FTY720 增强耐药性急性髓系白血病细胞对阿霉素的敏感性

摘要

本方案通过评估细胞活力、细胞凋亡、细胞内阿霉素蓄积、药物外排转运蛋白表达以及蛋白激酶B/雷帕霉素机械靶点信号通路，研究FTY720如何增强耐药性急性髓系白血病细胞对阿霉素的敏感性。

摘要

化疗耐药性仍是急性髓系白血病有效治疗的主要障碍之一，部分原因是耐药性白血病细胞会减少细胞内药物暴露并逃避凋亡。FTY720 是一种鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂，在多种肿瘤模型中已报道具有抗增殖和化疗增敏作用。然而，FTY720 是否能提高阿霉素耐药的急性髓系白血病细胞对阿霉素的敏感性，以及该效应是否与药物外排转运蛋白及蛋白激酶 B/雷帕霉素机制靶点信号通路的变化相关，目前尚不明确。本研究评估了 FTY720 单独使用及与阿霉素联用在亲本急性髓系白血病细胞系（HL60 和 K562）及其阿霉素耐药衍生物（HL60/A 和 K562/A）中的作用。采用细胞计数试剂盒-8 检测细胞活力，通过 Annexin V/碘化丙啶流式细胞术检测凋亡，流式细胞术定量细胞内阿霉素积累量，并通过流式细胞术和蛋白质印迹法检测 P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白 1、蛋白激酶 B/雷帕霉素机制靶点通路蛋白以及凋亡相关蛋白的表达。FTY720 表现出剂量依赖性的细胞毒性，并提高了耐药白血病细胞对阿霉素的敏感性。联合治疗降低了细胞活力，增加了凋亡细胞比例，增强了细胞内阿霉素的积累，并降低了 P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白 1 的表达。FTY720 处理还与蛋白激酶 B 和雷帕霉素机制靶点磷酸化水平降低相关，而蛋白激酶 B 激活剂 SC79 部分逆转了上述信号通路变化、转运蛋白表达及凋亡效应。这些结果表明，FTY720 可提高 HL60/A 和 K562/A 细胞对阿霉素的敏感性，该效应与蛋白激酶 B/雷帕霉素机制靶点信号通路活性降低、药物外排转运蛋白表达减少、细胞内阿霉素积累增加以及凋亡增强相关。由于本研究仅限于体外细胞系模型，因此在得出治疗性结论之前，尚需在原代白血病样本及体内系统中进一步验证。

引言

急性髓系白血病是一种起源于造血干细胞和祖细胞恶性转化的异质性血液系统恶性肿瘤。它是成人中最常见的急性白血病类型，仍与较差的长期生存率相关。尽管治疗策略已有所改进，基于阿糖胞苷联合蒽环类药物的诱导化疗仍是治疗的基石。然而，许多患者会出现原发性或获得性耐药，导致疾病复发、难治性疾病以及不良的临床结局^1,2,3。因此，阐明降低阿霉素敏感性的机制，仍是急性髓系白血病研究中的一个重要目标。

阿霉素耐药是一个多因素参与的过程。耐药性白血病细胞可通过上调腺苷三磷酸结合盒药物外排转运蛋白的表达或活性，降低细胞内药物浓度，其中包括由腺苷三磷酸结合盒家族B亚族成员1（ABCB1）基因编码的P-糖蛋白，以及由腺苷三磷酸结合盒家族C亚族成员1（ABCC1）基因编码的多药耐药相关蛋白1⁴。蛋白激酶B和雷帕霉素靶蛋白信号通路的激活也可促进白血病细胞存活，抑制细胞凋亡，并导致治疗耐药⁵。这些机制共同作用，减少细胞内阿霉素的蓄积，从而削弱其细胞毒性效应。由于毒性作用、疗效有限以及代偿性耐药机制的存在，直接靶向多药耐药转运蛋白的药物开发面临挑战⁶。同样，针对蛋白激酶B和雷帕霉素靶蛋白信号通路的抑制剂也面临转化应用的困难，包括剂量依赖性毒性、疗效受限以及通路适应性改变等问题^7,8。

