本方案描述了一种基于成纤维细胞的腺病毒报告系统，该系统由小鼠I型胶原启动子驱动，可用于长期监测成纤维细胞的活化状态，并有助于抗纤维化化合物的高通量筛选。
方法文章
一种由小鼠I型胶原蛋白α1启动子驱动的基于成纤维细胞的腺病毒报告系统用于抗纤维化药物筛选
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
心肌纤维化以成纤维细胞异常活化和细胞外基质过度沉积为特征，目前缺乏靶向特异性治疗，主要原因是缺少纵向、可扩展且非破坏性的 体外 筛选平台。传统的终点检测方法和资源密集型干细胞模型本质上无法实现对纤维化进程的实时监测。为克服这些局限性，本方案描述了小鼠I型胶原α1（collagen type I alpha 1）Col1a1) 启动子驱动的腺病毒 mCherry 荧光报告系统（Ad-mCol1a1p-mCherry在NIH/3T3成纤维细胞中。本文详细阐述了重组腺病毒包装、转导条件优化（感染复数）以最小化细胞毒性，以及建立稳定的转化生长因子β（TGF-β）诱导的纤维化模型的关键步骤。该系统无需固定细胞，可实现对活细胞中胶原蛋白转录的直接且长期的动态监测。通过使用TGF-β I型受体（ALK5）抑制剂SB431542进行药理学验证，证实该模型具有良好的特异性和可靠性，荧光信号结果与通过逆转录定量聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定所检测的内源性纤维化标志物水平呈良好相关性。最终，这一经济高效的平台为新型抗纤维化药物的高通量筛选提供了便捷工具，从而加速转化型心血管疾病研究的进程。
引言
心肌纤维化的管理面临重大的临床挑战。其特征是静息状态的成纤维细胞异常活化为肌成纤维细胞，并伴随细胞外基质（ECM）的过度沉积，是心力衰竭、心肌梗死及其他心血管疾病共有的不可逆终末通路1,2,3。然而，目前的治疗策略存在显著局限性。常规干预措施——如利尿剂、β受体阻滞剂以及肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂——主要缓解全身血流动力学应激并减轻神经体液系统激活4,5,6,7。这些疗法无法直接靶向成纤维细胞的活化过程，也不能阻止胶原蛋白的持续沉积。此外，尽管转化生长因子β（TGF-β）/Smad信号通路、氧化应激以及代谢重编程等信号级联反应驱动了该病理过程，但由于系统性毒性及非特异性递送机制的存在，将这些机制转化为直接作用的抗纤维化疗法仍面临挑战8,9,10。因此，迫切需要开发新型、靶点特异性的抗纤维化疗法。目前转化研究中的一个主要瓶颈在于缺乏能够敏感且动态地报告成纤维细胞活化的功能评估系统。传统的实验模型存在显著局限性，难以支持高效的药物筛选11,12。虽然体内动物模型能够模拟整体心脏重构过程，但其存在种间差异、实验周期长、成本高以及通量低等问题11。
为克服这些障碍，已出现多种体外筛选平台；然而，关键的方法学缺陷仍然存在。高内涵免疫荧光检测需要对细胞进行破坏性固定和繁琐的处理，仅能提供静态图像，无法捕捉成纤维细胞活化的实时动力学过程。类似地，整合无标记阻抗监测与质谱分析（MS/MS）的平台则存在非特异性和低通量的问题，因为由普遍细胞毒性引起的阻抗下降很容易与真正的抗纤维化效应相混淆。此外，利用诱导性多能干细胞（iPSCs）构建的CRISPR编辑报告系统，用于追踪细胞骨架标志物（如α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA]/ACTA2），在转化应用上面临显著障碍13。这些基于iPSC的模型成本高昂、技术要求复杂，难以广泛用于常规高通量筛选。更重要的是，依赖α-SMA等细胞骨架标志物可能无法准确反映病理终点，因为这些标志物的表达与细胞外基质（ECM）的功能性分泌及过度沉积并无严格相关性14。因此，现有系统尚不足以对药物干预下早期细胞反应进行长期动态监测。
相比之下，本方案描述了一种由I型胶原α1（Col1a1）启动子驱动的纵向功能性报告系统，旨在建立一个非破坏性且稳健的平台，用于监测成纤维细胞的活化。由于I型胶原是心脏重塑过程中沉积的主要细胞外基质（ECM）成分，捕获其编码基因Col1a1的转录激活，可作为成纤维细胞活化的直接且具有病理相关性的读出指标。该基于Col1a1启动子的模型能够持续在分子水平上监测纤维化过程，提供一个灵敏、可纵向追踪且可定量的平台，适用于基于作用机制的药物筛选。
方案
我们确认所有实验均按照机构和国家的指南进行。由于本研究 exclusively 使用已建立的 NIH Swiss 小鼠胚胎成纤维细胞系（NIH/3T3）以及 mCol1a1p-mCherry 报告系统，且未涉及任何脊椎动物、胚胎或人类受试者，因此本手稿所述实验程序无需机构审查委员会的伦理审批。
