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杂交链式反应FISH在发育过程中的应用 果蝇 视叶

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DOI：

10.3791/71681

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2026年7月17日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

通讯作者： Jennifer A. Malin <jmalin@ccny.cuny.edu>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案描述了进行杂交链式反应荧光检测所需的步骤 原位 杂交（HCR-FISH）在 黑腹果蝇 幼虫视叶。本文详细介绍了探针设计、杂交、扩增及组织封片的操作步骤，以促进对发育中视叶的可视化观察。

摘要

理解神经发育需要精确表征基因表达的时间和位置。诸如 原位 杂交技术长期以来已能够实现发育组织中基因表达的可视化。尽管 原位 杂交技术被广泛应用于 黑腹果蝇 胚胎，其在视觉系统发育研究中的应用受到若干技术挑战的限制。例如，较长的探针通常难以充分渗透至视叶，而依赖可扩散催化报告分子（如辣根过氧化物酶）的方法在整体样本制备中往往产生较低的信噪比。荧光杂交链式反应 原位 杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）克服了上述诸多局限，实现了更稳定的信号检测。与传统FISH相同，DNA探针单体可与组织内的RNA序列杂交。然而，在HCR-FISH中，携带荧光标记的放大探针形成稳定的发夹结构，可触发额外单体的聚合，从而增强信号强度。多重探针组的使用还允许采用更短的寡核苷酸（约45 nt，而传统FISH中可达1,000 nt），提高了探针穿透性，并在整体样本中产生更均匀的染色效果。本文介绍了一种优化的HCR-FISH实验方案，适用于 果蝇 幼虫视叶。本方案通过优化固定条件并提高探针和发夹寡核苷酸的浓度，对现有的HCR-FISH方法进行了改进，以增强信号强度和组织穿透性。文中提供了详细的试剂清单和分步操作流程。此外，还展示了该技术在发育神经生物学中的潜在应用，包括新生神经元的可视化，以及在内源标记蛋白或抗体染色等常规方法无法提供足够信息时，对基因表达模式的表征。

引言

理解大脑的组装机制需要鉴定出存在的细胞类型多样性以及每种细胞类型中表达的基因库1。单细胞RNA测序技术的最新进展使研究人员能够以高分辨率回答这些问题2。然而，许多单细胞方法无法保留空间信息，因此需要额外的实验将转录组定义的细胞类型簇映射到发育中大脑内的具体位置。

诸如GAL4-UAS之类的双元基因表达系统可以提供位置信息，但无法实现定量分析3。此外，基因表达与报告基因检测之间的时间延迟可能会掩盖早期发育阶段中具有生理相关性的表达模式。免疫染色是确定组织特异性表达模式的另一种常用方法4。然而，分泌型蛋白通常分布弥散，难以精确定位。

核苷酸标记方法，例如 原位 原位杂交（ISH）也被广泛用于获取基因表达的空间信息5在原位杂交（ISH）中，标记的DNA寡核苷酸与目标RNA序列的反向互补序列结合。早期的ISH方法采用放射性标记的DNA探针。6，而后续的实验方案则采用了更安全的标记物，如地高辛、荧光素和罗丹明7,8,9科学家迅速将 ISH 用于 黑腹果蝇，其中该技术被用于表征多线染色体的结构，并绘制诸如成对基因等间隙基因的表达模式 hunchback 在整体胚胎中10,11.

尽管原位杂交技术应用广泛，但其在较厚的整体标本（如幼虫视叶）中的应用仍受到若干技术限制。许多 原位 实验方案依赖可扩散的催化报告分子（如辣根过氧化物酶），常导致信噪比较低12此外，许多方法采用针对单一序列的长探针以提高特异性。尽管这种方法在某些情况下有效， 果蝇 胚胎和多线染色体中，长片段探针难以充分渗透至幼虫脑组织，常导致标记不均10,11,13.

单分子荧光原位杂交（smFISH）与杂交链式反应荧光技术的发展 原位 杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）解决了其中许多局限性14,15通过使用覆盖单个基因区域的一组短探针，单分子荧光原位杂交（smFISH）将探针的平均长度从约1,000 nt减少至约40 nt16这显著提高了探针的穿透性，同时保持了较强的信号强度。HCR-FISH 通过使用荧光标记的放大探针，进一步提高了信噪比，增强了信号定位的准确性并放大了信号输出。重要的是，该扩增步骤似乎与转录本浓度呈线性关系，从而能够对基因表达水平进行定量测量。17.

