本研究通过多种方法分析，确定了紫草素对抗肾细胞癌的核心靶点和通路 体外 验证，为后续的机制研究提供了框架。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本研究通过多种方法分析，确定了紫草素对抗肾细胞癌的核心靶点和通路 体外 验证，为后续的机制研究提供了框架。
肾细胞癌（RCC）是泌尿系统中最常见的肿瘤之一，且具有最高的死亡率。既往研究表明，紫草素可治疗肾细胞癌，但其作用机制尚不明确。因此，本研究旨在通过网络药理学、分子对接和 体外 功能实验，包括细胞增殖、迁移和凋亡，并通过蛋白质印迹（WB）进行验证。使用PharmMapper、SwissTargetPrediction及其他数据库筛选紫草素的作用靶点，同时从在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、GeneCards及其他数据库中获取肾细胞癌（RCC）相关靶点，通过交集分析获得潜在治疗靶点。构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，利用Cytoscape筛选核心靶点，并通过分子对接分析紫草素与关键靶点之间的结合亲和力。共收集到374个紫草素靶点和1,087个RCC相关靶点，识别出98个交集靶基因。筛选出6个核心靶点（SRC、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PTPN11和PIK3R1）。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析表明，紫草素主要通过调控蛋白激酶活性、HIF-1和IL-17信号通路发挥抗RCC作用。分子对接结果证实，紫草素与这些核心靶点具有较强的结合亲和力。 体外 研究 使用人肾细胞癌Caki‑1和786‑O细胞的研究表明，紫草素以剂量依赖方式显著抑制细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，并上调caspase‑3和caspase‑8的活性. Western blot 实验进一步证实，紫草素可调节核心靶蛋白的表达，并抑制 HIF-1 信号通路。本研究系统阐明了紫草素抗肾细胞癌的药理机制，为紫草素作为新型抗 RCC 药物的开发与应用提供了理论依据。
肾细胞癌（RCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，约占所有肾脏恶性肿瘤的90%，占全球成人恶性肿瘤的2%–3%。根据GLOBOCAN 2022年的数据，2022年全球约有434,800例肾细胞癌新发病例和155,953例死亡病例，肾细胞癌的发病率和死亡率均呈持续上升趋势。美国癌症协会预计，仅在2025年，美国将有80,980例肾细胞癌新发病例和14,510例死亡病例。肾细胞癌在泌尿系统恶性肿瘤中死亡率最高，转移性或耐药性肾细胞癌患者的预后仍然较差。随着靶向治疗和免疫治疗的广泛应用，肾细胞癌的临床治疗已取得显著进展。晚期或转移性肾细胞癌的一线标准治疗主要采用免疫检查点抑制剂联合方案，或免疫检查点抑制剂联合抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂的治疗方案。尽管治疗方法不断进步，仍有大量患者出现疾病进展、耐药或无法耐受治疗。因此，开发机制明确、安全且有效的新型抗肾细胞癌药物仍是迫切的临床需求1,2,3。
紫草素是从紫草根中提取的主要生物活性成分，其衍生物乙酰紫草素已表现出显著的抗肾细胞癌（RCC）药理作用。现有证据表明，紫草素通过多靶点、多通路的调控机制发挥抗RCC活性。在作用机制上，紫草素可上调肿瘤抑制基因TEK的表达，并抑制AKT/mTOR信号通路的磷酸化，从而抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭4；此外，紫草素可诱导细胞内活性氧（ROS）蓄积，导致线粒体功能障碍，进一步启动包括凋亡、坏死性凋亡和自噬在内的多种程序性细胞死亡模式5。紫草素还可调节miR-15b和miR-99b等microRNA的表达，并通过MAPK/ERK通路调控FOXO1和PDCD4等凋亡相关靶基因，这些调控效应表现出明显的细胞系特异性6。值得注意的是，紫草素对舒尼替尼耐药的RCC细胞系仍具有较强的抗肿瘤活性，其通过激活坏死小体复合物、抑制AKT/mTOR通路以及诱导G2/M期细胞周期阻滞来发挥治疗作用7。尽管已有实验研究部分验证了紫草素的抗RCC作用，但其核心治疗靶点、关键信号网络以及对抗RCC的分子调控机制仍不明确；此外，对其枢纽靶点的系统性预测、分子验证和实验确认仍缺乏，构成了当前研究中的一个重要空白。