所有涉及重组腺病毒载体的操作均按照机构生物安全规定和标准生物安全二级（BSL-2）实践进行。病毒操作、转导、储存和废弃物处理均在经认证的生物安全柜中进行，并使用适当的个人防护装备。含有腺病毒材料的液体废物在丢弃前使用新配制的含氯消毒液进行去污染处理，受污染的耗材根据机构生物安全规程进行高压灭菌。发生意外泄漏时，立即按照机构规定的溢出处理程序使用经批准的病毒灭活剂进行消毒。
1. 实验流程概述
- 生成一只小鼠 Col1a1 如步骤2所述的启动子驱动的重组腺病毒
- 按照第3步所述，优化NIH/3T3成纤维细胞中的病毒转导条件。
- 建立 TGF-β 响应性 体外 如步骤4所述的纤维化报告基因模型。
- 使用时间梯度和剂量梯度的 TGF-β 刺激，按照步骤 4 中所述方法验证模型的稳定性、特异性和生物学可重复性。
- 使用 SB431542 进行药理学抑制，具体步骤如第 5 步所述。
- 按照第5步所述进行下游酶联免疫吸附测定（ELISA）和定量实时聚合酶链式反应（qPCR）分析。
注意：请参阅 图1A 有关实验流程的示意图概述，请参见 材料表 用于实验设备和试剂。
图1．mCol1a1p-mCherry 腺病毒报告系统在成纤维细胞中的建立与验证流程。 （A）腺病毒（AdV）mCol1a1p-mCherry 报告系统的构建示意图，以及在 NIH/3T3 成纤维细胞中进行模型验证的实验流程。该流程包括启动子克隆、重组腺病毒组装、在 HEK293 细胞中进行病毒包装、感染复数（MOI）优化，以及后续的高内涵荧光筛选。（B）NIH/3T3 成纤维细胞在 MOI 为 0、1、10、100 和 1000 时感染 Ad-mCol1a1p-mCherry 腺病毒后的代表性荧光图像。细胞核用 Hoechst 33342 染色（蓝色），mCherry 荧光信号（红色）反映 Col1a1 启动子活性。使用高内涵成像对荧光强度进行定量，并归一化至细胞核数量。基于强烈且均一的报告基因表达以及最小的形态学改变，选择 MOI 100 用于后续实验。比例尺 = 200 µm。本图使用经授权许可的 BioRender.com 软件绘制。请点击此处查看该图的放大版本。
2. mCol1a1 启动子腺病毒的构建、包装与扩增
- 重组腺病毒载体的构建
- 将2354 bp的小鼠Col1a1启动子片段（基因组坐标：chr11:94824779–94827132；相对于转录起始位点[TSS]的−2271至+83 bp）克隆至pDC315腺病毒穿梭载体中mCherry报告基因的上游。
注意：完整的Col1a1启动子序列以及详细的pDC315-mCol1a1p-mCherry质粒图谱见补充文件1和补充图1。 - 使用BamHI和KpnI酶切线性化pDC315载体。利用含有15–25 bp同源臂的引物扩增启动子插入片段。
注意：采用基于同源重组的无缝克隆策略，以促进in vitro重组。 - 通过PCR筛选和Sanger测序验证所得质粒。
注意：仔细检查启动子与报告基因连接区域的序列，确保无移码或提前终止密码子存在。 - 利用AdMax系统，通过细胞内Cre介导的重组生成重组腺病毒。
注意：pBHGloxΔE1,3Cre骨架质粒包含一个非复制型Ad5基因组，其E1/E3区段缺失，并含有一个Cre重组酶表达盒，可促进穿梭载体上loxP位点的特异性重组。 - 将经验证的pDC315-mCol1a1p-mCherry穿梭载体与pBHGloxΔE1,3Cre腺病毒骨架质粒共转染至HEK293细胞中。
- 将2354 bp的小鼠Col1a1启动子片段（基因组坐标：chr11:94824779–94827132；相对于转录起始位点[TSS]的−2271至+83 bp）克隆至pDC315腺病毒穿梭载体中mCherry报告基因的上游。
- 腺病毒的包装与扩增
- 在添加10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293细胞。使用低代次细胞（<20代）进行腺病毒包装。
- 转染前24小时，以30%–40%汇合度接种HEK293细胞，使转染时细胞汇合度达到50%–60%。
- 使用Lipofectamine 2000转染试剂，将5 µg穿梭质粒与5 µg pBHGloxΔE1,3Cre辅助质粒共转染至HEK293细胞中。
注意：保持DNA与试剂比例为1:1（总DNA量10 µg，转染试剂10 µL）。 - 将转染后的细胞在37°C、5% CO₂条件下培养，并每日观察细胞病变效应（CPE）。
