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一种基于实时成像的共培养检测方法，用于量化患者来源肿瘤类器官中肿瘤浸润淋巴细胞介导的凋亡性杀伤

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DOI：

10.3791/71688

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2026年9月3日

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1Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell Medicine, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine, 4Department of Systems and Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine

本文内容

摘要

本方案提供了一种基于图像的活细胞成像方法，用于量化肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）对患者来源的肿瘤类器官的细胞毒性作用，从而实现对细胞凋亡的实时动力学分析，以进行功能性免疫谱型分析及免疫调节疗法的评估。

摘要

了解肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）识别和清除自体肿瘤细胞的功能能力，对于推进个体化免疫治疗至关重要。本方法旨在提供一种基于图像的活细胞成像方案，用于实时测量TIL介导的、依赖caspase-3的细胞凋亡性杀伤作用，靶向患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）。该方法结合了PDTOs和TILs分离与扩增的成熟技术，采用标准化的三维共培养系统以及基于荧光的自动化凋亡检测手段。

将肿瘤类器官接种于适用于成像的96孔板中，并用红色肿瘤标记物标记，同时在含caspase-3激活的绿色荧光底物的条件下，按设定的效应细胞与靶细胞比例加入扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。利用活细胞分析系统每4小时对共培养物进行一次成像，同步采集明场及双荧光通道图像。通过定量图像分析识别红色阳性肿瘤结构，并随时间推移计算红色/绿色双阳性凋亡肿瘤对象所占比例。实验中纳入适当的技术重复与生物学重复，同时设置基线对照、自发性凋亡对照、阴性杀伤对照和阳性杀伤对照，以确保检测的严谨性。

通过在PDTO的三维结构中保持肿瘤异质性，同时实现长期定量，该方案提供了一个生理相关性较强的系统，可用于对患者特异性的肿瘤-肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）相互作用进行功能分析，并研究可增强抗肿瘤免疫的免疫调节剂。

引言

免疫检查点抑制剂（ICIs）靶向程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）通路以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）通路，已显著推动了癌症免疫治疗的发展，能够重新激活多种实体瘤中内源性T细胞介导的抗肿瘤反应1,2,3。尽管部分患者可获得持久疗效，但大多数患者并未实现有临床意义的治疗获益，目前仍缺乏经过验证的预测性生物标志物以前瞻性地识别应答者。因此，能够直接测量T细胞介导的肿瘤杀伤功能的实验方法，对于发现生物标志物以及评估旨在增强细胞毒性免疫反应的联合治疗方案的临床前研究至关重要。

传统的细胞毒性检测方法，包括铬-51释放法、乳酸脱氢酶（LDH）定量法以及基于发光的ATP活力检测法（如CellTiter-Glo），已被广泛用于量化免疫介导的杀伤作用，但这些方法仅能提供单时间点、整体性的测量结果，缺乏空间和时间上的分辨率4,5,6。类似地，基于终点流式细胞术的杀伤检测法也只能在固定时间点量化细胞死亡，且难以适用于三维培养体系。此外，这些检测中广泛使用的二维肿瘤细胞系并不能完全模拟原发性患者肿瘤所固有的异质性。

患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）已成为一种具有临床相关性的体外实验平台，相较于传统的细胞系模型，它能更真实地保留原始肿瘤的基因组变异、细胞异质性以及药物反应表型。7,8,9,10,11,12近期研究表明，PDTO 可与自体免疫细胞共培养，以模拟抗肿瘤免疫反应 离体然而，大多数已发表的方法依赖于终点活力检测或耗时的共聚焦成像分析，这限制了实验通量，并阻碍了对杀伤反应的动态监测13,14,15,16.

本文介绍了一种基于实时成像的共培养检测方法，用于对T细胞介导的针对荧光标记患者来源类器官（PDTO）的细胞毒性作用进行定量、基于图像的分析。该方法结合时间序列荧光显微成像与一种可被caspase-3激活的荧光底物，在12–36小时的观察窗口内，以单个类器官分辨水平生成动力学凋亡曲线。与传统的细胞毒性检测方法相比，该平台具有多项技术优势：在整个检测过程中保持肿瘤的三维结构完整性，解析凋亡诱导的时间动态过程，支持设定明确的效应细胞与靶细胞比例，并具备未来应用于中通量药物筛选的潜力，包括单独或联合测试免疫检查点抑制剂和靶向药物。本实验方案适用于从事肿瘤免疫学、功能精准医学及T细胞生物学研究的研究人员，可在配备标准组织培养设施和活细胞荧光成像系统的实验室中实施。

