方法文章

一种用于建立小鼠慢性创伤性脑损伤模型的重复性落锤损伤方法

DOI：

10.3791/71677

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2026年7月3日

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1Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 2Innovation and Entrepreneurship Laboratory for College Students, Anhui Medical University, 3Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种建立重复性闭合性轻度创伤性脑损伤小鼠模型的实验方案，用于研究在无明显脑结构损伤情况下慢性抑郁样行为的潜在机制。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

创伤性脑损伤（TBI）可导致持续性的神经病理学改变以及长期的神经精神后遗症。在恢复过程中，即使常规的计算机断层扫描或磁共振成像未发现明显的结构性异常，仍有相当一部分患者出现情感障碍，包括抑郁症状和睡眠相关主诉。为了研究慢性创伤后神经精神症状的潜在机制，亟需能够重现这些特征的实验模型。本文介绍了一种建立重复性闭合性轻度创伤性脑损伤小鼠模型的实验方案，用于研究在肉眼检查和T2加权磁共振成像无法检测到明显结构性脑损伤的情况下，慢性类抑郁行为的潜在机制。该方法通过暴露完整颅骨，并在连续五天内使用预设的落锤参数进行反复撞击。在本方案所述条件下，该操作可造成闭合性头部损伤，但不引起明显的颅骨骨折或肉眼可见的局灶性挫伤。在损伤后一段时间，小鼠表现出类抑郁行为，但在本研究使用的条件下，肉眼检查或T2加权磁共振成像均未发现明显的局灶性结构性异常。该方案为研究重复性轻度创伤性脑损伤后的慢性类抑郁行为以及评估潜在治疗干预措施提供了一种实验途径。

引言

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然而，由于当前范式主要对头部固定的实验小鼠施加线性冲击，因此应将其视为一种优化用于研究慢性情感性结局的闭合性头部重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型，而非运动相关性脑震荡或轻微交通事故损伤的直接生物力学模拟。创伤性脑损伤（TBI）目前是导致创伤相关发病率和死亡率的主要原因之一，给家庭和社会带来了巨大的医疗和经济负担1,2。值得注意的是，TBI 后中枢神经系统的损伤并非短暂存在，而是通常以慢性且进行性的方式发展。一项关于 TBI 的研究显示，即使在受伤后 18 年，小胶质细胞的活化仍持续存在，长期的慢性神经炎症继续导致严重的神经退行性变3。流行病学数据显示，在漫长的恢复阶段中，高达 28%–32% 的患者会发展为严重的情感障碍4。本文中，rmTBI 指重复性轻度创伤性脑损伤诱导范式，而随后以持续性行为改变为特征的慢性损伤后阶段则称为慢性创伤性脑损伤（c-TBI）。此处使用 c-TBI 一词旨在描述 rmTBI 后以持续性行为改变为特征的慢性损伤后状态，而非指代一种独立的损伤范式。这一用法在概念上与我们先前的研究一致，后者表明实验性 TBI 可演变为一种与长期组织病理学和行为异常相关的进行性慢性过程。

这些慢性神经精神后遗症严重损害了患者的生活质量和功能预后

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方案

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所有动物实验程序均经合肥综合性国家科学中心人工智能研究院机构动物护理与使用委员会批准（批准号：IAI2024071004）。所有操作均遵循机构及国家关于实验动物护理与使用的指南。实验方案的示意图见图1。可使用其他供应商提供的等效设备，前提是保持关键性能参数不变，例如20 g撞击重量、25 cm下落高度、4 mm撞击头直径、可靠的异氟烷输送系统，以及与本研究中所用设置相当的MRI参数。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 动物准备

  1. 准备实验动物。
    1. 使用8–10周龄、体重20–25 g的雄性C57BL/6N小鼠。
    2. 将小鼠饲养在屏障系统动物房的独立通风笼具（IVCs）中，维持无特定病原体（SPF）环境。自由饮水和进食，控制温度和湿度，保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
    3. 实验前将小鼠适应饲养环境，并根据机构动物护理规程进行常规健康筛查。
  2. 分组。
    1. 将小鼠随机分配至正常对照组（Naive组）、假手术组（Sham组）和闭合性创伤性脑损伤组（c-TBI组）。负责MRI解读、大体病理学评估以及行为学评分和数据分析的研究人员对分组信息设盲。
    2. 在首次损伤操作前记录动物编号及分组信息。....