注意：初始CPE可能需要7–14天出现。若培养基变酸（变黄），可进行轻柔的半量换液，避免扰动细胞。 - 当观察到典型CPE（表现为细胞变圆、收缩），且至少50%细胞从培养表面脱落时，收集细胞及上清液。
注意：此阶段通常在转染后10–15天达到。 - 通过在−70°C冷冻30分钟，再于37°C水浴中融化，进行三次冻融循环。
- 每次融化后涡旋振荡30秒，以促进细胞裂解。
注意：融化过程中避免在37°C长时间孵育，以维持病毒稳定性。 - 使用完全DMEM对病毒裂解液进行10倍系列稀释（10−1至10−13）。将每种病毒稀释液各90 µL加入已接种于96孔板的HEK293细胞中，每种稀释度设10个重复孔。
注意：病毒滴度≥1 × 109 PFU/mL定义为下游纯化所需的足够扩增终点。 - 用0.45 µm滤膜过滤10 mL粗制病毒裂解液，以去除细胞碎片。
- 在37°C条件下，用Benzonase核酸酶（10 U/mL）处理澄清后的裂解液30分钟。
- 根据生产商说明书，使用Adeno-X病毒纯化试剂盒纯化重组腺病毒。
注意：在上样前，将裂解液与1×稀释缓冲液混合。用1×洗涤缓冲液洗涤滤膜，并用3 mL 1×洗脱缓冲液洗脱纯化的病毒。 - 将培养板孵育10天，于光学显微镜下评估细胞病变效应（CPE）。根据细胞变圆和脱落的典型特征判定阳性CPE，并基于CPE评分采用Spearman–Karber法计算感染性病毒滴度。
注意：确保最终病毒储备液滴度至少达到1 × 1011 PFU/mL，以满足后续应用需求。 - 将纯化的腺病毒分装，并于−80°C保存。
注意：纯化的腺病毒分装样品应于−80°C长期保存。避免反复冻融，以维持病毒感染活性。
3. 细胞培养及病毒感染条件的优化
- 在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中培养NIH/3T3成纤维细胞。
注意：为确保细胞状态一致，使用传代次数为3至8代、在原培养瓶中融合度达到70%–80%的细胞。 - 将NIH/3T3成纤维细胞以每孔4 × 103个细胞的密度接种至384孔板中，每孔加入40 µL完全培养基。
- 将细胞置于37°C、5% CO₂条件下培养12小时，以促进细胞贴壁并进入对数生长期。
注意：为减少细胞分布不均和边缘效应，在培养前将培养板在室温下静置20–30分钟。将最外圈的孔中加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或无菌水。 - 用重组腺病毒感染细胞，感染复数（MOI）设置为1–1,000，并设置未感染对照组。
注意：使用以下公式计算所需腺病毒体积：
其中，V为腺病毒储存液的体积（mL），N为每孔接种的细胞数（4 × 103），MOI为设定的感染复数，T为具有感染活性的病毒滴度（PFU/mL）。本研究所用病毒储存液的感染滴度为1 × 1011 PFU/mL，由第2.2.12步所述的Spearman–Karber法测定。 - 确保加入的病毒储存液体积不超过孔内总体积的10%。
注意：过量的病毒储存液可能改变培养基pH值，并引发非特异性的细胞毒性。 - 感染后24小时，将含病毒的培养基更换为40 µL新鲜完全培养基。
注意：使用与第3.1步一致的、添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基。 - 使用低速自动液体处理系统进行换液，或小心将多通道移液器吸头倾斜靠在每孔的侧壁上进行操作。
注意：处理384孔板时，避免使用标准的真空抽吸法，以减少细胞脱落。 - 将最佳MOI定义为能够产生明显且均一的mCherry荧光、同时保持细胞形态和细胞核数量与未感染对照组相当的最低病毒剂量。
注意：通过Hoechst染色计数细胞核并结合荧光成像评估报告基因表达。细胞应保持其典型的纺锤形形态，无变圆或脱落现象。过高的MOI可能通过细胞应激反应诱导基础水平的mCherry激活。不同MOI下的代表性荧光结果见图1B。 - 选择优化后的MOI用于所有后续实验。
注意：本研究中，后续实验选用的MOI为100。
4. 使用 TGF-β 刺激评估模型稳定性
- 按照步骤3.9中确定的优化MOI值100，用重组腺病毒感染NIH/3T3成纤维细胞。
- 在TGF-β刺激前，将成纤维细胞置于含0.2%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中饥饿培养12 h。
注意：进行血清饥饿的目的是使细胞周期同步化，并最大限度减少Col1a1启动子的基础激活。 - 使用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的4 mM HCl配制100 µg/mL的重组人TGF-β储备液。
