一种由小鼠I型胶原蛋白α1启动子驱动的基于成纤维细胞的腺病毒报告系统用于抗纤维化药物筛选

摘要

本方案描述了一种基于成纤维细胞的腺病毒报告系统，该系统由小鼠I型胶原启动子驱动，可用于长期监测成纤维细胞的活化状态，并有助于抗纤维化化合物的高通量筛选。

摘要

心肌纤维化以成纤维细胞异常活化和细胞外基质过度沉积为特征，目前缺乏靶向特异性治疗，主要原因是缺少纵向、可扩展且非破坏性的 体外 筛选平台。传统的终点检测方法和资源密集型干细胞模型本质上无法实现对纤维化进程的实时监测。为克服这些局限性，本方案描述了小鼠I型胶原α1（collagen type I alpha 1）Col1a1) 启动子驱动的腺病毒 mCherry 荧光报告系统（Ad-mCol1a1p-mCherry在NIH/3T3成纤维细胞中。本文详细阐述了重组腺病毒包装、转导条件优化（感染复数）以最小化细胞毒性，以及建立稳定的转化生长因子β（TGF-β）诱导的纤维化模型的关键步骤。该系统无需固定细胞，可实现对活细胞中胶原蛋白转录的直接且长期的动态监测。通过使用TGF-β I型受体（ALK5）抑制剂SB431542进行药理学验证，证实该模型具有良好的特异性和可靠性，荧光信号结果与通过逆转录定量聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定所检测的内源性纤维化标志物水平呈良好相关性。最终，这一经济高效的平台为新型抗纤维化药物的高通量筛选提供了便捷工具，从而加速转化型心血管疾病研究的进程。

引言

心肌纤维化的管理面临重大的临床挑战。其特征是静息状态的成纤维细胞异常活化为肌成纤维细胞，并伴随细胞外基质（ECM）的过度沉积，是心力衰竭、心肌梗死及其他心血管疾病共有的不可逆终末通路^1,2,3。然而，目前的治疗策略存在显著局限性。常规干预措施——如利尿剂、β受体阻滞剂以及肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂——主要缓解全身血流动力学应激并减轻神经体液系统激活^4,5,6,7。这些疗法无法直接靶向成纤维细胞的活化过程，也不能阻止胶原蛋白的持续沉积。此外，尽管转化生长因子β（TGF-β）/Smad信号通路、氧化应激以及代谢重编程等信号级联反应驱动了该病理过程，但由于系统性毒性及非特异性递送机制的存在，将这些机制转化为直接作用的抗纤维化疗法仍面临挑战^8,9,10。因此，迫切需要开发新型、靶点特异性的抗纤维化疗法。目前转....

方案

我们确认所有实验均按照机构和国家的指南进行。由于本研究 exclusively 使用已建立的 NIH Swiss 小鼠胚胎成纤维细胞系（NIH/3T3）以及 mCol1a1p-mCherry 报告系统，且未涉及任何脊椎动物、胚胎或人类受试者，因此本手稿所述实验程序无需机构审查委员会的伦理审批。

所有涉及重组腺病毒载体的操作均按照机构生物安全规定和标准生物安全二级（BSL-2）实践进行。病毒操作、转导、储存和废弃物处理均在经认证的生物安全柜中进行，并使用适当的个人防护装备。含有腺病毒材料的液体废物在丢弃前使用新配制的含氯消毒液进行去污染处理，受污染的耗材根据机构生物安全规程进行高压灭菌。发生意外泄漏时，立即按照机构规定的溢出处理程序使用经批准的病毒灭活剂进行消毒。

1. 实验流程概述

1. 生成一只小鼠 Col1a1 如步骤2所述的启动子驱动的重组腺病毒
2. 按照第3步所述，优化NIH/3T3成纤维细胞中的病毒转导条件。
3. 建立 TGF-β 响应性 体外 如步骤4所述的纤维化报告基因模型。
4. 使用时间梯度和剂量梯度的 TGF-β 刺激，按照步骤 4 中所述方法验证模型的稳定性、特异性和生物学可重复性。
5. 使用 SB431542 进行....

结果

重组腺病毒mCol1a1p-mCherry的构建与包装示意图见图1A。将小鼠Col1a1启动子克隆至mCherry报告基因的上游，并插入腺病毒载体中，随后在HEK293细胞中进行病毒包装与扩增。该工作流程展示了关键实验步骤，包括病毒感染、纤维化刺激、药物干预以及基于荧光的信号检测。此示意图为报告系统的实施提供了可视化框架，并有助于后续功能验证实验的解读。

为确定最佳病毒感染条件，NIH/3T3 成纤维细胞在不同 MOI 条件下感染 mCol1a1p-mCherry 腺病毒。如图 1B所示，mCherry 荧光强度随 MOI 增加而增强。在低 MOI 条件下，报告基因表达较弱且呈异质性，不适合进行定量分析。在高 MOI 条件下，细胞形态发生改变，出现变圆和脱落现象，表明存在细胞毒性效应。MOI 为 100 时，荧光信号强且分布均一，同时细胞形.......