HCR-FISH 从与靶序列互补的引发探针开始。这些未标记的 DNA 寡核苷酸包含一个单链引发序列，可与荧光标记的 H1 放大探针的输入区结合。H1 放大探针呈发夹结构，在未与引发序列结合时保持催化非活性状态。一旦结合，H1 放大探针打开，并暴露出可与伴侣探针 H2 结合的序列。该相互作用使 H2 发夹结构打开，从而使其能够结合另一个 H1 探针（图 1）15。H1 与 H2 反复结合的循环过程生成一种稳定的聚合物，在放大荧光信号的同时降低背景噪声。由于每个引发序列均特异性对应一对 H1/H2 探针，因此可在同一样本中同时使用具有不同引发序列和荧光染料的多种探针，以标记多个基因。

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图1：HCR-FISH 实验流程的图示。含有引发序列的 DNA 探针与靶标 RNA 转录本杂交。带有荧光标记的 DNA 放大发夹结构与引发序列结合，并依次发生聚合反应，形成稳定的双链放大链。直接连接荧光染料可提高信号放大效果和信噪比。请点击此处查看该图的放大版本。

HCR-FISH 技术的近期改进进一步提升了其应用价值。采用分裂引发子探针设计可提高扩增器的特异性，而将HCR引发子与二抗偶联则可实现免疫组织化学与HCR-FISH的同步检测18。此外，目前可选的荧光染料种类不断扩展，现已能够同时对多达10个基因进行多重成像19,20。

尽管HCR-FISH的初步概念验证实验是在斑马鱼（Danio rerio）中进行的，但该方法已在多种体系中得到广泛应用，特别是在缺乏或难以获得抗体的非模式生物中15。探针合成相比抗体制备也提供了更快的替代方案，后者通常需要数月的开发时间。因此，HCR-FISH为通过单细胞RNA测序数据集鉴定出的候选基因提供了快速验证手段21。即使在已建立的遗传模式生物中，当GAL4报告系统或免疫组织化学无法充分标记特定细胞群体时，HCR-FISH仍是一种用于空间定位新生神经元的有价值方法。

本文介绍了一种针对三龄幼虫优化的HCR-FISH实验方案 果蝇 视叶。该方案借鉴了先前在其他生物体中发表的方法，并将其应用于 果蝇 视觉系统22常用的固定条件 果蝇 免疫组织化学条件已针对FISH应用进行了优化。探针和发夹的浓度有所提高，以增强信号强度并改善组织穿透性。采用PCR管代替点样板，以减少试剂消耗并简化小组织样本的操作。此外，洗涤和杂交时间也相应缩短，以适应较小样本尺寸的需求 果蝇 与其他常用于HCR-FISH的昆虫系统相比，大脑组织具有相对较高的复杂性。

代表性应用表明，该方法可在发育过程中为特定神经元群体提供位置信息。这些实验表明，与抗体染色或报告基因品系相比，某些转录本（如abrupt）可通过HCR-FISH更早地被检测到。本文还讨论了在研究黑腹果蝇（Drosophila）视觉系统发育过程中应用HCR-FISH可能面临的挑战、故障排除策略及其应用前景。

方案

Drosophila melanogaster 的所有实验均按照纽约市立学院、哥伦比亚大学和纽约大学关于实验生物护理与使用的指南进行。本实验方案中使用的研究工具列于材料表中。

1. 准备缓冲液

注意：使用滤芯枪头，在无核酸酶的离心管中配制所有试剂。
注意：整个操作过程中需佩戴手套。实验开始前，用RNase去污染溶液清洁工作台面。

  1. 准备无核酸酶溶液
    1. 通过将20x PBS、Triton X-100和甘氨酸溶于无核酸酶水中，配制1x PBS-T，终浓度为1x PBS、1% (v/v) Triton X-100和1 mM甘氨酸。
    2. 通过将20x SSC和Tween-20溶于无核酸酶水中，配制5x SSCT，终浓度为5x SSC并含0.1% (v/v) Tween-20。
    3. 将20x PBS用无核酸酶水稀释，配制1x PBS。