注意：将TGF-β储备液分装成小体积，于−80°C保存，以避免反复冻融。 - 在六个独立的生物学重复实验中，用0–40 ng/mL浓度梯度的TGF-β处理细胞。
注意：0 ng/mL条件作为未刺激的对照组。 - 将刺激后的细胞在37°C、5% CO₂条件下分别孵育24、48或72 h。每个成像时间点使用独立的平行培养板，以最小化累积光毒性。
- 成像前用Hoechst 33342溶液对细胞染色15 min，终工作浓度为2.5 µg/mL。
注意：通过将10 mg/mL的Hoechst 33342储备液按1:4,000比例稀释于无菌PBS中配制染色液。染色过程需避光操作，以减少光漂白。 - 使用配备10×干式物镜的高内涵成像系统获取荧光图像。
- 在384孔板格式下，每个实验条件每孔采集五个无重叠的视野。
注意：所有实验组均需保持相同的成像设置，以确保数据可比性。活细胞成像时使用基于激光的自动对焦功能，并维持37°C、5% CO₂的环境控制条件。 - 使用561 nm激发光、带通600/52（BP600/52）发射滤光片和200 ms曝光时间获取mCherry荧光图像。
- 使用405 nm激发光、BP445/45发射滤光片和30 ms曝光时间获取Hoechst荧光图像。
注意：将相机增益设为1.0，并以1 × 1 binning模式在全分辨率下采集所有图像，以保持荧光检测的线性并最大化空间分辨率。 - 使用CellPathfinder图像分析软件分析所获取的图像。
- 在Hoechst通道中以20 µm的参考核直径和20–400 µm2的面积范围，将细胞核识别为初级对象。
- 在mCherry通道中，以60 µm的参考细胞直径从核边界向外扩展，定义细胞质区域（ROIs）。
注意：在分割过程中应用“排除边缘”滤镜，以去除接触图像边界的不完整细胞。 - 计算每个已识别细胞的平均荧光强度，并根据五个视野的数据确定每孔的平均荧光强度。
5. 使用酶联免疫吸附测定和定量实时聚合酶链式反应验证模型可靠性
- 按照步骤3.9所述，使用优化的MOI值100感染NIH/3T3成纤维细胞。
- 在TGF-β刺激前，用SB431542预处理细胞30–60分钟。
注意：用二甲基亚砜（DMSO）配制20 mM SB431542储备液，并将分装样品储存于−20°C。 - 用10 ng/mL TGF-β和终浓度为1、5、10及15 µM的SB431542处理细胞。设置含0.1%（v/v）DMSO但不加SB431542的溶剂对照组。
注意：所有处理组中DMSO的终浓度应保持在0.1%（v/v）。 - 采用两步稀释法配制TGF-β工作液。
注意：将100 µg/mL TGF-β储备液（溶于含0.1% BSA的4 mM HCl中）先以1:100比例稀释于无菌PBS中，再进一步稀释至完全培养基中，以获得10 ng/mL的终工作浓度。 - 将处理后的细胞在37°C、5% CO₂条件下于6孔板中孵育24小时。
- 从每个孔中收集2 mL培养上清液用于ELISA分析。
- 在4°C下以1,000 × g离心收集的上清液5分钟，以去除细胞碎片。
- 将澄清后的上清液分装并储存于−80°C，待进行ELISA分析。
注意：澄清后的上清液可在ELISA分析前长期保存于−80°C。 - 去除上清液后，用预冷的PBS轻轻洗涤贴壁细胞。
- 直接向每孔中加入1 mL TRIzol试剂以裂解细胞。
注意：转移样品至微量离心管前，需反复吹打裂解液数次以确保充分均质化。RNA裂解液可在RNA提取前储存于−80°C。 - 从裂解液中提取总RNA，用于逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析。
- 使用1 µg总RNA进行逆转录。
注意：按以下反应条件进行逆转录：25°C 10分钟，42°C 15分钟，85°C 2分钟。 - 使用PerfectStart Green qPCR SuperMix进行定量PCR。每项反应体系终体积为20 µL，包含5 µL互补DNA（cDNA）模板。
- 运行qPCR反应，循环条件如下：94°C预变性30秒，随后进行40个循环（94°C 5秒、60°C 15秒、72°C 10秒）。
注意：扩增结束后进行熔解曲线分析，以确认扩增产物的特异性。 - 以18S rRNA作为内参，对Col1a1基因表达水平进行归一化处理。
注意：所有引物序列见补充表1。 - 根据试剂盒说明书，使用ELISA检测澄清上清液中分泌型I型胶原蛋白的含量。小鼠I型胶原ELISA检测的标准曲线范围为0.78–50 ng/mL，检测灵敏度为0.37 ng/mL。
- 所有标准品和样品均设技术重复，使用酶标仪在450 nm波长下测定光密度（OD）。