网络药理学与分子对接是现代天然药物研究及药理机制探索中的互补性技术手段。从系统性视角出发，网络药理学能够系统解析生物活性成分与疾病相关靶点之间的多靶点、多通路整体相互作用特征；而分子对接则可在分子层面验证小分子化合物与核心靶标蛋白之间的结合亲和力及稳定相互作用模式。两种方法的结合构建了“整体靶点预测—分子水平验证”的系统性研究闭环。将实验验证与网络药理学和分子对接相结合，已成为天然药物研究的主流策略，有助于阐明疾病发病机制、解析化合物的药理作用机制，并为药物的基础研究与转化应用提供理论框架8,9。
本研究采用网络药理学方法预测紫草素在治疗肾细胞癌中的潜在作用靶点。通过分子对接技术对可能的靶点进行理论验证，并最终确定关键作用靶点 体外 实验，并通过蛋白质印迹（WB）实验进一步验证。本研究的完整流程如图所示 图1.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究中使用的所有人类细胞系均购自经过认证的商业细胞库，未收集新鲜的人体组织或患者样本，因此无需伦理审批 体外 基于细胞的研究
获取与预测紫草素的作用靶点
在 PubChem 数据库中检索关键词 "shikonin"，下载紫草素的 SDF 结构，并获取其简化分子输入线性系统（SMILES）表示。根据各靶点数据库的要求，于 2026 年 3 月 3 日从 PharmMapper、SwissTargetPrediction、HERB 和 SEA Search Server 数据库中预测并收集了紫草素的潜在作用靶点10,11,12。
获取肾细胞癌靶点
以肾细胞癌为关键词，从治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database, TTD）、OMIM 和 GeneCards 中检索来源于人类的疾病相关靶点，限定物种为智人（Homo sapiens），且相关性评分 > 50。最初共获得 1148 个靶点，经汇总与去重后，最终获得 1087 个唯一的肾细胞癌相关靶点13,14,15。
紫草素治疗肾细胞癌交叉靶点的鉴定
将紫草素的预测基因靶点与肾细胞癌靶点输入在线分析工具 Venny 2.1，通过交集分析鉴定重叠靶点，并以维恩图形式进行可视化展示。
构建成分-靶点-疾病网络
以紫草素为核心研究起点，整合这些核心靶点与肾细胞癌（RCC）之间的生理关联信息，利用 Cytoscape 可视化软件构建了"成分-靶点-疾病"三元系统的分子相互作用网络。
紫草素治疗肾细胞癌的蛋白质相互作用网络构建及核心靶点获取
蛋白质相互作用数据库 STRING 是构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的核心工具，可实现对蛋白质间相互作用关系的挖掘与可视化。本研究将紫草素与肾细胞癌的交集靶点提交至 STRING 数据库，并将物种限定为 Homo sapiens 进行进一步检索。点击继续按钮进入后续分析。在分析结果页面底部的设置模块中，将最低所需交互作用评分设为高置信度水平 0.900。同时，隐藏网络中无关的蛋白质及孤立节点，以获得优化后的 PPI 网络互作图谱。数据以 TSV 格式保存并导入 Cytoscape 软件，调整相应参数，使节点大小和颜色深浅反映对应数值，边线粗细反映结合评分。最终建立 PPI 网络图16,17。
基于上述蛋白质-蛋白质相互作用网络，准确筛选出核心靶点。在 Cytoscape 的 Apps 模块中打开 cytohubba 插件，点击 Calculate 按钮以启动计算程序。在“按选项排名的前 6 个节点”中选择 MCC 算法，然后点击 Submit 按钮完成计算。筛选出前六个核心靶点，并进行美化及数据下载。
紫草素治疗肾细胞癌的GO功能富集分析与KEGG通路分析
采用Metascape数据库进行GO功能富集分析。本研究将紫草素靶向基因与肾细胞癌的交集基因导入该数据库。首先选择物种为Homo sapiens（人），然后选择Custom Analysis模式，对GO功能富集的三个维度——分子功能、细胞组分和生物过程——进行富集分析。设定p值截断值为0.01，点击富集分析按钮，利用微积分平台进行分析，构建紫草素治疗肾细胞癌的GO功能富集分析可视化图谱18,19。