2. 设计探针

  1. 要设计商业探针，选择 目标物种中感兴趣的目的亚型 使用供应商的网页界面订购与所需扩增子匹配的探针。
    注意： 商业化的HCR探针化学体系及引发序列均为专有技术 并由 Molecular Instruments 持有专利。
    1. 修改目标区域 如果需要进行转录本特异性或pre-mRNA检测，可使用网络界面。
    2. 为高表达转录本订购约20个探针，对于整体样本中低丰度转录本，可使用多达40个探针。 黑腹果蝇 制备物。
      注意： 为较短的转录本订购专用的寡核苷酸，以适应较少的探针结合位点。
  2. 手动设计探针时，需下载目标转录本的FASTA序列。确定是针对单一转录本还是该基因的所有转录本。
    注意： 优先选择从RNA测序数据集中鉴定出的组成型外显子或高表达的转录本异构体 增强信号
    1. 若设计用于前体mRNA检测的探针，应设计跨越内含子-外显子连接区的探针。探针应跨越剪接位点 检测成熟转录本。使用内含子探针检测细胞核内的新生转录本。
      注意： 内含子探针可能不会与成熟的细胞质转录本共定位，因此可能需要额外的标记物来识别细胞。
    2. 确定探针集大小。对于短转录本，在无法设计较大探针集的情况下，至少使用约5个探针；标准应用使用20个探针；对于整体样本中实现最佳灵敏度，建议使用约40个探针。18,23.
    3. 若自行设计探针，应使用由2bp间隔区分开的25nt序列，并在每条寡核苷酸的5’端添加分裂的引发序列。
      注意： 尽管第一代分裂启动子序列已公开，但新一代商业化的启动子序列属于专有技术18.
    4. 若自行设计探针，需验证探针序列，确保每组内各探针具有相似的熔解温度，并确认探针间序列完全一致（100%同源性）。
      注意： 避免富含G的强二级结构区域，并保持各探针之间的GC含量相近24. 尽量减少重复序列，并使用BLAST评估脱靶结合25.
    5. 在适当情况下使用公开可用的探针设计软件26,27.
      注意： 开源设计工具可能无法重现商业探针设计流程的优化性能。

3. 解剖、固定并预杂交大脑

  1. 将探针杂交缓冲液预热至 37 °C。
    注意：探针杂交缓冲液含有甲酰胺。操作时须佩戴适当的个人防护装备，并在化学通风橱中进行。
  2. 使用无核酸酶的去离子水将每组探针稀释至终浓度为 1 µM。
  3. 将约 250 µL 无核酸酶的 PBS 溶液分装至解剖皿中。
  4. 用镊子将一只自由爬行的三龄幼虫转移至 PBS 中。用一对镊子夹住腹部，用另一对镊子夹住口钩，将口钩从身体上拉开，以分离出脑和腹神经索（VNC）。
  5. 去除脂肪体和唾液腺，保留腹神经索。将解剖得到的脑组织转移至含有 600 µL 冰上预冷的无核酸酶 PBS 的离心管中。
    注意：在整个解剖过程中保持视叶浸没在液体中，以防止组织干燥。
  6. 重复解剖操作，直至收集到约六个视叶。解剖过程应在 20 分钟内完成，以尽量减少组织降解。
  7. 加入 200 µL 16% 多聚甲醛（PFA），使终浓度达到 4% PFA。轻轻颠倒混匀离心管，并在室温下孵育 15 分钟。
    注意：PFA 具有毒性和致突变性。操作时须佩戴手套，并在化学通风橱中进行。
  8. 移除样品中的固定液，并按指定化学废弃物处理。用 600 µL 冷的无核酸酶 PBS 洗涤样品三次，使用 解剖皿收集洗涤液。
    注意：检查洗涤液中是否有组织丢失，并在解剖显微镜下回收任何移位的脑组织。
  9. 将脑组织转移至含有 100 µL 预热探针杂交缓冲液的 PCR 管中。
    通过轻弹管壁轻轻混匀，在室温下孵育 10 分钟。
    注意：确保脑组织保持浸没状态，不附着于管壁。