注意：为最大限度提高分泌型Col1a1检测的灵敏度，应使用未经稀释的澄清上清液。
结果
重组腺病毒mCol1a1p-mCherry的构建与包装示意图见图1A。将小鼠Col1a1启动子克隆至mCherry报告基因的上游，并插入腺病毒载体中，随后在HEK293细胞中进行病毒包装与扩增。该工作流程展示了关键实验步骤，包括病毒感染、纤维化刺激、药物干预以及基于荧光的信号检测。此示意图为报告系统的实施提供了可视化框架，并有助于后续功能验证实验的解读。
为确定最佳病毒感染条件，NIH/3T3 成纤维细胞在不同 MOI 条件下感染 mCol1a1p-mCherry 腺病毒。如图 1B所示，mCherry 荧光强度随 MOI 增加而增强。在低 MOI 条件下，报告基因表达较弱且呈异质性，不适合进行定量分析。在高 MOI 条件下，细胞形态发生改变，出现变圆和脱落现象，表明存在细胞毒性效应。MOI 为 100 时，荧光信号强且分布均一，同时细胞形态保持良好，因此被选定为后续实验的最佳条件。
在优化的感染复数（MOI）下，NIH/3T3成纤维细胞用不同浓度的TGF-β进行刺激。在刺激后24、48和72小时测量报告基因荧光信号。如图2A–C所示，mCherry荧光强度在所有时间点均呈浓度依赖性增加。信号强度从24小时至72小时持续增强，表现出时间依赖性反应。这些结果表明该报告系统对纤维化刺激具有长期且可重复的响应能力，属于阳性结果。
图2．转化生长因子β（TGF-β）刺激诱导mCol1a1p-mCherry报告基因呈时间和剂量依赖性激活。 NIH/3T3成纤维细胞在优化的感染复数（MOI）下感染Ad-mCol1a1p-mCherry腺病毒后，用不同浓度的TGF-β进行刺激。图中显示刺激后24小时（A）、48小时（B）和72小时（C）的代表性荧光图像及相应的mCherry报告基因活性定量分析结果。mCherry荧光信号（红色）反映Col1a1启动子活性，细胞核用Hoechst 33342复染（蓝色）。采用高内涵成像技术对荧光强度进行定量，并根据细胞核数量进行归一化处理。数据以每种条件下六次独立生物学重复的均值±均值标准误（SEM）表示。统计学比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验，相对于未处理对照组进行。所有实验条件下成像参数保持一致。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
为评估通路特异性，在TGF-β刺激条件下，用TGF-β I型受体（ALK5）抑制剂SB431542处理NIH/3T3成纤维细胞。如图3A–C所示，SB431542以剂量依赖方式降低了mCherry荧光强度。在所有检测的时间点均观察到报告基因活性的抑制作用，且抑制剂浓度越高，抑制效果越明显。这些结果表明，报告基因的激活依赖于TGF-β信号通路，并可被药物调控，属于阳性结果。
图3。SB431542以时间和剂量依赖的方式抑制TGF-β诱导的mCol1a1p-mCherry报告基因的激活。 感染Ad-mCol1a1p-mCherry腺病毒的NIH/3T3成纤维细胞在存在或不同浓度转化生长因子β I型受体（ALK5）抑制剂SB431542（0、1、5、10和15 µM；图中简写为SB43）的条件下，用TGF-β（10 ng/mL）进行刺激。在处理后24小时（A）、48小时（B）和72小时（C）分别展示了代表性荧光图像及相应的定量分析结果。mCherry荧光信号（红色）反映Col1a1启动子活性，细胞核用Hoechst 33342复染（蓝色）。使用高内涵成像系统对荧光强度进行量化，并根据细胞核数量进行归一化处理。数据表示为每种条件下六次独立生物学重复的均值±标准误。统计学比较采用单因素方差分析，随后进行Tukey多重比较检验，相对于TGF-β处理组进行分析。所有实验条件下的成像参数保持一致。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
为评估报告基因活性是否反映内源性纤维化反应，在优化的感染、刺激和抑制条件下对NIH/3T3成纤维细胞进行了分析。报告系统验证所用的实验流程总结如下： 图 4A. 在蛋白和 mRNA 水平检测了纤维化相关标志物。如图所示， 图 4B–CELISA 显示，经 TGF-β 刺激后，与纤维化相关的蛋白分泌增加，而 SB431542 处理后该分泌减少。与此一致，RT-qPCR 显示纤维化相关基因的表达发生相应变化，包括 Col1a1荧光读数、蛋白质分泌与基因表达之间的一致性代表了阳性验证结果，表明该报告系统在此条件下能够反映纤维化激活状态。