FTY720（也称为芬戈莫德）是一种鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂，已获得美国食品药品监督管理局批准用于治疗多发性硬化症，并因其潜在的抗癌作用而受到关注⁹。除了其免疫调节活性外，FTY720在多种临床前肿瘤模型中已显示出抗增殖、促凋亡以及增强治疗敏感性的效果，这些肿瘤模型包括前列腺癌、肝细胞癌、肺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤和胶质母细胞瘤^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}。既往研究表明，FTY720可在乳腺癌中增强阿霉素的活性，在顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中提高其对顺铂的敏感性，并通过调节磷脂酰肌醇3-激酶信号通路使顺铂耐药的黑色素瘤细胞重新恢复敏感性^20,21,22。这些发现提示，FTY720可能影响耐药癌细胞中的生存信号通路和药物滞留机制。然而，FTY720是否能提高阿霉素耐药的急性髓系白血病细胞对阿霉素的敏感性，以及这种效应是否与细胞内阿霉素蓄积、药物外排转运蛋白表达、凋亡以及蛋白激酶B/雷帕霉素机制靶点信号通路的协调变化相关，目前尚不明确。

本研究旨在利用阿霉素耐药的急性髓系白血病细胞模型 HL60/A 和 K562/A 及其相应的亲本细胞系来填补这一空白。我们假设，FTY720 可能通过降低药物外排转运蛋白的表达、增加细胞内阿霉素蓄积以及促进凋亡来提高阿霉素的敏感性，其中蛋白激酶 B/雷帕霉素机制靶点信号通路可能作为相关的调控通路参与其中。为验证该假设，评估了单独或联合使用 FTY720 与阿霉素处理后细胞活力、半数抑制浓度值、细胞凋亡、细胞内阿霉素蓄积、转运蛋白表达以及信号蛋白的变化。由于所有实验均在细胞系模型中进行，研究结果被解读为in vitro的机制性证据，而非临床疗效的直接证据。

方案

本研究使用已建立的人急性髓系白血病细胞系及其阿霉素耐药衍生细胞系进行。未涉及人类受试者、动物或来源于患者的原代样本，因此无需机构审查委员会对涉及人类受试者的研究进行审批，也无需动物伦理审批。细胞系来源于中国天津的中国医学科学院血液病研究所，并在福建医科大学附属协和医院福建省血液病研究所维持培养。实验前通过核型分析和形态学评估确认细胞系身份，所有细胞培养物均经过支原体污染检测。本实验方案中使用的化学品、仪器和软件列于材料表中。

1. 细胞培养及耐药表型的验证

人急性髓系白血病HL60和K562细胞及其阿霉素耐药衍生物HL60/A和K562/A购自中国天津的中国医学科学院血液学研究所。细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养，培养条件为37 °C、5%二氧化碳的湿化培养箱。

HL60/A 细胞在含有 1 µg/mL 阿霉素的完全培养基中维持培养，K562/A 细胞在含有 5 µg/mL 阿霉素的完全培养基中维持培养，以保持其耐药表型。在实验检测前 1 个月从培养基中去除阿霉素，以避免在处理实验期间产生急性药物筛选效应。

实验前，通过比较亲本细胞和耐药细胞的阿霉素半数抑制浓度值，重新确认耐药表型。通过重复阿霉素敏感性检测并检测基础P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白1的表达水平，评估无药培养1个月后的耐药稳定性。只有当耐药细胞亚系的阿霉素半数抑制浓度值和转运蛋白表达水平均高于其亲本细胞时，才用于后续实验。

2. 药物制备与处理方案设计

FTY720、阿霉素和SC79根据制造商说明书配制成储备液。FTY720和SC79溶于二甲基亚砜，阿霉素用推荐的溶剂配制，并在操作过程中避光保存。工作液于处理前用完全培养基新鲜稀释。各处理组中二甲基亚砜的终浓度保持一致，且不超过0.1%。

对照组给予与相应处理组相同的终浓度二甲基亚砜。在联合处理实验中，采用5 µM FTY720作为增敏浓度。在细胞凋亡和细胞内阿霉素累积实验中，HL60/A细胞使用4 µM阿霉素，K562/A细胞使用8 µM阿霉素，除非另有说明。

3. 细胞活力检测与半数抑制浓度计算

将细胞以每孔100 µL完全培养基中接种1 × 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中。进行FTY720单药处理实验时，HL60、K562、HL60/A和K562/A细胞分别用0、3.125、6.25、12.5、25、50和100 µM的FTY720处理48小时。进行阿霉素敏感性实验时，HL60/A和K562/A细胞在有或无5 µM FTY720的条件下，分别用系列浓度的阿霉素处理48小时。

按照制造商说明书，使用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8）检测细胞活力。处理后，向每孔加入Cell Counting Kit-8试剂，在37 °C孵育2小时。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。