采用 KOBAS 3.0 数据库对紫草素与肾细胞癌之间的交集靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，该数据库可实现基因的通路注释及富集统计分析。将筛选得到的交集靶点导入 KOBAS 3.0 数据库，选择物种来源为 H. sapiens（人），筛选类型限定为 KEGG 信号通路，富集分析的 p 值阈值设定为 <0.01。分析完成后获得 KEGG 通路的富集结果。根据富集分析结果，以 p 值作为排序依据，筛选出前 10 条 KEGG 信号通路。借助微图平台完成可视化处理，最终绘制并保存 KEGG 富集桑基图气泡图20,21。
分子对接验证
紫草素的三维（3D）结构从 PubChem 数据库中获取，并使用 Open Babel 软件将其三维结构转换为标准 PDB 格式。通过网络药理学分析确定的核心靶点蛋白的三维结构，从 RCSB 蛋白质数据库和 AlphaFold 数据库中以 PDB 格式下载。靶点蛋白的晶体结构包括 PIK3CA（PDB ID: 9B4T）、PIK3CD（PDB ID: 8BCY）、PIK3R1（PDB ID: 7CIO）、PTPN11（PDB ID: 9R16）、SRC（PDB ID: 9NS1）、PIK3CB（AlphaFold 预测结构，AF-Q8BTI9-F1-model_v6）。使用 AutoDock Tools 去除水分子和异原子，添加极性氢原子，并分配 Gasteiger 电荷。采用 AutoDock Tools 软件选择适当大小的对接盒子，以覆盖整个靶蛋白进行分子对接。最终获得结合能最优的靶点-活性成分复合物的可视化结果。使用 PyMol 软件分析结合位点、相互作用类型及结合距离，并生成三维构象可视化图像22,23。
细胞毒性检测
将Caki-1细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于96孔培养板中，分别用12.5、25、50和100 µmol/L浓度的紫草素处理12小时和24小时。对于786-O细胞，仅采用相同浓度梯度进行24小时处理。使用MTT法评估紫草素对两种细胞系的细胞毒性作用。所有实验均设置三个生物学重复，每个条件设三个技术重复。结果以IC50值表示。尽管两种细胞系的整体抑制趋势一致，但紫草素对Caki-1细胞表现出更强的细胞毒性。因此，选择Caki-1细胞进行后续功能实验。
通过划痕损伤实验测定紫草素对Caki-1细胞迁移的影响
将处于对数生长期的Caki-1细胞和786-O细胞接种至6孔板中。使用无菌的200 µL移液枪头在每个孔底部划出平行的划痕。细胞过夜贴壁后，用PBS洗涤培养的细胞。随后用不同浓度的紫草素（12.5、25、50和100 µmol/L）处理细胞12小时。12小时后，在显微镜下观察同一位置划痕区域的变化情况。
计算紫草素对Caki-1细胞生长活性影响的公式如下：迁移率 = [(0 h划痕面积 − 12 h划痕面积) / 0 h划痕面积] × 100%。
半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-8活性的测定
收集处于对数生长期的Caki-1细胞，将细胞浓度调整至5 × 106 个细胞/mL，随后孵育12小时。将Caki-1细胞用不同浓度的紫草素（12.5、25、50和100 µmol/L）处理，并孵育24小时后，按照半胱天冬酶检测试剂盒说明书进行细胞检测。
紫草素对Caki-1细胞凋亡率的影响
将处于对数生长期的Caki-1细胞接种至6孔培养板中。用浓度分别为12.5、25、50和100 µmol/L的紫草素处理细胞，处理时间为24小时，无对照组。细胞用PBS轻轻重悬，收集并计数。取总共1 × 105个重悬细胞，在300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于195 µL Annexin V-FITC结合缓冲液中。然后加入5 µL Annexin V-FITC，再加入10 µL碘化丙啶染色液，每次加入后均轻轻混匀。细胞在室温（20–25 °C）避光孵育15分钟，随后进行分析。
细胞信号通路分析
用 12.5、25、50 和 100 µmol/L 的紫草素处理 Caki-1 细胞。处理 24 小时后，用预冷的 PBS 收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液进行裂解，并测定蛋白浓度。使用 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白。转膜至 PVDF 膜后，用 5% BSA 封闭 3 小时，然后在 4 °C 下与不同的 1° 抗体孵育过夜。随后，将膜与 1:3000 稀释的 2° 抗体孵育。使用 ECL 检测系统检测蛋白条带，并用 ImageJ 软件进行定量分析。