图 4．通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证 mCol1a1p-mCherry 报告系统。（A）报告系统验证的实验流程示意图。NIH/3T3 成纤维细胞用 TGF-β（10 ng/mL）刺激，并用浓度递增的 TGF-β 受体抑制剂 SB431542（SB43）处理。收集细胞裂解物和培养上清液用于后续分析。（B）在 SB431542 浓度梯度下，通过 RT-qPCR 检测 TGF-β 刺激条件下 Col1a1 信使 RNA（mRNA）表达的定量分析。相对 Col1a1 mRNA 表达水平以 18S 核糖体 RNA（18S rRNA）为内参进行归一化，并表示为未处理对照组的倍数变化。（C）在与 B 图相同的实验条件下，使用 ELISA 对细胞培养上清液中分泌的 I 型胶原蛋白水平进行定量。I 型胶原蛋白浓度以 ng/mL 表示。数据表示为每种条件下六次独立生物学重复的均值 ± 标准误（SEM）。统计学比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验，相对于 TGF-β 处理组进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1。 用于构建腺病毒报告载体的小鼠 Col1a1 启动子片段的完整核苷酸序列。 该 2354 bp 的启动子区域对应于基因组坐标 chr11:94824779–94827132 (NC_000077.7)，相对于转录起始位点（TSS）位于 −2271 至 +83 bp 范围内。该启动子片段被克隆至 pDC315 转移载体中 mCherry 报告基因的上游，用于构建重组腺病毒报告系统。请点击此处下载该文件。
补充表 S1. 用于 RT-qPCR 分析的引物序列。 列出了 Col1a1 基因及内参基因 18S rRNA 的正向和反向引物序列，方向为 5′–3′。请点击此处下载该文件。
补充图 S1。 pDC315-mCol1a1p-mCherry 腺病毒穿梭载体的质粒图谱。 采用基于同源重组的无缝克隆策略，将2354 bp的小鼠Col1a1启动子片段插入mCherry报告基因上游，用于构建重组腺病毒报告载体。请点击此处下载该文件。
讨论
心肌纤维化促进心力衰竭的进展，而有效的抗纤维化疗法的开发受到缺乏纵向筛选平台的限制2,13。评估抗纤维化疗效的传统方法包括蛋白质印迹（Western blotting）、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫荧光染色，这些方法依赖于终点检测，需要进行细胞裂解或固定。这些方法无法实现在活细胞中对纤维化进程进行实时监测，限制了其在纵向研究和高通量分析中的应用。此外，通过质粒转染或慢病毒整合构建稳定报告细胞系的方法，常受限于成纤维细胞中转染效率低、基因组随机整合带来的变异性，以及在连续传代过程中报告基因表达逐渐沉默等问题15。
尽管慢病毒载体常用于NIH/3T3成纤维细胞的基因递送，但本研究特别采用腺病毒报告系统，以保持成纤维细胞的生理保真性。慢病毒会永久整合到宿主基因组中，具有插入突变的固有风险，可能意外破坏内源性信号网络——这在评估TGF-β诱导的纤维化等复杂级联反应时尤为关键。相比之下，腺病毒载体以附加体形式存在，可确保基因组完整性。此外，该方法避免了稳定慢病毒细胞系所需的长期抗生素筛选，防止治疗诱导的表型改变，从而实现快速、高效且高表达水平的瞬时表达，适用于高通量筛选。
为了解决这些技术局限，mCol1a1 启动子驱动的 mCherry 腺病毒报告系统为监测成纤维细胞活化提供了一种方法 体外. 该系统结合了腺病毒递送与小鼠 Col1a1 启动子，一种与成纤维细胞活化和细胞外基质沉积相关的转录标记16. 偶联 Col1a1 启动子活性与荧光报告基因偶联可实现活细胞中纤维化转录反应的可视化与定量。在多个时间点给予TGF-β刺激后，报告基因荧光信号增强，反映成纤维细胞活化的纵向动态过程。ALK5抑制剂SB431542可抑制报告基因活性，表明该通路具有依赖性调控特征。通过RT-qPCR和ELISA检测，报告基因荧光信号与内源性纤维化相关基因及蛋白表达水平之间具有良好一致性，支持该方法用于在上述条件下监测纤维化反应。
近期研究利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的心脏细胞结合基于CRISPR-Cas9的基因扰动技术进行药物筛选和靶点发现11,13。例如，经CRISPR工程化改造的荧光报告基因iPSC来源的心脏成纤维细胞已被应用于大规模化合物筛选方法中11,17。尽管这些方法具有较高的遗传精确性，但存在分化周期长、技术复杂、批次间变异大以及实验成本增加等问题13,18。相比之下，本文所述的腺病毒报告系统无需基因组编辑或长期细胞分化，可实现更快速的应用。这些方法可互补使用，其中mCol1a1p-mCherry报告系统可用于初步筛选，而基于iPSC的模型则用于后续验证11。