相对细胞活力的计算公式如下：相对细胞活力 = [（处理孔的吸光度 - 空白孔的吸光度）/（溶剂对照孔的吸光度 - 空白孔的吸光度）] × 100%

使用 GraphPad Prism 9.5 版本中的四参数非线性回归逻辑剂量-反应模型计算半数抑制浓度（IC50）值。每次实验包含三个独立的生物学重复，每种处理条件下设三个技术重复孔。

4. 药物联合分析

通过比较在有或无FTY720存在下阿霉素的剂量-反应关系，评估FTY720对阿霉素敏感性的影响。HL60/A和K562/A细胞分别用系列浓度的阿霉素单独处理，或与FTY720联合处理48小时。

使用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8）检测细胞活力，并通过四参数逻辑剂量-反应模型的非线性回归计算半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration）值。根据剂量-反应曲线的偏移以及不同处理组之间半数抑制浓度值的差异，解读阿霉素敏感性的变化。

由于实验并非设计为完整的固定比例剂量矩阵研究，因此未进行正式的联合指数分析。因此，结果被解读为表明阿霉素敏感性发生改变的证据，而非明确的药理学协同作用。

5. 通过Annexin V和碘化丙啶流式细胞术分析细胞凋亡

将HL60/A和K562/A细胞以4 × 10⁵ 个细胞/mL的密度接种至6孔板中，分别用溶剂对照、单独FTY720、单独阿霉素或阿霉素联合FTY720处理48小时。在联合处理组中，HL60/A细胞采用5 µM FTY720与4 µM阿霉素联合处理，K562/A细胞则采用5 µM FTY720与8 µM阿霉素联合处理。

处理后，收集细胞，包括悬浮在培养基中的细胞，并用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤两次。按照细胞凋亡检测试剂盒生产商推荐的浓度，将细胞重悬于Annexin V结合缓冲液中。每个样品加入5 µL Annexin V-异硫氰酸荧光素或Annexin V-别藻蓝蛋白以及5 µL碘化丙啶进行染色，随后在室温避光孵育15分钟。

样品立即通过流式细胞术进行分析。使用未染色对照、单染对照和荧光减一对照来设置补偿和象限门。通过前向散射光和侧向散射光设门排除碎片。早期凋亡细胞定义为Annexin V阳性且碘化丙啶阴性的细胞，晚期凋亡或死亡细胞定义为Annexin V阳性和碘化丙啶阳性的细胞。总凋亡率计算为早期和晚期凋亡细胞比例之和。每个样本至少采集10,000个有效的单细胞事件。

6. 细胞内阿霉素累积测定

将HL60/A和K562/A细胞以4 × 10⁵ 个细胞/mL的密度接种至6孔板中，培养过夜。随后，细胞分别接受溶剂对照、单独阿霉素处理，或阿霉素联合5 µM FTY720处理。HL60/A细胞使用4 µM阿霉素处理，K562/A细胞使用8 µM阿霉素处理。细胞于37 °C孵育4小时，并避光保护。

处理后，收集细胞并用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤两次，以去除细胞外的多柔比星。将细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，利用多柔比星的内在荧光通过流式细胞术进行分析。未处理的细胞用于确定背景自发荧光，而多柔比星处理的细胞则作为荧光阳性对照。在排除碎片和聚集体后，细胞内多柔比星的累积量以中位荧光强度进行量化。在每次独立实验中，中位荧光强度值均归一化至仅使用多柔比星处理组的水平。

7. P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白1表达的流式细胞术分析

将HL60/A和K562/A细胞以2 × 10⁶ 个细胞/mL的密度接种至6孔板中，并用5 µM FTY720或溶剂对照处理24小时。处理结束后，细胞用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后重悬于100 µL细胞染色缓冲液中。

细胞使用藻红蛋白标记的抗P-糖蛋白抗体和Alexa Fluor 647标记的抗多药耐药相关蛋白1抗体，按照制造商推荐的稀释比例进行染色。实验中设置了同型对照、未染色对照、单染对照以及荧光减一对照，用于圈门和补偿调节。样品在4 °C避光孵育30分钟，用细胞染色缓冲液洗涤两次后，重悬于500 µL细胞染色缓冲液中，随后上机检测。

采用 BD FACScan 流式细胞仪进行流式细胞术检测。每个样本至少采集 10,000 个存活的单细胞事件。P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白 1 的表达水平通过中位荧光强度进行量化，即在实验组信号中减去相应同型对照信号后获得。标准化后的数值以每项独立实验中溶剂对照组为参照进行相对表达。