从人肿瘤标本中分离和培养患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）及配对的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是已建立且广泛发表的方法。已有稳健的实验方案描述了肿瘤组织的机械与酶解离解、在基底膜基质中进行三维包埋、类器官的长期扩增，以及平行的TIL分离与 离体 TIL的扩增已在多种肿瘤类型中得到广泛验证。这些方法能够可靠地保留肿瘤细胞的异质性、结构特征及免疫特异性，并已被应用于共培养系统以评估肿瘤-免疫相互作用。因此，本研究中类器官及TIL的分离与扩增均依据先前已发表并验证的方案进行，除非另有说明，未作实质性修改。

方案

所有涉及人类肿瘤组织和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的操作均依照机构审查委员会（IRB#1305013903）的批准及机构生物安全规定进行，并在获取组织前取得书面知情同意。批准机构为康奈尔大学医学院机构审查委员会（即 Institutional Review Board (IRB), Weill Cornell Medicine, New York, NY），批准方案编号为 #1305013903。本方案涵盖的标本包括：在常规病理学评估后，从标准临床手术或研究性操作中剩余的肿瘤组织；来自康奈尔大学医学院或其他机构的现存归档冷冻组织或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织；血液（用于分离和储存外周血单个核细胞（PBMCs）、血清和血浆）；在某些情况下用作对照的口腔拭子、唾液、尿液或良性组织；以及参与快速尸检项目（Rapid Autopsy Program）的受试者在死亡后6小时（最长至24小时）内完成尸检所采集的组织。本研究中使用的TILs系由上述肿瘤组织标本扩增而来。所有生物标本均去除了个人身份信息，仅通过唯一的患者识别编号与受试者身份关联，符合《健康保险可携性和责任法案》（HIPAA）及机构标准；数据仅在生成报告时重新识别。所有实验均在经认证的II级生物安全柜内，按照生物安全二级（BSL-2）条件进行。有害生物材料根据机构政策进行处置。有关本研究中所用试剂、缓冲液和培养基的详细信息，请参见材料表和补充文件1。

1. 患者来源肿瘤类器官（PDTOs）的荧光标记与重建（图1）

  1. 去除旧的 Matrigel 并启动细胞解离。
    1. 将培养板放入生物安全柜中。小心吸除孔中的培养基，避免扰动 Matrigel 液滴。
    2. 每孔加入 1–2 mL 室温的细胞解离酶。使用 P1000 移液器反复吹打，并配合无菌细胞刮刀彻底打散 Matrigel 液滴。
    3. 将细胞混合物转移至已标记的 15 mL 圆锥形离心管中。每孔再加入 1 mL 细胞解离酶冲洗残留细胞，并将洗液转移至同一离心管中。调整总体积，确保每孔至少收集 5 mL 酶液。盖紧管盖并手动振荡，充分混匀。
  2. 酶解解离
    1. 将离心管置于 37 °C 水浴中，孵育 10 分钟，每隔 2–3 分钟手动振荡一次，以促进解离。通过肉眼观察判断是否完全解聚。
    2. 解离完成后，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 3 分钟。离心后检查离心管内情况。
    3. 若未形成沉淀且 Matrigel 仍呈浑浊状态，可补充添加细胞解离酶，轻轻摇动后放回水浴中继续孵育 3–5 分钟。若仍未形成沉淀，将离心管置于冰上 3 分钟，使基质沉降。
  3. 细胞计数与活力评估
    1. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。每管加入 10 mL 的 +++ 洗涤培养基。
    2. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 3 分钟。将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，轻柔吹打以获得单细胞悬液。
    3. 取 15 µL 细胞悬液与 15 µL 0.4% 台盼蓝混合。每片计数板的每个计数室加载 10 µL 混合液。使用自动细胞计数仪或血球计数板计数活细胞。
    4. 计数过程中保持细胞置于冰上。将 6 孔非组织培养处理板置于 37 °C 预热，用于后续接种。
  4. 肿瘤细胞的荧光标记
    1. 用 PBS 将细胞浓度调整至 1 × 106 个活细胞/mL。
    2. 用 20 µL DMSO 重悬 CellTrace Far Red 染料，配制 1 mM 储存液。涡旋混匀后短暂离心。
    3. 每 1 mL 细胞悬液（含 1 × 106 个细胞/mL）加入 1 µL 1 mM 储存液，终浓度为 1 µM。轻柔颠倒混匀，37 °C 避光孵育 30 分钟。
    4. 加入 5 倍体积的 PBS 洗去染料。在 300 × g 条件下离心 5 分钟。用 PBS 洗涤两次。
    5. 评估标记效率。细胞沉淀呈现明显颜色可作为定性接受标准。
    6. 通过台盼蓝排斥法测定染色后细胞活力，并记录观察到的活力值（80%）。
      ​注意：仅当细胞沉淀颜色均匀且染色后细胞活力 ≥80% 时，方可将细胞推进至包埋步骤。
  5. 构建三维细胞基质悬液
    1. 根据沉淀体积，用适量的特定培养基重悬细胞沉淀（例如，对于 900,000 个细胞，加入 500 µL 培养基；对于 180 万个细胞，加入 1,000 µL 培养基）。
    2. 按 1:2 的比例（培养基:基质）加入预冷的 Matrigel，使 Matrigel 终浓度为 67%。轻柔而充分地混匀，避免产生气泡（典型目标：每孔 6 孔板含 300,000 个细胞）。
  6. 接种三维基质液滴
    1. 使用 200 µL 移液器，每孔接种 5 个 100 µL 液滴（6 孔板每孔 5 滴）。将培养板放入 37 °C 培养箱孵育 5 分钟。
    2. 将培养板倒置，继续孵育 40 分钟以完成聚合。通过显微镜确认细胞是否成功包埋。
    3. 每孔（6 孔板）加入 4 mL 培养基，将培养板放回培养箱。培养 72 小时，以形成直径 100–300 µm 的类器官。