本文所述的 mCol1a1p-mCherry 报告系统为在成纤维细胞模型中筛选候选化合物（包括代谢调节剂和天然产物）提供了一种方法。为确保本实验方案的可重复性，需特别关注若干关键步骤及故障排除要点。首先，腺病毒制备物的纯度至关重要。使用未经纯化的病毒裂解液可能引入宿主细胞碎片和细胞毒性成分，导致 NIH/3T3 成纤维细胞出现非特异性效应，干扰报告基因的读数。此外，为确保后续筛选应用中的严格可重复性和批次间一致性，每次病毒制备均需经过标准化纯化，并通过终点稀释法进行严格定量。通过依据功能性病毒滴度（PFU/mL）而非体积量来确定精确的感染复数（MOI），我们成功消除了不同批次间的差异，从而在所有独立实验中实现了报告系统响应的标准化。其次，在优化该 MOI 时，需确保病毒接种液体积不超过总培养体积的 10%。过量的病毒缓冲液可能改变培养基的 pH 值和渗透压，从而引发与 TGF-β 刺激无关的细胞应激反应。
此外，对384孔板进行高内涵成像操作时存在技术挑战。NIH/3T3成纤维细胞在换液和洗涤过程中容易发生脱落。轻柔的液体操作，例如使用低流速的自动化液体处理设备，或将移液器枪头沿孔壁倾斜加液，可减少细胞丢失。为降低Col1a1启动子的基础激活水平并提高信噪比，可在TGF-β刺激前进行12–24小时的血清饥饿处理。在多个时间点（如24、48和72小时）进行连续活细胞成像时，应通过优化曝光条件，或为每个时间点设置平行实验孔板，以尽量减少反复Hoechst染色带来的累积光毒性及DNA结合效应19。
该方法存在若干局限性，需予以考虑。首先，该系统基于一种永生化的成纤维细胞系，不能完全代表心肌成纤维细胞的细胞异质性。 体内其次，报告基因反映的是转录激活情况 Col1a1 且未涵盖转录后调控或细胞外基质成熟过程。未来的改进可能包括使用原代心肌成纤维细胞、共培养系统或三维模型，以提高生理相关性。总之，本方案描述了一种 Col1a1 启动子驱动的腺病毒报告系统用于监测成纤维细胞活化。该方法结合了病毒递送、药物调控以及互补的分子检测手段，可在活细胞中实现长期且非破坏性的分析。该策略可应用于化合物筛选以及在受控条件下对纤维化信号通路的研究 体外 条件。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了中国国家自然科学基金（32371158，授予 H.X.）和国家关键研发计划项目&D 计划（2023YFA1800902 至 H.X.）， "天池人才" 国家重点实验室（北京大学）血管稳态与重构开放项目（202404，R.Z.；202403，Y.M.W.）；教育部新疆地方性与民族性疾病重点实验室（北京大学）开放项目（KF202404，H.X.）
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 384孔玻璃底微孔板 | Cellvis，美国 | P384-1.5H-N | 用于细胞接种、病毒感染、染色和荧光成像的384孔玻璃底板 |
| 腺病毒骨架质粒 | 加拿大 Microbix | pBHGloxΔE1,3Cre | 用于生成全长重组腺病毒基因组的质粒。 |
| 腺病毒穿梭载体：pDC315-mCol1a1p-mCherry | GeneChem，中国 | 定制服务 | 含2354 bp小鼠Col1a1启动子驱动mCherry表达的重组腺病毒穿梭载体 |
| 苯佐那酯核酸酶 | 默克密理博，美国 | 70664-3 | 用于腺病毒纯化过程中去除污染性核酸的内切核酸酶。 |
| II级生物安全柜 | 新加坡 Esco 生命科学集团 | AC2-4S1 | 用于重组腺病毒操作和无菌细胞培养程序的认证生物安全柜 |
| 细胞培养基（完全DMEM/F12） | HyClone，美国 | 12800-017 | 用于NIH/3T3和HEK293细胞培养的完全培养基。 |
| CellPathfinder 图像分析软件 | 横河电机株式会社，日本 | 版本 3.08.01 | 用于自动荧光定量和细胞分割的图像分析软件 |
| CellVoyager CV8000 高内涵筛选系统 | 横河电机株式会社，日本 | CV8000 | 用于 mCherry 和 Hoechst 荧光采集的高内涵成像系统 |
