小鼠背根神经节的解剖与分离

摘要

背根神经节（DRG）包含初级感觉神经元的胞体，并将外周感觉信号传递至脊髓。本方案描述了一种适用于小鼠背根神经节的解剖方法，可实现结构完整神经节的标准化分离、解剖节段的准确定位、为初学者提供直观操作指导，并减少操作过程中的组织损伤。

摘要

背根神经节（DRG）含有初级感觉神经元的胞体，是感觉信号从外周组织传递至脊髓的关键中继结构。它们在疼痛、神经损伤和神经退行性疾病的研究中发挥着重要作用。获取完整的DRG组织对于研究感觉神经元的功能特性、分子表达及病理改变至关重要。然而，由于DRG体积小且位于椎管深处，其准确定位与分离面临显著的技术挑战。本研究建立了一种小鼠DRG分离的标准化操作流程。该方法详细描述了DRG的解剖定位、椎管暴露以及神经节分离过程中的关键步骤，并配有代表性图像和视频记录。该技术可在解剖学引导下获取结构完整的DRG，适用于节段性鉴定，且可用于苏木精-伊红（H&E）染色和免疫荧光分析。与以往的DRG解剖方法相比，本方法可实现节段明确的神经节标准化回收，为初学者提供直观的解剖学指导，并减少操作过程中的组织损伤。

引言

背根神经节（DRG）含有初级感觉神经元的胞体，是将外周感觉信号（包括机械、温度和伤害性刺激）传递至脊髓的关键结构^1,2,3。尽管目前已有一些高质量的DRG相关资源，但仍需要详细的实验操作指导，以支持在同一标本中从胸段至骶段准确识别并分离DRG，同时在组织采集过程中最大限度地降低DRG受损的风险。

背根神经节（DRG）神经元是外周感觉通路的关键组成部分。其轴突分为两支，一支延伸至外周组织，另一支投射至脊髓背角，因此在疼痛传递、神经损伤、炎症反应以及多种神经系统疾病的发生机制中发挥重要作用⁴。此外，DRG在神经损伤修复、慢性疼痛机制、感觉神经元可塑性及神经免疫调控等研究领域也受到广泛关注^5,6。大量实验研究需要获取完整的DRG组织，用于免疫组织化学染色、RNA测序分析、原代神经元培养以及电生理学研究等应用⁷。因此，获取结构完整且节段定位准确的DRG组织，是开展感觉神经环路、神经元分子特征及病理改变研究的基础。

背根神经节位于椎间孔附近，并通过背侧根与脊髓相连。由于其体积较小、包埋于骨性结构内以及周围解剖结构复杂，完整分离背根神经节存在较大的技术挑战。此外，在组织采集过程中，缺乏清晰的解剖标志和标准化操作流程会增加结构损伤或节段误判的风险。

与现有的小鼠背根神经节（DRG）解剖方法相比，本研究建立的方法具有多项优势。首先，以往报道的小鼠DRG分离方法通常需要先将脊柱从动物体内取出，随后对分离的脊柱进行分段并沿中线切开，再从椎间孔中解剖出DRG。在此过程中，脊柱的横断和反复切割容易对DRG造成机械性损伤，也可能导致某些节段遗漏或节段定位不明确⁸。相比之下，本方法直接在小鼠体内原位操作，无需预先分离或横断椎柱，从而降低了组织采集过程中DRG丢失的风险。在整个操作过程中，器械主要作用于DRG周围的骨性结构和结缔组织，而非直接抓取或牵拉神经节本身，因而能够更好地保持其完整性。

其次，现有方法通常缺乏清晰且稳定的解剖学标志，难以准确识别不同的背根神经节（DRG）节段。由于在去除脊柱过程中与DRG相连的神经常被切断，因此很难依据神经的走行和分支模式准确判断各个DRG的节段来源。相比之下，我们的方法直接在完整标本上进行 原位 在小鼠中，该方法保留了背根神经节（DRG）、相连神经及周围结构之间的天然解剖关系，从而可根据神经连接和局部解剖标志识别不同的DRG节段。我们建议采用L2和L3的形态学特征作为关键解剖参考点，并结合L3–L5节段与坐骨神经的解剖关系，继而沿头侧和尾侧方向依次识别相邻节段。

此外，该方法对关键步骤提供了相对系统的描述，包括暴露脊柱和椎管、打开椎管以进一步暴露脊髓、暴露背根神经节（DRG），以及在体视显微镜引导下的定位与解剖。整个操作流程清晰，解剖标志明确，有助于提高操作的标准化程度和可重复性，尤其适合初学者。采用该方法获取的DRG组织完整性良好，因此非常适合后续分析，包括免疫荧光染色和苏木精-伊红（H&E）染色。