8. 蛋白质印迹与密度测定定量分析

经过指定处理后，收集细胞并用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤两次。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解缓冲液提取总蛋白。采用二辛可宁酸蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。

每泳道上样 30 µg 蛋白质，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至聚偏二氟乙烯膜上。使用含 0.1% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水配制的 5% 脱脂牛奶或 5% 牛血清白蛋白溶液，在室温下封闭膜 1 小时。

膜在4 °C下与针对总蛋白激酶B、磷酸化蛋白激酶B、总雷帕霉素机械靶点、磷酸化雷帕霉素机械靶点、剪切型caspase-3、剪切型多聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶、P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白1以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶的一抗孵育过夜。洗涤后，膜在室温下与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。使用增强型化学发光检测法显影蛋白条带。

使用 ImageJ 软件（版本 1.53t）对条带强度进行定量分析。磷酸化蛋白激酶 B 的表达水平以总蛋白激酶 B 为参照进行归一化，磷酸化雷帕霉素机械靶点的表达水平以总雷帕霉素机械靶点为参照进行归一化。P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白 1、裂解型半胱天冬酶-3 和裂解型聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶的表达水平则以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为参照进行归一化。归一化后的数据以相对于溶剂对照组或单独多柔比星处理组的倍数变化表示，具体参照组取决于比较条件。所有蛋白质印迹分析均基于三次独立的生物学重复实验。未经裁剪的蛋白质印迹图像已存入公共数据存储库或作为补充文件上传。

9. SC79 救援实验

为了检测蛋白激酶B信号通路是否与FTY720的观察效应相关，在存在或不存在蛋白激酶B激活剂SC79的情况下，对HL60/A和K562/A细胞进行了FTY720处理。细胞先用5 µM FTY720预处理12小时，随后再用30 µM SC79或溶剂对照处理额外的12小时。

处理后，通过蛋白质印迹法检测磷酸化蛋白激酶B、磷酸化雷帕霉素机械靶点、P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白1的水平。同时，在阿霉素、FTY720和SC79处理后，通过Annexin V和碘化丙啶染色评估细胞凋亡。将挽救效应解释为与通路相关的证据。由于未进行基因过表达或敲低实验，因此对因果关系的结论持谨慎表述。

10. 统计分析与数据报告

统计分析使用 GraphPad Prism 9.5 版和 IBM SPSS Statistics 23.0 版进行。生物学重复定义为在不同日期使用独立培养的细胞进行的独立实验。技术重复定义为同一生物学实验内重复的孔或重复的测量。

数据以均值 ± 均值标准误表示，除非另有说明。当数据近似正态分布时，两组之间的比较采用非配对双尾 Student t 检验进行分析。三组或更多组之间的比较采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 事后检验。对于涉及两个独立因素（如药物浓度和处理条件）的实验，采用双因素方差分析，并随后进行适当的多重比较校正。

当数据不符合正态性假设时，采用非参数检验。尽可能报告精确的 p 值。经多重比较校正后，统计学显著性定义为 p < 0.05。所有图注均注明了生物学重复次数、所用统计检验方法、误差线含义以及显著性阈值。尽可能在散点图中展示单个生物学重复的数值，或将其叠加在柱状图上。

结果

FTY720 降低了亲代和阿霉素耐药的急性髓系白血病细胞的存活能力

HL60、K562、HL60/A 和 K562/A 细胞经不同浓度 FTY720（0、3.125、6.25、12.5、25、50 和 100 µM）处理 48 小时后，采用细胞计数试剂盒-8 检测细胞活力。FTY720 以浓度依赖性方式降低所有四种细胞系的细胞活力（图1A计算得到的半数抑制浓度（IC50）值分别为：HL60细胞17.347 ± 1.549 µM，HL60/A细胞12.207 ± 0.860 µM；K562细胞15.457 ± 1.138 µM，K562/A细胞20.677 ± 2.083 µM。图1B 和 表1).