| CO2 细胞培养箱 | 赛默飞世尔科技公司，美国 | 3111 | 37℃恒温培养箱 °C，5% CO₂2 用于哺乳动物细胞培养。 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich，美国 | D2650 | 用于SB431542配制的溶剂。 |
| 杜尔贝科’DMEM/F-12培养基（改良型伊格尔培养基/营养混合物F-12） | 中国赛维尔生物 | G4610 | 用于NIH/3T3成纤维细胞的基礎培養基。 |
| 胎牛血清（FBS） | 澳大利亚奥士比安 | VS500T | 用于完全培养基制备的血清添加剂，使用浓度为10%（v/v）。 |
| Hoechst 33342 荧光染料 | Invitrogen，美国 | H3570 | 用于荧光成像及细胞核计数归一化的核染色剂。 |
| HEK293细胞 | ATCC，美国 | CRL-1573 | 用于腺病毒生产与扩增的包装细胞系 |
| 人重组TGF-β1 | MedChemExpress，中国 | HY-P78214 | 用于诱导NIH/3T3成纤维细胞纤维化活化的细胞因子。 |
| 图像采集软件 | 横河电机株式会社，日本 | 版本 3.08.01.03 | 用于自动荧光图像采集和显微镜控制的软件。 |
| 基于脂质的转染试剂 | 美国 Invitrogen | 11668-019 | 用于将腺病毒质粒转染至HEK293细胞的转染试剂。 |
| 微量离心管 | Axygen，美国 | MCT-150-C | 用于RNA裂解液储存和样本处理的离心管。 |
| 微孔板读板仪 | 瑞士，Tecan | 火花 | 用于ELISA吸光度测定的多功能酶标仪。 |
| 小鼠 I 型胶原蛋白 ELISA 试剂盒 | 中国美科生物科技有限公司 | MK6778A | 用于定量培养上清液中分泌的I型胶原蛋白的ELISA试剂盒。 |
| NIH/3T3 小鼠成纤维细胞 | Procell生命科学，中国 | CL-0171 | 用于报告基因模型建立与验证的小鼠成纤维细胞系 |
| PacI 限制性内切酶 | 美国新英格兰生物实验室 | R0547S | 用于腺病毒质粒线性化的限制性内切酶。 |
| 青霉素–链霉素溶液 | Gibco，美国 | 15140-122 | 添加1%（v/v）抗生素溶液以防止细菌污染。 |
| PerfectStart Green qPCR SuperMix | 中国，TransGen Biotech | AQ602 | 用于定量PCR分析的基于SYBR Green的qPCR预混液。 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 中国赛维尔生物 | G4202 | 用于洗涤细胞和试剂配制的缓冲液。 |
| pDC315-EGFP 穿梭载体 | GeneChem，中国 | N/A | 用于报告基因质粒构建的亲本腺病毒穿梭载体。 |
| qPCR 系统 | 美国应用生物系统公司 | QuantStudio 5 | 用于定量基因表达分析的实时PCR系统 |
| 限制性内切酶（BamHI 和 KpnI） | 中国，Abclonal | RK21101, RK21104 | 用于穿梭载体线性化的限制性内切酶。 |
| 逆转录试剂盒 | 中国，TransGen Biotech | AT311 | 用于RT-qPCR前cDNA合成的逆转录试剂盒。 |
| RNA裂解试剂 | Invitrogen，美国 | 15596026 | 用于从培养细胞中提取总RNA的试剂。 |
| SB431542 | MedChemExpress，中国 | 301836-41-9 | TGF-β 用于药理学抑制实验的I型受体抑制剂。 |
| Sanger 测序服务/试剂 | 中国上海博尚生物科技有限公司 | 定制服务 | 用于质粒序列验证的测序服务/试剂。 |
| 血清移液管 | 美国康宁公司 | 4488 | 用于细胞培养操作中液体处理的无菌移液管。 |
| T30 梯度PCR仪 | 中国LongGene科学仪器公司 | T30 | 用于逆转录和PCR扩增的热循环仪。 |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Gibco，美国 | 25200-056 | 用于常规细胞传代的细胞解离试剂。 |
| 病毒纯化试剂盒 | Takara Bio USA | 631533 | 用于重组腺病毒纯化的试剂盒 |
| 水浴锅 | 中国上海易恒科学仪器有限公司 | HWS-12 | 用于腺病毒冷冻过程中的控温水浴–冻融循环。 |
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