4. 杂交探针

  1. 通过将每组探针各0.4 pmol加入探针杂交缓冲液中，配制终体积为100 µL的4 nM探针溶液。
    注意：若初始染色信号强度较低，可将探针浓度提高至16 nM。
  2. 移除预杂交缓冲液时避免扰动组织，向每个样本中加入稀释后的探针溶液。
  3. 将样本置于37 °C摇床上孵育16–24小时。

5. 放大探针信号

  1. 将扩增缓冲液置于室温。每份样品准备约 200 µL 扩增缓冲液。
  2. 平衡洗涤缓冲液。将探针洗涤缓冲液在水浴中预热至 37 °C 。
    注意：探针洗涤缓冲液含有甲酰胺。请在化学通风橱中操作。
  3. 移除探针溶液，并于 -20 °C 保存以供重复使用。
    注意：探针溶液可重复使用，直至染色强度下降。
  4. 在 37 °C 预热的探针洗涤缓冲液中，对样品进行四次洗涤，每次 10 分钟。在室温的 5x SSCT 中对样品进行两次洗涤，每次 5 分钟。
  5. 加入不含发夹探针的 100 µL 扩增缓冲液。在室温下孵育 30 分钟。
  6. 将热循环仪预热至 95 °C。将 2 µL 的每种 3 µM 发夹探针原液分别加入不同的 PCR 管中。每种发夹探针准备一个独立的 PCR 管。
    注意：若染色产生稀疏的点状信号或信噪比较低，应提高扩增剂浓度。
  7. 在 95 °C 孵育发夹探针 90 秒。避光并在室温下继续孵育至少 30 分钟。
  8. 配制扩增溶液。将发夹探针加入扩增缓冲液中，每份样品终体积为 100 µL。
  9. 从样品中移除扩增缓冲液，加入含发夹探针的扩增缓冲液。
    在避光条件下（用铝箔包裹），于室温在旋转摇床上孵育过夜 。
  10. 移除扩增溶液。在 150 µL 的 5x SSCT 中洗涤样品两次，每次 5 分钟。在 150 µL 的 5x SSCT 中于旋转摇床上洗涤三次，每次 10 分钟。用无核酸酶 PBS 进行两次快速洗涤，以去除去污剂。

6. 为成像制备脑组织切片

  1. 将成像间隔贴纸粘附到玻璃载玻片上。轻轻按压以确保贴合。 使用镊子的底端去除滞留的气泡。
  2. 使用镊子沿腹神经索将脑部纵向剖开。
  3. 将脑组织置于隔片孔的中央，侧向定位，使视叶朝上。
  4. 加入足量的抗荧光淬灭封片剂（约 25 µL） 用镊子均匀分布封片剂，以填满孔板并避免引入气泡。
  5. 将盖玻片置于样品上，并用指甲油封固。

结果

对于研究发育神经生物学的科学家而言， HCR-FISH 提供了一种可靠的方法，用于可视化基因表达模式并确定发育中神经元在空间上的位置 果蝇 视叶

在果蝇（Drosophila）视叶中（图2A），髓质神经纤维网中的神经元起源于一种空间模式化的神经上皮——外增殖中心（Outer Proliferation Center, OPC）所产生的神经干细胞（神经母细胞）（图2B）28。这些神经母细胞按顺序表达不同的转录因子，随时间推移产生多样化的神经元类型。因此，神经元根据出生顺序呈同心环状排列29,30,31,32,33。先出生的神经元位于最靠近神经纤维网的位置，而后出生的神经元则在发育中的视叶中依次占据更外围的位置30,33。其他视叶神经元来源于不同的前体区域；例如，小叶神经元起源于OPC内侧边缘的 lamina 前体细胞（lamina precursor cells, LPCs），而许多 lobula 复合体神经元则起源于内增殖中心（Inner Proliferation Center, IPC）（图2B）。

单细胞转录组学方法已实现了对发育过程中调控视叶神经元特化的时空转录因子的鉴定2,33,34。尽管这些方法能够提供丰富的分子信息，但通常缺乏足够的空间分辨率来确定神经元诞生的位置。HCR-FISH 能够在完整组织内直接可视化转录定义的神经元群体。

例如，HCR-FISH 验证了关于远端髓质（Dm）神经元时空起源的先前研究结果。Dm2 神经元亚型表达转录因子 Distal-less (Dll），细胞黏附分子 Fas2，以及转录因子 哈姆雷特 (火腿) (图 2C由于Fas2蛋白主要定位于神经元突起，免疫组织化学染色难以清晰识别Dm2细胞的胞体35相比之下， Fas2 转录本定位于胞体内，并可通过HCR-FISH轻松检测。代表性染色结果显示，Dm2神经元位于发育中视叶的后缘，符合晚出生神经元的身份特征（图2C）。它们沿背腹轴的分布也支持了先前的单细胞RNA测序数据，表明Dm2神经元起源于视叶内的多个空间区域36相比之下，一个 火腿-GFP 报告基因品系在发育过程中未能充分标记 Dm2 神经元图 2C’).