讨论

化疗耐药仍然是急性髓系白血病有效治疗的主要障碍之一。对于诱导治疗无效或初始缓解后出现复发的患者，即使接受以阿糖胞苷和蒽环类为基础的治疗方案，耐药性白血病细胞仍可持续存在，因此寻找能够提高药物敏感性的策略成为一个重要的实验与临床问题²³。多柔比星是一种具有广谱抗肿瘤活性的蒽环类药物，但其临床应用受到累积毒性以及恶性细胞获得降低胞内药物浓度或削弱凋亡诱导能力等耐药机制的限制²⁴。在此背景下，能够提高多柔比星敏感性且不单纯依赖剂量增加的干预手段，可能为克服耐药提供有价值的实验线索。

本研究评估了FTY720是否能够提高阿霉素耐药的急性髓系白血病细胞模型对阿霉素的敏感性。FTY720降低了亲代和耐药白血病细胞的细胞活力，并增强了HL60/A和K562/A细胞对阿霉素的反应，联合治疗后阿霉素的半数抑制浓度（IC50）值降低即证明了这一点。然而，这些结果应被解释为阿霉素敏感性增加，而非明确的药理学协同作用，因为尚未进行正式的联合指数或等效药物相互作用分析。这一区别至关重要，因为仅凭半数抑制浓度的降低...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔组织培养板	Corning / Costar	3516 或经实验室验证的等效产品	用于处理、凋亡、阿霉素积累及蛋白表达实验。
96孔组织培养板	Corning / Costar	3599 或经实验室验证的等效产品	用于Cell Counting Kit-8检测。
Alexa Fluor 647小鼠免疫球蛋白G1同型对照	BioLegend	400130 或经实验室验证的等效产品	Alexa Fluor 647标记抗体染色的同型对照。使用试剂瓶上标注的确切货号。
Alexa Fluor 647标记抗人多药耐药相关蛋白1 / ABCC1抗体	BioLegend	370103	用于流式细胞术检测多药耐药相关蛋白1。由于部分BioLegend MRP1产品已停产或被替代，需确认产品供应情况。
含碘化丙啶的Annexin V细胞凋亡检测试剂盒	BioLegend	640914 或经实验室验证的等效产品	用于通过流式细胞术进行Annexin V与碘化丙啶凋亡分析。若使用Annexin V-别藻蓝蛋白而非Annexin V-异硫氰酸荧光素，应替换为对应试剂盒的确切货号。
二辛可宁酸蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific / Beyotime / 经实验室验证的供应商	使用实际货号	用于蛋白浓度测定。
二氧化碳细胞培养孵箱	Thermo Fisher Scientific / Eppendorf / 经实验室验证的仪器	根据实验室记录填写型号	维持细胞在37 °C 和5%二氧化碳条件下培养。
Caspase-3抗体	Cell Signaling Technology	9662；RRID:AB_331439	通过Western blot检测全长及剪切型caspase-3。若使用剪切型caspase-3特异性抗体，应替换为确切货号。
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	用于细胞活力及半数最大抑制浓度检测。
细胞染色缓冲液	BioLegend	420201	用于流式细胞术染色过程中的抗体稀释与洗涤。
剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抗体	Cell Signaling Technology	94885；RRID:AB_2800237	用于Western blot检测剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶。
CompuSyn	ComboSyn, Inc.	1.0版或经实验室验证的版本	若具备完整的联合用药剂量数据，用于Chou-Talalay联合指数分析。
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich / Merck	D2650 或经实验室验证的等效产品	FTY720与SC79储备液的溶剂；终浓度不超过0.1%。
盐酸阿霉素	使用实验室采购记录中的实际供应商	使用实际货号与批号	用于耐药维持与处理实验的蒽环类药物。此项必须与实验中实际使用的试剂一致。
增强型化学发光底物	Thermo Fisher Scientific / MilliporeSigma / 经实验室验证的供应商	使用实际货号	用于Western blot信号检测。
胎牛血清	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099-141 或经实验室验证的等效产品	以10%比例加入培养基。所有实验中应一致使用经热灭活或未经热灭活的血清。
流式细胞仪	BD Biosciences	BD FACScan 或实际仪器型号	用于凋亡、细胞内阿霉素积累及转运蛋白表达检测。若有，应在补充方法中记录激光/滤光片配置。
流式细胞术分析软件	BD Biosciences / FlowJo / 经实验室验证的软件	根据实验室记录填写版本	用于补偿、设门及中位荧光强度分析。
FTY720 / 盐酸芬戈莫德	使用实验室采购记录中的实际供应商	使用实际货号与批号	药物处理试剂。此项必须与实验中实际使用的试剂一致。除非实验使用了该产品，否则不得替换为其他供应商。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体	Abcam	ab181602	Western blot的上样对照。提交前需根据产品说明书确认RRID。