本研究建立了一种标准化的小鼠背根神经节（DRG）解剖与分离方法，并提供了用于解剖定位的示意图，以及取材过程的代表性图像和视频记录。该方法可在单个样本中实现从胸段到骶段DRG的分离，同时降低组织采集过程中对DRG造成损伤的风险。

方案

所有动物实验均严格遵循上海东方医院机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。本研究中描述的解剖操作使用成年C57BL/6小鼠（雄性或雌性，12周龄，25–30 g）进行。图1展示了本方案中使用的解剖器械。

1. 准备

注意：对于灌注固定的标本，应采取适当的防护措施，避免接触固定剂。解剖操作应在通风橱内或通风良好的实验台上进行，并在整个操作过程中穿戴适当个人防护装备，包括手套、防护服和护目镜。

1. 将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，环境温度维持在约24℃ °C 和 55% 的相对湿度下 随意 食物和水的获取。
2. 开始解剖前，将小鼠置于二氧化碳安乐死舱内，直至呼吸完全停止。确认动物死亡后，将其仰卧放置于解剖板上，并用大头针固定四肢以保持稳定的体位。
3. 用70%乙醇喷洒胸腹部区域的毛发，以减少毛发污染并保持手术区域清洁。
4. 使用剪刀沿胸腹部正中线切开皮肤。将切口沿腹侧正中线向头侧延伸，充分暴露胸腔。抬起胸骨下端，沿肋弓两侧剪开胸壁，打开胸腔并暴露心脏。必要时可去除部分胸骨和肋骨，以清晰暴露心脏。
5. 用剪刀在右心房做一小切口，以建立血液和灌注液的流出通道。用20 mL注射器吸取预冷的PBS（4℃）。 °C），并将针头缓慢插入心脏心尖附近的左心室。固定针头，避免刺穿心室壁。
6. 缓慢均匀地灌注预冷的PBS，直至肝脏变为苍白色、流出液变澄清，且大部分血液被冲洗干净。随后，将PBS替换为20 mL预冷的4%多聚甲醛（4% paraformaldehyde） °C）并以缓慢、稳定的速度继续灌注，直至四肢变僵硬、尾巴卷曲、组织颜色由红色变为苍白，表明固定已基本完成。
7. 灌注完成后，拔出针头，清除胸腔内残留液体，并立即进行组织采集。若下游分析需要未固定的组织，则仅使用预冷的PBS进行灌注，省略4%多聚甲醛固定步骤。
   注意：整个操作过程中应保持缓慢、稳定且均匀的灌注速度，以避免因压力过高导致心脏破裂或组织肿胀。上述所有操作均应在室温下进行。