另一种髓质神经元亚型 Dm4 起源于腹侧神经上皮中的干细胞，其起源区域比仅基于转录组数据集预测的范围更小36,37。为了更精确地确定 Dm4 神经元的空间起源，我们针对 Dm4 特异性的转录因子 abrupt 进行了 HCR-FISH 检测。HCR-FISH 检测到离散的点状信号，对应于预测神经发生区域内的一个受限细胞群（图 2D）。由于在三龄幼虫期 abrupt 的表达较弱，ab-GFP 报告基因品系和抗 Abrupt 免疫染色均无法清晰地标记 Dm4 神经元（图 2D’，2D’’）。HCR-FISH 还检测到位于视叶外侧边缘的窗孔状胶质细胞中存在 abrupt 的表达（图 2E），这与先前的单细胞 RNA 测序数据集结果一致21。使用 ab-GFP 报告基因未能观察到该表达模式（图 2E’）。

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图2：HCR-FISH 标记发育中的视叶神经元 果蝇 视觉系统 ISH = 原位 杂交；IHC = 免疫组织化学 （A） 示意图 果蝇 视叶，包括外髓、内髓、叶柄和叶柄板。光感受器R1-R6投射至外髓，而R7-R8投射至内髓。使用HCR-FISH标记远端内髓（Dm）神经元Dm2（紫色）和Dm4（蓝色）。 （B） 三龄幼虫视叶的组织结构。神经干细胞（神经母细胞）起源于外增殖中心（OPC）。视网膜神经元起源于位于OPC内侧边缘的视网膜前体细胞（LPCs）。. 髓质位于视网膜下层的下方。许多小叶复合体神经元起源于内增殖中心（IPC）。 (C) HCR-FISH 检测 Fas2, Distal-less (Dll），以及 哈姆雷特 (火腿标记 Dm2 神经元（箭头）。 （C’） 火腿-GFP 报告基因的表达不能准确标记发育中髓质的 Dm2 神经元（虚线表示髓质神经 Neuropil）。 （D） HCR-FISH 检测 突然的 (ab标记 zfh1 阳性的 Dm4 神经元（箭头），但不标记 CG4328 阳性的 Dm1/Dm12 神经元，与此前的单细胞 RNA 测序数据集一致21,37. (D’) Anti-Abrupt 免疫组织化学染色未能清晰标记 SoxN 阳性、Tj 阳性的 Dm4 神经元（箭头）。 （D’’） ab-GFP 报告基因在发育中的髓质中表达较弱，限制了对内源性表达的表征 突然的 表达模式（虚线表示髓质神经 Neuropil）。 (E) HCR-FISH 检测 突然的 (ab)有孔胶质细胞（虚线）邻近区域中的表达 brk 和 dpp 表达 (E’) ab-GFP 报告基因的表达未能重现有孔毛细血管胶质细胞（虚线）中内源性基因的表达模式。 请点击此处以查看此图的放大版本。

当报告基因品系无法准确重现转录活性时，HCR-FISH 还可用于表征内源性基因表达模式。先前的研究表明，BMP/Dpp 信号梯度在视叶发育过程中调控多种髓质神经元类别的特化37,38。这些信号区域在视叶内表现出空间受限的表达模式（图 3A）。Dpp 在视神经上皮的后缘表达，该信号诱导转录因子 Mad 的磷酸化。活化的 pMad 促进optomotor blind（omb）的表达，同时抑制brinker（brk），从而形成彼此互斥的表达区域。BMP I 型受体thickveins（tkv）在前部神经上皮中表达，并与空间转录因子Vsx、Optix 和 Rx 协同作用，调控神经元的特化37,39。

尽管已有研究表征了多个BMP信号通路组分的表达模式，但该通路其他成员在视叶中的分布仍不明确。本研究采用HCR-FISH技术靶向BMP II型受体 一厢情愿 (wit) 在发育中的视神经上皮和新生神经元中表现出广泛的表达（图3B-B’）。然而，一个 wit-GAL4 报告基因品系未能准确重现脑内内源性表达模式图3C’).