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.5版	用于剂量-反应曲线拟合、半数最大抑制浓度计算及统计分析。
HL60人急性髓系白血病细胞	中国医学科学院血液病研究所，天津，中国	本研究中未列入商业目录	人急性髓系白血病亲本细胞系；使用前通过核型与形态学鉴定。若需公开参考，HL60对应RRID:CVCL_0002。
HL60/A阿霉素耐药细胞	中国医学科学院血液病研究所，天津，中国	未列入商业目录	HL60细胞的阿霉素耐药衍生株；由福建省血液病研究所维持培养。在无药培养前，以1 µg/mL阿霉素维持耐药性。
辣根过氧化物酶标记抗兔免疫球蛋白G二抗	Cell Signaling Technology / Abcam / 经实验室验证的供应商	使用实际货号	Western blot二抗。根据实验室记录填写确切供应商与货号。
IBM SPSS Statistics	IBM	23.0版	用于统计分析。
ImageJ	美国国立卫生研究院	1.53t版	用于Western blot条带密度定量分析。
K562人白血病细胞	中国医学科学院血液病研究所，天津，中国	本研究中未列入商业目录	人白血病亲本细胞系；使用前通过核型与形态学鉴定。若需公开参考，K562对应RRID:CVCL_0004。
K562/A阿霉素耐药细胞	中国医学科学院血液病研究所，天津，中国	未列入商业目录	K562细胞的阿霉素耐药衍生株；由福建省血液病研究所维持培养。在无药培养前，以5 µg/mL阿霉素维持耐药性。
酶标仪	BioTek / Thermo Fisher Scientific / Molecular Devices / 经实验室验证的仪器	根据实验室记录填写型号	用于Cell Counting Kit-8检测中450 nm吸光度的测定。
用于Western blot的多药耐药相关蛋白1抗体	Cell Signaling Technology	72202	用于Western blot检测多药耐药相关蛋白1。提交前需根据产品说明书或抗体注册库确认RRID。
青霉素-链霉素溶液	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122 或经实验室验证的等效产品	以1%比例加入完全培养基。
用于Western blot的P-糖蛋白 / MDR1 / ABCB1抗体	Cell Signaling Technology	13978；RRID:AB_2798357	用于Western blot检测P-糖蛋白。
磷酸盐缓冲液	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023 或经实验室验证的等效产品	用于细胞洗涤与样本制备。
磷酸化雷帕霉素机制靶蛋白抗体	Cell Signaling Technology	2971；RRID:AB_330970	用于Western blot检测Ser2448位点磷酸化的雷帕霉素机制靶蛋白。
磷酸化蛋白激酶B抗体	Cell Signaling Technology	4060；RRID:AB_2315049	用于Western blot检测Ser473位点磷酸化的蛋白激酶B。
藻红蛋白标记小鼠免疫球蛋白G2a同型对照	BioLegend	400213	藻红蛋白标记抗体染色的同型对照。需确认其同型与所用抗P-糖蛋白抗体匹配。
藻红蛋白标记抗人P-糖蛋白 / CD243 / ABCB1抗体	BioLegend	919405	用于流式细胞术检测P-糖蛋白。若产品说明书中已确认，应包含克隆号与RRID。
聚偏氟乙烯膜	MilliporeSigma	IPVH00010 或经实验室验证的等效产品	用于Western blot转膜。
蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合液	Thermo Fisher Scientific / Roche / 经实验室验证的供应商	使用实际货号	蛋白提取前加入裂解缓冲液中。
放射免疫沉淀分析裂解缓冲液	Beyotime / Thermo Fisher Scientific / 经实验室验证的供应商	使用实际货号	用于总蛋白提取。
Roswell Park Memorial Institute 1640培养基	HyClone / Cytiva	SH30809.01 或经实验室验证的等效产品	所有白血病细胞系的基础培养基。若实验室采购记录中货号不同，应使用实际货号。
SC79，蛋白激酶B激活剂	使用实验室采购记录中的实际供应商	使用实际货号与批号	用于挽救实验。在方案、结果及图6图注中应一致报告相同的SC79终浓度。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂	Bio-Rad / Beyotime / 经实验室验证的供应商	使用实际货号	用于Western blot蛋白分离。
总雷帕霉素机制靶蛋白抗体	Cell Signaling Technology	2972；RRID:AB_330978	用于Western blot检测总雷帕霉素机制靶蛋白。
总蛋白激酶B抗体	Cell Signaling Technology	4691；RRID:AB_915783	用于Western blot检测总蛋白激酶B。
Western blot成像系统	Bio-Rad / Cytiva / 经实验室验证的仪器	根据实验室记录填写型号	用于增强型化学发光图像采集。