2. 背根神经节及邻近神经（图2）

1. 脊柱和椎管的暴露（3–5 分钟）
   1. 将小鼠置于俯卧位，并固定在解剖板上。用剪刀沿背部皮肤正中线做纵向切口，切口从尾部向颈部延伸。
   2. 使用剪刀将背部皮肤与下方结缔组织分离，并将皮肤向两侧翻开，充分暴露背侧肌肉组织。用吸水纸擦去附着在结缔组织表面的毛发，或用生理盐水冲洗手术区域，以保持操作区域清洁。
   3. 沿脊柱两侧纵向切开背侧肌肉和结缔组织，充分暴露椎体结构。
      ​注意：切开背部组织时，应防止剪刀过度深入胸腔或腹腔，以免影响后续解剖操作。
   4. 使用咬骨钳仔细清除覆盖脊柱的结缔组织和残留肌肉。若残留组织影响视野，可根据需要使用剪刀修剪，以充分暴露椎柱。接着，从背侧用剪刀剪断颈椎，使脊柱头端与头部分离，以便后续操作。
2. 打开椎管并暴露脊髓（图3；8–10 分钟。
   1. 在颈椎水平将微型弯剪插入椎管，沿两侧椎板剪开以打开椎管。
      ​注意：操作过程中需注意避免损伤脊髓。
   2. 去除背侧椎板，逐步暴露脊髓的背侧面。
   3. 使用微型弯剪沿脊柱纵轴继续剪除椎板，从胸段逐步延伸至骶段，以充分暴露脊髓背侧。
3. 背根神经节的暴露（图4；8–10 分钟
   1. 完全暴露脊髓背侧表面后，使用咬骨钳轻轻向两侧横向打开椎管结构，并交替操作左侧与右侧。
   2. 当椎管两侧已完全分离后，在体视显微镜下观察位于椎间孔内的背根神经节。
4. 背根神经节的识别（图5；8–10 分钟
   1. 当椎管已完全向两侧翻开且脊髓充分暴露后，在体视显微镜下观察从脊髓背侧发出的背根神经束。沿背根向两侧追踪，于椎间孔附近识别呈椭圆形或卵圆形结构的背根神经节。
   2. 确认在鉴定过程中，背根神经节位于脊神经背根与椎间孔的交界处，并观察到其在每个脊髓节段呈双侧成对排列。将背根神经节鉴定为由感觉神经元胞体构成的神经节，一侧伸入脊髓背角，另一侧延伸至外周组织。
   3. 使用体视显微镜识别背根神经节，其呈淡黄色或灰白色、轻度肿胀、形态较饱满且边界相对清晰的结构。
5. 进行DRG的节段性鉴定与解剖（图6；8–10 分钟
   1. 在体视显微镜下使用显微外科镊子轻轻抬起背根神经束，从而充分暴露附着的背根神经节。
   2. 利用以下特征确定背根神经节的节段身份：指定与多分支神经纤维相连的背根神经节（>将连接到分叉神经纤维（两个分支）的背根神经节指定为L2及更颅侧的DRG，将连接到双分支神经纤维（仅两个分支）的背根神经节指定为L3及更尾侧的DRG。随后，根据椎间孔的位置，依次识别其上方和下方剩余的DRG节段。
      注意：由L3–L5节段DRG发出的神经纤维汇合形成坐骨神经。
   3. 使用显微外科弯剪或显微外科镊子仔细分离环绕背根神经节的结缔组织和神经纤维，并逐步将神经节从椎间孔周围组织的附着处游离出来。
   4. 横断连接背根神经节与脊髓的背根神经纤维，同时切断向周围延伸的神经束，以分离神经节。
   5. 使用显微外科镊子小心分离背根神经节。如果需要长期保存并进行后续免疫荧光分析，应立即将分离的背根神经节放入含有4%多聚甲醛的0.5 mL离心管中，固定组织3小时。固定后，用缓冲液洗涤组织3次 × 用0.1 M PBS（主要成分：NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4）冲洗5分钟，将组织转移至30%蔗糖溶液中脱水至沉底。最后将组织包埋于OCT中，并于−80 ℃保存 °C 用于长期保存。

3. 确认神经节组分。

1. H&E 染色结果（图7)
   1. 将分离的DRG立即置于常规组织学固定液（例如4%多聚甲醛）中固定。固定后，用0.1 M磷酸缓冲液冲洗组织，按照标准组织学程序进行脱水、透明和石蜡包埋，并制备4–6 μm切片。 µ用于后续染色分析的 m 组织切片。
   2. 进行苏木精和伊红（H&E）染色&E) 染色以评估 DRG 的整体结构和细胞形态。利用染色切片识别神经节的细胞成分和组织结构，并评估所收获 DRG 的质量。
   3. 检查 H&在显微镜下观察 H&E 染色切片，确认背根神经节主要由大量感觉神经元胞体构成。辨认具有大而圆形至卵圆形胞体的神经元，并观察其清晰可见的细胞核以及部分神经元中明显的核仁。同时确认卫星胶质细胞紧密围绕神经元排列成特征性的环状结构。
   4. 检查神经节内部，辨认神经纤维束和结缔组织隔膜，以确认整体组织结构完整且层次清晰。验证细胞边界清晰，无明显组织破坏或结构紊乱现象。
   5. 在H中确认DRG成功分离&E 染色通过整体结构的保留情况、清晰的细胞形态以及无明显机械损伤来评估。通过观察细胞结构的破坏、组织边缘模糊或解剖与处理过程中出现的局部组织破坏，来检测样本损伤。使用这些 H&E结果作为评估DRG采集质量和组织完整性的实用依据。
2. TUBB3 免疫荧光染色结果（图8)
   1. 将分离的DRG立即用4%多聚甲醛固定3小时。固定完成后，用0.1 M PBS冲洗组织三次，每次5分钟。随后将组织置于30%蔗糖溶液中直至沉底，包埋于OCT中，并切8–12 μm的冷冻切片 µ用于后续免疫荧光染色。
   2. 将切片 warming 至室温，用 PBS 冲洗 3 次 × 5 分钟，然后使用 Tris-EDTA 抗原修复液进行抗原修复。将切片自然冷却至室温，再次洗涤 3 次 × 用 PBS 洗涤 5 分钟，室温下用 5% BSA 封闭 30–60 分钟。封闭后，加入荧光标记的 TUBB3 一抗，4 ℃孵育过夜 °C. 第二天，用 PBS 清洗切片三次，用 DAPI 染色细胞核，封片后使用荧光显微镜采集图像。
   3. 检查DRG切片，确认保存良好的样本应显示清晰的神经节轮廓、完整的组织结构以及有序的细胞排列。观察TUBB3免疫荧光主要位于感觉神经元胞体和神经纤维中，以界定神经节内神经元的整体分布。使用DAPI复染，将较大的TUBB3阳性细胞鉴定为感觉神经元，并注意到围绕这些细胞分布的小型DAPI阳性细胞核呈现出与卫星胶质细胞核形态一致的特征。通过组织连续性中断、TUBB3信号定位异常、神经元形态不清或局部背景信号增强等现象，识别由解剖或处理过程引起的损伤。
   4. 应用TUBB3免疫荧光染色作为评估DRG组织完整性的补充指标。成功的DRG分离表现为保留完整的神经节轮廓、感觉神经元胞体和神经纤维中出现明显的荧光信号、清晰的细胞形态以及背景染色极少。