BMP II型受体punt（put）表现出相关但不同的表达模式，在髓质和小叶神经纤维网的神经元中表达更强（图3D-D’）。尽管wit和put均广泛表达，但它们的表达区域并不完全相同（图3D’’），提示这些受体可能在不同的发育环境中发挥作用。

类似地，尽管经典的Smad蛋白Mad仅在有限的信号传导区域内表达，共Smad蛋白Medea则在整个视叶中表现出更广泛的表达分布（图3A、3E-E’’）37。为了将这些表达区域与BMP信号区域进行比较，在表达由dpp-GAL4驱动的核定位GFP报告基因的视叶中进行了HCR-FISH实验。内源性GFP荧光在固定后仍保持足够强度，无需额外的免疫染色（图3B’、3D’、3E’）。

综上所述，这些代表性结果表明，HCR-FISH 为在发育中的 Drosophila 视觉系统内定位基因表达模式提供了一种可靠且灵敏的方法。当增强子-GAL4 系或基于抗体的方法无法准确反映内源性转录活性时，该方法尤为有价值。

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图3HCR-FISH 揭示发育中视神经上皮中 BMP 信号通路基因的表达模式 (ABMP信号通路组分在发育中的视叶内呈现空间限制性表达模式（改编自Malin等，2024）37空间转录因子 Vsx, Optix，以及 Rx 在背腹轴上表达39Dpp = 无成对（Decapentaplegic）；pMad = 磷酸化的Mad；Omb = 视动盲（Optomotor blind）；Brk = Brinker；Tkv = Thickveins。D = 背侧（dorsal）；V = 腹侧（ventral）；A = 前端（anterior）；P = 后端（posterior）；L = 侧方（lateral）；M = 内侧（medial）。 (B-B’、D-E’’视叶中表达的BMP信号通路组分的HCR-FISH dpp-GAL4；UAS-nls-GFP（Stinger）。内源性GFP荧光在固定后仍可检测，无需额外免疫染色。ISH = 原位 杂交；IHC = 免疫组织化学 (B针对BMP II型受体的HCR-FISH 一厢情愿 (wit标记一个新月形区域，该区域与发育中的视神经上皮及新生神经元重叠。 (B’) wit HCR-FISH 标记与 dpp-GAL4；UAS-nls-GFP 表达。 (C) 智慧-GAL4；UAS-myr-GFP 报告基因的表达不能准确模拟内源性表达 wit 通过HCR-FISH观察到的表达模式。 (D针对BMP II型受体的HCR-FISH 点刺 (放置在发育中的视叶中标记了一个更局限的表达区域。 (D’) 放置 HCR-FISH 标记与 dpp-GAL4；UAS-nls-GFP 表达。 (D’’共标记 wit 和 放置 在发育中的视叶神经元中表现出部分重叠但各自特异的表达区域。 (E共用 Smad Medea (医学表现出与HCR-FISH表达模式相似的特征 wit 和 放置. (E’) 医学 HCR-FISH 标记与 dpp-GAL4；UAS-nls-GFP 表达。 (E’’共标记 wit 和 医学 展示更广泛的 医学 发育神经元中的表达 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本研究描述了一种用于HCR-FISH的改良方法 黑腹果蝇 幼虫视叶。常规 原位 杂交方法在整体幼虫脑组织中通常效果较差，主要由于探针渗透有限和信号强度低。本文介绍的方案通过优化多个关键步骤，提高了发育中视叶染色的质量。通常用于 果蝇 免疫组织化学方法经过调整，以在保持RNA完整性的同时保护组织形态。提高探针和扩增剂的浓度可增强信号强度和信噪比，尤其对于表达较弱的转录本而言效果显著，例如 突然的此外，较短的探针长度改善了在约100 µm厚的幼虫脑组织中的渗透，包括DAPI染色通常渗透受限的区域图 2D).