讨论

心肌纤维化促进心力衰竭的进展，而有效的抗纤维化疗法的开发受到缺乏纵向筛选平台的限制^2,13。评估抗纤维化疗效的传统方法包括蛋白质印迹（Western blotting）、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫荧光染色，这些方法依赖于终点检测，需要进行细胞裂解或固定。这些方法无法实现在活细胞中对纤维化进程进行实时监测，限制了其在纵向研究和高通量分析中的应用。此外，通过质粒转染或慢病毒整合构建稳定报告细胞系的方法，常受限于成纤维细胞中转染效率低、基因组随机整合带来的变异性，以及在连续传代过程中报告基因表达逐渐沉默等问题¹⁵。

尽管慢病毒载体常用于NIH/3T3成纤维细胞的基因递送，但本研究特别采用腺病毒报告系统，以保持成纤维细胞的生理保真性。慢病毒会永久整合到宿主基因组中，具有插入突变的固有风险，可能意外破坏内源性信号网络——这在评估TGF-β诱导的纤维化等复杂级联反应时尤为关键。相比之下，腺病毒载体以附加体形式存.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
384孔玻璃底微孔板	Cellvis，美国	P384-1.5H-N	用于细胞接种、病毒感染、染色和荧光成像的384孔玻璃底板
腺病毒骨架质粒	加拿大 Microbix	pBHGloxΔE1,3Cre	用于生成全长重组腺病毒基因组的质粒。
腺病毒穿梭载体：pDC315-mCol1a1p-mCherry	GeneChem，中国	定制服务	含2354 bp小鼠Col1a1启动子驱动mCherry表达的重组腺病毒穿梭载体
苯佐那酯核酸酶	默克密理博，美国	70664-3	用于腺病毒纯化过程中去除污染性核酸的内切核酸酶。
II级生物安全柜	新加坡 Esco 生命科学集团	AC2-4S1	用于重组腺病毒操作和无菌细胞培养程序的认证生物安全柜
细胞培养基（完全DMEM/F12）	HyClone，美国	12800-017	用于NIH/3T3和HEK293细胞培养的完全培养基。
CellPathfinder 图像分析软件	横河电机株式会社，日本	版本 3.08.01	用于自动荧光定量和细胞分割的图像分析软件
CellVoyager CV8000 高内涵筛选系统	横河电机株式会社，日本	CV8000	用于 mCherry 和 Hoechst 荧光采集的高内涵成像系统
CO2 细胞培养箱	赛默飞世尔科技公司，美国	3111	37℃恒温培养箱 °C，5% CO₂2 用于哺乳动物细胞培养。
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich，美国	D2650	用于SB431542配制的溶剂。
杜尔贝科’DMEM/F-12培养基（改良型伊格尔培养基/营养混合物F-12）	中国赛维尔生物	G4610	用于NIH/3T3成纤维细胞的基礎培養基。
胎牛血清（FBS）	澳大利亚奥士比安	VS500T	用于完全培养基制备的血清添加剂，使用浓度为10%（v/v）。
Hoechst 33342 荧光染料	Invitrogen，美国	H3570	用于荧光成像及细胞核计数归一化的核染色剂。
HEK293细胞	ATCC，美国	CRL-1573	用于腺病毒生产与扩增的包装细胞系
人重组TGF-β1	MedChemExpress，中国	HY-P78214	用于诱导NIH/3T3成纤维细胞纤维化活化的细胞因子。
图像采集软件	横河电机株式会社，日本	版本 3.08.01.03	用于自动荧光图像采集和显微镜控制的软件。
基于脂质的转染试剂	美国 Invitrogen	11668-019	用于将腺病毒质粒转染至HEK293细胞的转染试剂。
微量离心管	Axygen，美国	MCT-150-C	用于RNA裂解液储存和样本处理的离心管。
微孔板读板仪	瑞士，Tecan	火花	用于ELISA吸光度测定的多功能酶标仪。
小鼠 I 型胶原蛋白 ELISA 试剂盒	中国美科生物科技有限公司	MK6778A	用于定量培养上清液中分泌的I型胶原蛋白的ELISA试剂盒。
NIH/3T3 小鼠成纤维细胞	Procell生命科学，中国	CL-0171	用于报告基因模型建立与验证的小鼠成纤维细胞系
PacI 限制性内切酶	美国新英格兰生物实验室	R0547S	用于腺病毒质粒线性化的限制性内切酶。
青霉素–链霉素溶液	Gibco，美国	15140-122	添加1%（v/v）抗生素溶液以防止细菌污染。
PerfectStart Green qPCR SuperMix	中国，TransGen Biotech	AQ602	用于定量PCR分析的基于SYBR Green的qPCR预混液。
磷酸盐缓冲液（PBS）	中国赛维尔生物	G4202	用于洗涤细胞和试剂配制的缓冲液。
pDC315-EGFP 穿梭载体	GeneChem，中国	N/A	用于报告基因质粒构建的亲本腺病毒穿梭载体。
qPCR 系统	美国应用生物系统公司	QuantStudio 5	用于定量基因表达分析的实时PCR系统
限制性内切酶（BamHI 和 KpnI）	中国，Abclonal	RK21101, RK21104	用于穿梭载体线性化的限制性内切酶。
逆转录试剂盒	中国，TransGen Biotech	AT311	用于RT-qPCR前cDNA合成的逆转录试剂盒。
RNA裂解试剂	Invitrogen，美国	15596026	用于从培养细胞中提取总RNA的试剂。
SB431542	MedChemExpress，中国	301836-41-9	TGF-β 用于药理学抑制实验的I型受体抑制剂。
Sanger 测序服务/试剂	中国上海博尚生物科技有限公司	定制服务	用于质粒序列验证的测序服务/试剂。
血清移液管	美国康宁公司	4488	用于细胞培养操作中液体处理的无菌移液管。
T30 梯度PCR仪	中国LongGene科学仪器公司	T30	用于逆转录和PCR扩增的热循环仪。
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Gibco，美国	25200-056	用于常规细胞传代的细胞解离试剂。
病毒纯化试剂盒	Takara Bio USA	631533	用于重组腺病毒纯化的试剂盒
水浴锅	中国上海易恒科学仪器有限公司	HWS-12	用于腺病毒冷冻过程中的控温水浴–冻融循环。