统计学分析
实验结果以均值 ± 标准差（x ± s，n = 3）表示。在进行参数统计分析前，采用Shapiro-Wilk检验验证正态性，并通过Levene检验评估方差齐性。使用SPSS软件进行单因素方差分析（ANOVA），并结合Tukey事后检验。统计图表使用GraphPad Prism软件绘制。组间两两比较采用独立样本t检验，当p < 0.05时，认为差异具有统计学意义。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
获取和预测紫草素的作用靶点
利用上述四个数据库预测紫草素的潜在作用靶点，经整合与汇总后共鉴定出426个靶点。汇总后的靶点经去重处理，最终获得374个靶点，如图2A所示。
获取肾细胞癌靶点
在整合三个数据库的相关数据后，共获得1,147个靶点，经汇总和去重后，共获得1,087个肾细胞癌相关靶点。
紫草素治疗肾细胞癌交叉靶点的鉴定
通过将紫草素的预测靶点与肾细胞癌相关靶点取交集，共鉴定出98个重叠靶点，代表了紫草素治疗肾细胞癌的关键靶点，如图2B所示。
构建成分-靶点-疾病网络
为了系统分析紫草素在治疗肾细胞癌中的分子调控机制，我们首先对紫草素的潜在作用靶点进行了系统的整合筛选与验证，最终确定...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
PIK3CA 的正式名称为磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α异构体。PIK3CA 是 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的核心组分，在肾细胞癌（RCC）的发生、发展及治疗中发挥关键作用。研究表明，PIK3CA 是该亚型中高频突变的基因（57例中6例，占11%），其突变与 PI3K/AKT 通路的异常激活直接相关。此外，携带此类突变的患者对免疫检查点抑制剂联合酪氨酸激酶抑制剂（ICI/TKI）治疗方案反应良好，客观缓解率和疾病控制率均显著优于传统疗法24。研究证实，PIK3CA 是肾细胞癌中最常发生改变的基因之一，在透明细胞癌等主要亚型中均存在突变。其异常激活可驱动肿瘤血管生成和增殖，也是酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗耐药的重要机制之一25。此外，PIK3CA 作为激活 mTOR 通路的关键基因，通过调控细胞生长与代谢促进肿瘤增殖。该基因突变与 mTOR 抑制剂治疗耐药相关，且是独立的不良预后因素，为肾细胞癌的靶向治疗提供了潜在靶点26。综上所述，PIK3CA 不仅是肾细胞癌的核心驱动...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
本研究由贵州省卫生健康委员会科技项目（gzwkj2024-516）；贵州中医药大学国家和省级科技创新人才团队培育项目，贵州中医药大学TD希望项目[2023]005；贵州省自然科学基金[资助编号：ZK[2024]404]；基于长循环Pickering乳液特性的川芎蛋白-多糖复合物促进川芎治疗头痛的研究（82360779）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 786-O | 美国典型培养物保藏中心（ATCC） | RRID: CVCL_1051 (ATCC CRL-1932) | 人透明细胞肾细胞癌细胞系 |
| AlphaFold 数据库 | 欧洲分子生物学实验室（EMBL）- EBI | AlphaFold 蛋白质结构数据库 | 蛋白质结构预测数据库（AlphaFold Protein Structure Database） |
| AutoDock Tools 软件 | 斯克里普斯研究所 | 1.5.7 | 用于配体-蛋白质结合预测的分子对接软件 |
| Caki-1 | 美国典型培养物保藏中心（ATCC） | RRID: CVCL_0234 (ATCC HTB-46) | 人透明细胞肾细胞癌细胞系 |
| Caki-1 细胞 | 牡丹江师范学院 | HTB-46 (RRID: CVCL_0234) | 人透明细胞肾细胞癌细胞系 |
| Caspase 3 和 Caspase 8 检测试剂盒 | 瑞银生物科技有限公司（中国泉州） | Caspase-3 活性检测试剂盒，货号 RX302848M，Caspase-8 活性检测试剂盒，货号 RX302849M | 用于检测caspase活性以评估细胞凋亡 |