成功实施本方案需注意若干技术要点。解剖过程中，视叶必须始终保持浸没在缓冲液中，以防止固定前组织脱水。由于HCR-FISH用于检测RNA转录本，所有步骤均应在无RNase的条件下进行，以最大限度减少RNA降解。正确的发夹探针制备对于实现有效的信号放大也至关重要。发夹探针必须在扩增前分别进行变性与冷却，以防止在探针结合前发生过早的聚合反应。

HCR-FISH 相较于传统方法在研究中具有多项优势 果蝇 神经发育。该方法通过提供内源性转录本定位的直接空间信息，弥补了免疫组织化学和GAL4报告系统的技术局限。由于转录发生在蛋白质积累之前，基于RNA的检测能够比抗体染色或报告基因表达更早地揭示细胞类型特异性标志物。33,40,41这一特点对于鉴定新生神经元并表征神经元特化的早期阶段尤为有价值。与先前为较大昆虫组织开发的已发表HCR-FISH方法相比，本方案采用了更短的洗涤和杂交时间，已针对较小样本优化 果蝇 幼虫大脑。使用PCR管代替斑点板还可减少试剂消耗，并简化小组织样本的操作。

尽管具有上述优势，但仍需考虑一些局限性。弱表达的基因可能会产生微弱的杂交信号，尤其是在转录本丰度较低时。通常可以通过增加探针浓度或扩大探针组内的探针数量来提高信号强度。此外，HCR-FISH 可能无法可靠地标记成像过程中用于组织定位的结构标志物。例如，在免疫组织化学中，N-Cadherin 等蛋白质常用于显示发育中的神经毡结构，而其对应的转录本在 FISH 中则表现出更广泛且更弥散的定位模式。因此，当需要额外的结构信息时，将 HCR-FISH 与 HCR 兼容的免疫组织化学（HCR-IHC）相结合，可改善解剖学上的判读20。

另一个局限性在于，同一细胞内表达的转录本可能定位于不同的亚细胞区域。因此，转录本信号的重叠并不总能精确定义细胞身份或细胞边界。尽管HCR-FISH能够有效识别基因表达的空间区域，但仍可能需要结合其他方法来确认特定的细胞类型。将HCR-FISH与GFP报告基因品系、靶向GFP的探针、针对GFP的HCR-IHC或红外荧光核标记物联合使用，可提高定位精度并有助于细胞鉴定42。

