洗涤过程中若施加过度的机械扰动，会导致这些膜连接结构的可检测性降低并发生结构破坏，如不当样品处理后TNT样结构出现断裂所示（图1C 和 1D）。

在星形胶质细胞-神经元共培养体系中，经MitoTracker染色和共聚焦成像后，可在连接相邻细胞的TNT样结构内观察到与线粒体相关的荧光信号（图2A 和 2B）。这些结构同时与F-肌动蛋白及细胞核染色共同成像，以支持对TNT样连接的形态学评估。在成像制备过程中，适当的避光保护和减少洗涤强度有助于更好地保存荧光信号及TNT的形态结构。

在免疫荧光共定位实验中，在星形胶质细胞-神经元共培养样本的类似隧道纳米管（TNT-like）结构中，观察到与线粒体相关染色和Miro1免疫染色相对应的重叠荧光信号（图3A）。这些结果提示Miro1可能与定位于类似隧道纳米管结构中的线粒体存在关联。三维重建的Z轴层扫成像进一步支持了相邻细胞之间存在延伸的类似隧道纳米管结构（图3B和3C）。隧道纳米管的保存状态、荧光信号强度以及图像质量受到固定、通透和成像条件的影响。

讨论

上述实验方案中的第一个关键步骤是在固定前进行避光预处理。类隧道纳米管（TNT-like）结构极为脆弱，从培养箱中取出后保持避光条件对于在样品制备过程中维持荧光信号强度和结构完整性至关重要。第二个关键步骤是轻柔操作以进行PBS洗涤，尽量减少液体流动对类隧道纳米管结构造成的扰动。遵循这些关键操作步骤有助于保持类隧道纳米管结构的形态和稳定性，并提高后续成像结果的一致性。过度抽吸、洗涤时间过长或剧烈的液体搅动均可能导致样品处理过程中类隧道纳米管结构的塌陷或断裂。由于隧道纳米管（TNTs）具有高度动态的特性，其对光敏感。光照引起的光毒性可导致隧道纳米管结构破坏，使其难以观察¹¹。因此，在涉及隧道纳米管的实验过程中应始终保持避光条件。

细胞内线粒体的运动有助于细胞能量的分布，尤其在神经元中具有重要作用。研究表明，线粒体可沿肌动蛋白丝和微管移动¹²。最近的研究还表明，隧道纳米管（TNTs）可作为细胞间长距离通讯的结构，介导神经细胞之间的线粒体转移¹³。本研究所描述的方法学手段能够实现对神经细胞培养系统中类似隧道纳米管的结构以及与线粒体相关的荧光信号的可视化观察。先前的研究显示，神经细胞间的线粒体转移可能在帕金森病和脑缺血损伤等神经系统疾病中的组织修复和神经保护过程中发挥重要作用^14,15。利用本研究所述方法，观察到星形胶质细胞之间以及星形胶质细胞与神经元之间存在类似隧道纳米管的结构，且这些结构内部定位于与线粒体相关的荧光信号。

如先前研究¹⁰所述，MitoTracker 染色存在染料泄漏和非线粒体信号干扰的问题，这可能降低数据的可靠性。为克服这一局限性，未来的研究应采用更可靠的方法，例如基因编码的线粒体标记技术，以获得更具结论性的结果。在当前实验条件下，两种细胞类型主要依据细胞形态进行区分，这种方法可能降低细胞类型鉴定的特异性。未来的研究应结合细胞类型特异性的荧光标记，以提高共培养分析的准确性。Miro1 是一种定位于线粒体外膜的衔接蛋白，已被证实参与神经元中的线粒体运输过程^16,17。利用本研究中描述的免疫荧光共定位实验方案，在类似隧道纳米管（TNT-like）结构中观察到与线粒体相关染色和Miro1免疫染色相对应的重叠荧光信号。这些结果提示Miro1可能与定位于类似隧道纳米管结构中的线粒体存在潜在关联。然而，传统共聚焦显微镜的空间分辨率可能限制对薄层膜突起内分子共定位的明确评估。

我们进行了Z轴层扫成像以确认细胞间存在类似隧道纳米管（TNT）的结构，从而支持对这些膜连接结构的形态学验证。尽管本实验方案适用于大多数实验环境，但与活细胞成像相比，固定细胞的共聚焦成像可能在样品处理过程中导致脆弱的TNT样结构丢失，从而限制对TNT的准确定量¹⁸。此外，固定细胞成像无法明确判断线粒体转移的方向性，这有待未来研究进一步探讨。本方案为神经细胞培养体系中TNT样结构、线粒体相关信号及关联蛋白的染色提供了标准化的实验流程。相较于非标准化的洗涤与固定操作，本方案强调在成像前处理过程中对样品的轻柔操作以及荧光信号的保护。这些方法有助于提高TNT相关成像研究的实验一致性和可重复性。

总之，本研究提供了一种实用且广泛适用的实验室方案，用于对隧道纳米管（TNTs）进行定性评估，并研究通过类似TNT的结构进行的线粒体运输。然而，固定和洗涤等样品处理步骤可能会引入定量上的变异，与活细胞成像方法相比存在差异。此外，共聚焦显微镜的空间分辨率低于超分辨率显微镜，这限制了对TNTs精细结构的表征。另外，基于MitoTracker的线粒体染色易受染料泄漏和非特异性信号传递的影响，未来的研究应解决这些问题以提高实验的准确性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 三重抗生素混合液	Biosharp	BL142A	防止细胞培养过程中的细菌和真菌污染
4% 组织细胞固定液	Solarbio	P1110	细胞固定试剂
抗 Miro1 抗体	Abcam	AB319154	针对 Miro1 的一抗
星形胶质细胞	实验室分离的原代细胞	NA	星形胶质细胞从出生后1–3天的SD乳鼠大脑皮层中分离获得。通过GFAP染色确认分离细胞纯度>95%，所有实验均使用第3代（P3）细胞
星形胶质细胞培养基（DMEM/F-12）	Gibco	6125011	将DMEM与F-12按1:1体积比混合，添加10%胎牛血清（FBS）和1%三重抗生素
共聚焦显微镜	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	使用由NIS-Elements软件（版本5.4）控制的Nikon AX共聚焦显微镜（日本尼康公司）采集图像
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	细胞核染色染料
DMSO	BioFroxx	1084ML100	用于配制荧光染料储备液的溶剂
F-肌动蛋白染色染料	Thermo Fisher Scientific	A57243	用于可视化细胞骨架结构和隧道纳米管的F-actin染色试剂
胎牛血清	ExCell Bio	FSD500	为细胞培养提供必需营养成分
荧光二抗（山羊抗兔IgG）	ABclonal	AS039	用于免疫荧光染色的二抗
玻璃底细胞培养皿	NEST	801001	共聚焦显微镜成像用培养皿
山羊血清	Solarbio	210C051	免疫荧光染色封闭试剂
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	线粒体染色染料
神经元	中国科学院细胞库	HT22-GNM47	永生化的小鼠海马神经元细胞在DMEM完全培养基中维持培养。取第3代（P3）细胞用于后续实验
神经元细胞培养基（DMEM）	Servicebio	G4511-500ML	DMEM添加GlutaPlus和丙酮酸钠，不含HEPES，补充10%胎牛血清（FBS）和1%三重抗生素
磷酸盐缓冲液（PBS）	Servicebio	G4203-500ML	固定和染色过程中使用的洗涤缓冲液
Triton X-100	Solarbio	P1080	细胞通透试剂