结果

成功的背根神经节（DRG）分离需要保持神经节的完整性，不得有明显的压迫、压碎或撕裂。应轻柔提起与外侧相连的神经纤维，逐步将神经节从周围组织中游离，并仅在神经节已完全松解后，再横断相连的神经纤维，以确保其完整取出。操作过程中应避免使用器械直接牵拉神经节本体。分离后，应尽可能保持背根神经节在椎间孔内的天然形态。在去除附着的周围组织后，分离出的神经节应呈扁平状、椭圆形且半透明。具有上述形态学特征的样本可视为成功获取。

相比之下，分离失败通常表现为神经节主体的结构损伤，例如因牵拉相连的神经纤维导致的破裂，或因镊子或剪刀操作不当造成的穿刺。此外，原有扁平椭圆形形态的破坏，或因压迫导致的明显结构变形和组织损伤，也应被视为分离失败的证据（图9）。

在标准化操作条件下，可从两侧获取完整的背根神经节（DRG）。对于初学者而言，技术熟练程度可能最初有限；然而，该操作流程仍可提供适用于后续组织学分析的DRG样本。就操作耗时而言，初学者通常需要约40–60分钟完成整个流程，而技术熟练后可将时...

讨论

背根神经节（DRG）是周围感觉神经系统的关键组成部分，在将机械、温度和伤害性感觉信息传递至中枢神经系统中发挥着至关重要的作用^9,10,11。DRG神经元具有典型的假单极形态，其中一个突起延伸至外周组织，另一个突起投射至脊髓背角，因此在生理和病理条件下均参与感觉信号的传递、神经损伤修复以及慢性疼痛的发生发展^12,13,14。本研究建立的解剖方法系统性地描述了从小鼠胸段至骶段背根神经节的暴露、识别与分离过程。与其他DRG分离方法相比，该方案可实现从胸段到骶段多个节段神经节的获取，提高了节段识别的解剖学指导性，减少了组织损伤，并增强了初学者操作的可重复性。

该方法的关键步骤包括依次暴露脊柱和椎管，打开椎管以暴露脊髓，暴...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 离心管	未指明	未指明	用于固定背根神经节的储存
20 mL 注射器	未指明	未指明	用于心脏灌注
30% 蔗糖溶液	未指明	未指明	用于OCT包埋前组织脱水
4% 多聚甲醛	Servicebio	G1101
5% BSA	Solarbio	SW3015
70% 乙醇	未指明	未指明	用于解剖前减少毛发污染
吸水纸	未指明	未指明	用于去除结缔组织中的毛发
成年 C57BL/6 小鼠	Vital River	未指明	雄性或雌性；12 周龄；25–30 g
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG	Servicebio	GB25303
抗 TUBB3 抗体	Proteintech	CL488-66375	用于 TUBB3 免疫荧光染色
二氧化碳安乐死舱	未指明	未指明	用于实施安乐死
DAPI	Servicebio	G1012
解剖板	未指明	未指明	用于在解剖过程中固定小鼠
荧光显微镜	未指明	未指明	用于成像免疫荧光染色切片
Friedman-Pearson 骨剪	RWD	S21022-14	摘自文稿：骨剪（RWD，S21022-14）
苏木精-伊红（H&E）染色试剂盒	Servicebio	G1005
显微外科弯剪	ASSI	SDCT16R8	摘自文稿：显微弯剪（ASSI，SDCT16R8）
显微外科镊	Fine Science Tools	11254-20	摘自文稿：显微外科镊（FST，11254-20）
OCT 包埋剂	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
大头针	未指明	未指明	用于将四肢固定在解剖板上
生理盐水	未指明	未指明	用于冲洗手术区域
剪刀	Fine Science Tools	14060-09	摘自文稿：剪刀（FST，14060-09）
体视显微镜	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	10447197	摘自文稿：体视显微镜（Leica，10447197）
Tris-EDTA 抗原修复液	Solarbio	C1038