总体而言，HCR-FISH 为研究神经发育过程中的基因表达提供了一种灵敏且多功能的方法 果蝇 视觉系统。除了绘制神经元出生位置图谱外，未来应用还可实现对同工型特异性表达模式的分析、mRNA剪接动态的可视化以及成像 蛋白质翻译上游的转录调控。结合现有的遗传学和成像技术，HCR-FISH 为研究发育中大脑内调控神经元特化和神经环路组装的分子机制提供了一个强大的平台。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢Claude Desplan提供了Molecular Instruments的HCR-FISH探针以及dpp-GAL4; UAS-Stinger果蝇品系。作者还感谢Molecular Instruments的Aneesh Acharya和Harry Choi在HCR-FISH技术实施方面提供的技术反馈和讨论。本实验方案改编自此前已发表和未发表的HCR-FISH方法，这些方法由Meg Younger22、Hunter Whitbeck、Bogdan Sieriebriennikov、Amanda Araujo Gomes Ferreira、Yen-Chung Chen和Yanqiqi Zeng开发。Bogdan Sieriebriennikov得到了人类前沿科学计划（HFSP，项目编号LT000010/2020-L）的支持。Jennifer Malin得到了美国国立卫生研究院（NIH）R00资助项目EY032269的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% Tween-200伯乐生命科学公司1662404NA
20x PBS，pH 7.4Growcells.comMRGF-63962.74 M NaCl，53.7 mM KCl，20.3 mM Na2HPO4，29.4 mM KH2PO4 
20x SSC高质量生物学351-003-1313M NaCl，0.3M 柠檬酸钠
37 °C孵箱Fisher Scientific（Isotemp）15-015-2633NA
37 °C 水浴Fisher ScientificFSGPD15DNA
铝箔Reynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291NA
抗体：小鼠抗AbruptDSHB突然；RRID: AB_528344 稀释比例：1:20
抗体：鸡抗GFPMillipore Sigma目录号 06-896；RRID: AB-619712稀释比例：1:500
抗体：兔抗GFPLife Technologies#11122；RRID：AB_221569稀释比例：1:500
抗体：兔抗 DllGenscript/Desplan 实验室-稀释比例：1:200
抗体：大鼠抗NCadherinDSHBDN-Ex #8，RRID: AB_528121稀释比例：1:50
抗体：兔抗 SoxNGenscript/Desplan 实验室-稀释比例：1:200
抗体：豚鼠抗Traffic jamD. Godt 惠赠-稀释比例：1:2,000
抗体：驴抗大鼠 405杰克逊免疫研究实验室货号 # 712-475-150；RRID: AB_2340680稀释比例：1:100
抗体：驴抗鸡488杰克逊免疫研究实验室货号 #703-545-155；RRID: AB_2340375稀释比例：1:200
抗体：驴抗小鼠488杰克逊免疫研究公司货号 #715-545-151；RRID: AB_2341099稀释比例：1:200
抗体：驴抗兔 488杰克逊免疫研究实验室编号 #711-545-152；RRID: AB_2313584稀释比例：1:200
抗体：驴抗兔 A555赛默飞世尔科技目录号 #A-31572；RRID: AB_162543稀释比例：1:200
抗体：驴抗大鼠Cy3杰克逊免疫研究实验室货号 #712-165-153；RRID: AB_2340667稀释比例：1:200
抗体：驴抗豚鼠 647Jackson ImmunoResearch货号 #706-605-148；RRID: AB_2340476稀释比例：1:200
抗体：驴抗大鼠647杰克逊免疫研究实验室货号 #712-605-153；RRID: AB_2340694稀释比例：1:200
抗荧光淬灭封片剂赛默飞世尔科技S36940（SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂）其他慢速淬灭剂也可以使用，包括含 DAPI (S36936) 的淬灭剂
共聚焦显微镜ZeissLSM-880NA
盖玻片（22 × 30）VWR16004-332NA
果蝇：黑腹果蝇：ab-GFP-FLAGBDSC38626；RRID：BDSC_38626NA
果蝇：黑腹果蝇：Canton SBDSC64349；RRID：BDSC_64349NA
果蝇：黑腹果蝇：dpp-Gal4BDSC1553；RRID：BDSC_1553NA
果蝇：黑腹果蝇：ham-GFP.FPTBBDSC83660；RRID：BDSC_83660NA
果蝇：D. melanogaster：yw；10xUAS-myr-GFP；BDSC32198；RRID：BDSC_32198NA
果蝇：黑腹果蝇：UAS-StingerBDSC84277；RRID：BDSC_84277NA
果蝇：黑腹果蝇  wit-KO-Gal4BDSC600136；RRID：BDSC_600136NA
镊子Dumont#5 或 #55sNA
载玻片VWR16005-106NA
甘氨酸Millipore SigmaG7126-10MGNA
HCR 扩增缓冲液分子仪器HCR Gold RNA-FISH 试剂盒NA
HCR-Gold 放大器分子仪器HCR Gold RNA-FISH 试剂盒NA
HCR HiFi 探针分子仪器HCR Gold RNA-FISH 试剂盒NA
HCR探针杂交缓冲液分子仪器HCR Gold RNA-FISH 试剂盒含有甲酰胺
HCR探针洗涤缓冲液分子工具HCR Gold RNA-FISH 试剂盒含有甲酰胺
指甲油（透明）电子显微镜科学公司72180NA
无核酸酶水（非DEPC处理）赛默飞世尔科技AM9937NA
摆动式混合器康宁/费舍尔科学公司10-320-100NA
多聚甲醛，16%（w/v）电子显微镜科学公司15710有毒的
PCR仪/热循环仪Bio-Rad1851148（C1000 Touch Thermal Cycler）NA
0.2 mL 带圆顶盖条的 PCR 分离管条 USA Scientific#1402-2400NA
培养皿（150 × 15 mm；用于制作解剖用培养皿）Fisher ScientificFB0875714NA
RNase ZAP赛默飞世尔科技AM9780NA
间隔片贴纸SUNJinIS016（iSpacer贴片（0.2 mm深））NA
Sylgard 弹性体试剂盒（用于制作解剖皿）Fisher ScientificNC9285739NA
Triton X-100默克密理博西格玛X100NA

参考文献

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