2. 杀伤实验用类器官的制备

  1. 在保持三维类器官结构的同时溶解基底膜基质。
    1. 将类器官培养板从培养箱中取出，转移至生物安全柜中。小心吸除每孔中的培养基，避免扰动 Matrigel 凝胶滴。
      注意：指定并保留一个孔不处理，用于后续完全解离及肿瘤细胞计数（见第2.2节）。
    2. 向每孔直接加入1 mL 冰冷的细胞回收溶液，以溶解基底膜基质。使用 P1000 移液器和无菌细胞刮刀机械性破坏凝胶滴，直至基质完全从培养板表面脱离。
    3. 将最多三个孔的悬液转移至预标记的、置于冰上的15 mL 圆底离心管中。向管中再加入8 mL 冰冷的细胞回收溶液。将离心管水平放置于4 °C 摇床上孵育30分钟，以确保基质完全溶解。
      注意：若已进行荧光标记，需避免光照。
    4. 孵育后，在4 °C 下以300 × g 离心3分钟。小心彻底吸除上清液，避免扰动类器官沉淀。
    5. 使用完全PDTO培养基，采用缓慢、宽口移液器轻柔重悬沉淀，以维持完整的三维类器官结构。
      关键步骤：避免过度移液或涡旋，以免破坏三维结构。
      若离心后仍可见残留基质，使用冰冷的细胞回收溶液再次孵育10–15分钟。重新离心并评估溶解情况。
  2. 确定活肿瘤细胞数量并调整类器官悬液浓度。
    1. 使用细胞解离酶对保留的孔进行完全解离，操作如第1节所述。在37 °C 下孵育5–7分钟，期间间歇性吹打。
    2. 使用完全PDTO培养基中和反应。在300 × g 下离心5分钟。用1 mL 培养基重悬细胞。
    3. 将15 µL 细胞悬液与15 µL 0.4% 台盼蓝混合。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞数。
    4. 根据活细胞计数结果，计算所需稀释倍数，使完全PDTO培养基中的活细胞浓度达到200,000 个/mL。
      注意：示例计算：若每孔100 µL 中需接种20,000 个肿瘤细胞，则工作浓度需为200,000 个/mL。若接种整块96孔成像板（内侧60孔），总实验体积为6 mL（100 µL × 60孔），但考虑到20%的死体积，需准备7.2 mL。因此所需细胞总数为6 mL × 200,000 个/mL = 1.2 × 106 个细胞，或7.2 mL × 200,000 个/mL = 1.44 × 106 个细胞。
  3. 接种类器官用于杀伤实验
    ​注意：使用黑色侧壁、透明底的96孔成像板。每个实验条件至少设置三个技术重复。
    1. 使用多通道移液器，每孔加入100 µL 类器官悬液，使每孔含有20,000 个活肿瘤细胞。
    2. 向培养板最外周的孔中加入200 µL 无菌PBS，以减少蒸发和边缘效应。
    3. 在显微镜下观察确认分布均匀。
    4. 在加入T细胞前，将类器官在37 °C 下静置10–30分钟使其沉降。
  4. 维持类器官的持续扩增。
    1. 取细胞计数过程中获得的单细胞悬液。将细胞重悬于特定培养基中。加入预冷的Matrigel，使其终浓度为67%。
    2. 以每孔100,000 个细胞接种至预热的6孔悬浮培养板中。按第1节所述进行凝胶聚合并覆盖培养基。放回培养箱继续扩增。