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结果

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轻度创伤性脑损伤小鼠的影像学与神经病理学评估

为了评估动物的整体健康状况和基础运动功能，根据图1所示的时间线监测了体重和平衡木行走表现。采用以动物为随机效应的线性混合效应模型分析各组的纵向差异。建模前，各组之间的体重无统计学差异（图4A）。建模后，闭合性创伤性脑损伤（c-TBI）小鼠的整体体重略低于Naive组和假手术（Sham）组，在脑外伤后第3天达到最低值；然而，这些组间差异无统计学意义。从脑外伤后第3天开始，c-TBI小鼠的体重逐渐恢复并随时间增加。在平衡木行走实验中，c-TBI组、假手术组和Naive组在各个评估时间点通过平衡木所需的时间均无显著差异（图4B）。这表明重复的自由落体重物打击并未在小鼠中引起持久或严重的运动功能缺陷。这些测量指标对于解释该技术所产生的行为学结果至关重要，因为未出现明显的体重下降或平衡木行走能力受损，支持了后续观察到的主动行为减少并非继.......

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讨论

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本研究详细描述了一种采用重复自由落体击打法建立重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠模型的标准化实验方案。通过将暴露颅骨的小鼠固定于立体定位仪中，并使用20 g重物从25 cm高度连续5天重复撞击预设坐标位置，成功诱导出以慢性抑郁样行为为特征的行为表型，且未出现颅骨骨折或明显的局灶性脑挫伤。该模型的主要特征是在重复性轻度闭合性头部撞击后的恢复期中，抑郁样行为可稳定重现。因此，本研究建立了一种可用于研究慢性创伤后抑郁样行为及其相关神经精神后遗症机制的rmTBI小鼠模型。本研究中，各项指标的评估持续至末次撞击后30天，该时间点被用作慢性损伤后观察时相，而非急性反应阶段。在后续研究中纳入更晚的时间点，将进一步完善该模型的时间动态特征刻画。

在执行本方案的过程中，有几个关键步骤需要特别仔细。首先，精确确定撞击坐标的定位至关重要。位置偏差可能改变撞击力的分布，增加邻近皮层区域意外损伤或更严重创伤的风险。其次，必须严格控制麻醉深度和镇痛效果。麻醉不足可能导致动物在操作过程中发生身体挣扎，引起协调性移位以及可能的头部和颈部二次运动；相反，麻醉过深，加上撞击后短暂的呼吸抑制，可能增加死亡风险。在.......

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由国家自然科学基金（编号：82202438）、安徽省高校自然科学重点研究项目（编号：2025AHGXZK30114）、安徽省临床与转化研究项目（编号：202427b10020130）、安徽医科大学实验与临床协同研究先进计划（编号：2022xkjT032）以及安徽医科大学研究生创新研究与实践项目（编号：YJS20230179）资助。作者感谢所有参与本研究的受试者，并感谢核心管理团队在数据库组织方面所做的工作。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-0非吸收性聚丙烯单丝缝合线Jinhuan MedicalI303伤口闭合
麻醉机RWD Life ScienceR550动物模型构建
ANY-maze行为追踪软件Stoelting版本 7行为学软件
Barnes迷宫上海欣软信息科技XR-XB108行为学软件
BiorenderBioRenderhttps://biorender.com科研绘图软件
布托啡诺Sigma-AldrichY0001108术后镇痛
电动剃须刀AUXAUX-C5-1术前备皮
强迫游泳实验上海欣软信息科技XR-XQX201行为学软件
GraphPad Prism 9.5La Jolla9.5统计学软件
异氟烷RWD Life ScienceR510-22-10动物模型构建
小鼠Charles RiverC57/6N实验动物
旷场实验上海欣软信息科技XR-XZ301行为学软件
眼科软膏北京双鹭药业H11021342预防麻醉期间角膜干燥
4%多聚甲醛（PFA）BiosharpBL539A灌注与组织固定
磷酸盐缓冲液（PBS）BiosharpBL1425A灌注与组织清洗
10%聚维酮碘溶液碧云天27883-25g术前皮肤消毒
小动物磁共振成像系统联影生命科学仪器uMR9.4T成像软件
11号手术刀片Jinhuan MedicalK3-11手术中皮肤切口
手术刀柄Jinhuan MedicalK6-10与11号手术刀片配合使用
立体定位仪RWD Life Science68025动物模型构建
无菌纱布HYNAUTBK05止血与手术清洁
悬尾实验上海欣软信息科技XR-XQX201行为学软件
落锤式撞击器RWD Life Science68093动物模型构建

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