| Cytoscape 软件 | Cytoscape 联盟 | 3.9.1 | 用于生物网络的构建与可视化 |
| DMEM 培养基 | Hyclone | SH30022.01 | Caki-1 和 786-O 细胞培养的细胞培养基 |
| 胎牛血清 | Gbico | 10099-141 | 用于Caki-1和786-O细胞生长的细胞培养添加剂 |
| GeneCards | 魏茨曼科学研究所 | https://www.genecards.org/ | 用于目标基因注释的综合性人类基因数据库 |
| GraphPad Prism | GraphPad，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 版本 8.3.0 | 用于统计图表的绘制 |
| HERB数据库 | 中国科学院 | http://herb.ac.cn | 传统中药成分-靶点数据库 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | Fiji | 用于细胞形态分析和Western blot条带定量的图像分析软件 |
| 倒置显微镜 | 奥林巴斯，IX73，日本 | 100× 放大倍数 | 用于观察紫草素处理后细胞形态的变化 |
| KOBAS 3.0 数据库 | 北京大学 | http://bioinfo.org/kobas/ | 基因本体与通路富集分析工具 |
| Metascape 数据库 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | https://metascape.org/gp/index.html | 基因功能富集与网络分析工具 |
| 微型信贷平台 | 中国国家生物信息中心 | http://www.bioinformatics.com.cn/ | 用于数据处理的在线生物信息学分析平台 |
| MTT 检测试剂盒 | Solarbio 科学 &安普科技有限公司（中国北京） | 货号 M8180 | 用于检测细胞活力（抗增殖实验） |
| 在线人类孟德尔遗传数据库 | 约翰斯·霍普金斯大学医学院 | https://www.omim.org/ | 在线人类孟德尔遗传（人类遗传病数据库） |
| PharmMapper 数据库 | 华东理工大学 | https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ | 小分子药物靶点预测数据库 |
| PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 和 PTPN11 | Santa Cruz Biotechnology, Inc.（美国德克萨斯州达拉斯） | Santa Cruz Biotechnology, Inc.（美国德克萨斯州达拉斯） | 用于目标蛋白 Western 印迹分析的一抗 |
| PyMol 软件 | 施ödinger, Inc. | 2.2.0 | 用于蛋白质结构分析的分子可视化软件 |
| RCSB 蛋白质数据库 | RCSB 蛋白质数据库（罗格斯大学） | https://www.rcsb.org/ | 用于分子建模的蛋白质结构数据库（PDB） |
| SEA 搜索服务器数据库 | 加利福尼亚大学旧金山分校 | https://sea.bkslab.org | 相似性集成方法用于靶点预测 |
| 紫草素（纯度98%） | 起源于中国的叶生生物 | Y0001439 | 本研究中用于肾细胞癌（RCC）治疗的小分子化合物 |
| SPSS | IBM，阿蒙克，纽约州，美国 | 版本 20.0 | 用于统计分析 |
| STRING | 欧洲分子生物学实验室（EMBL） | https://stringdb.org/ | 蛋白质-蛋白质相互作用网络数据库 |
| SwissTargetPrediction 数据库 | 瑞士生物信息学研究所 | https://www.swisstargetprediction.ch/ | 用于药物发现的小分子靶点预测工具 |
| 治疗靶点数据库 | 中国科学院上海药物研究所 | https://ttd.idrbrab.cn | 治疗靶点与药物数据库 |
| Venny 2.1 | 西班牙国家生物技术中心（CNB-CSIC） | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html | 用于数据分析交集的维恩图工具 |