3. 肿瘤反应性T细胞的制备

  1. 扩增和收集肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）
    1. 使用先前建立的方案从肿瘤标本中分离并扩增TILs13,14。
    2. 记录每批TIL制备物的以下特征：扩增后存活率：≥80%（台盼蓝排斥法）；CD3⁺纯度：≥85%；CD4⁺/CD8⁺分布：CD8⁺ T细胞占比≥30%，并记录CD4:CD8比值；扩增时间及培养条件：在无饲养细胞条件下，于含10%人AB血清和重组人IL-2（600 IU/mL）的完全RPMI-1640培养基中培养10–14天；活化/耗竭表型：检测时CD3⁺细胞中PD-1 ≤ 50%、TIM-3 ≤ 30%、LAG-3 ≤ 20%；刺激后可检测到活化标志物（如CD69或CD25）；具有肿瘤反应性的证据：至少通过一种功能检测方法测得抗原特异性活性（如IFN-γ分泌增加、CD137/4-1BB上调、CD107a脱颗粒或对自体肿瘤细胞的细胞毒性）。
    3. 确认每个PDTO仅与其自体TIL制备物共培养。
      注：优先采用无饲养细胞的扩增策略，以保留CD8+细胞毒性细胞群。使用经辐照的饲养PBMC的方案可能导致扩增偏向CD4+ T细胞。无饲养细胞系统更有利于维持CD8+ T细胞比例。
      将TIL扩增时间限制在最多14天内，以避免出现耗竭表型及细胞毒性功能丧失。
    4. 在检测当天，从培养瓶中收集T细胞，转移至15 mL圆锥形离心管中，在室温下以300 × g离心3分钟，彻底吸除上清液。
  2. 为功能检测准备T细胞。
    1. 将步骤3.1.4所得细胞沉淀重悬于1 mL基础T细胞培养基（RPMI 1640 + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素）中。
      注：确保培养基中不含IL-2、IL-15、其他细胞因子、抗CD3/CD28磁珠或饲养细胞。
      ​关键点：残留的细胞因子或活化磁珠会人为增强细胞毒性，干扰检测结果解读。
    2. 使用台盼蓝测定细胞浓度和存活率。仅当存活率≥80%时方可继续实验。
  3. 准备效应细胞与靶细胞比例（E:T比）。
    1. 定义E:T比为T细胞:肿瘤细胞。
      注：用于计算E:T比的肿瘤细胞数量是根据平行处理的完全解离参考孔（第2.2节）估算得出。由于类器官是以完整的三维结构接种，在不破坏实验的前提下，无法直接测定各个共培养孔内的肿瘤细胞数量。因此，将参考孔获得的估算肿瘤细胞浓度统一应用于来自同一批类器官悬液的所有孔。
      1. 对于每孔20,000个肿瘤细胞、E:T比为2:1的情况，每孔加入40,000个T细胞。将T细胞配制成400,000个细胞/mL，每孔加100 µL；即400,000个细胞/mL × 0.1 mL = 40,000个细胞。
      2. 若接种整块96孔成像板（内侧60个孔），所需T细胞体积为6 mL，考虑20%死体积，实际T细胞体积为7.2 mL。
        所需T细胞数：6 mL × 400,000个细胞/mL = 2.4 × 106个细胞
        7.2 mL × 400,000个细胞/mL = 2.88 × 106个细胞
        注：估算的E:T比受三维类器官培养固有变异性的影响，包括类器官大小差异（通常直径为100–300 µm）、Matrigel溶解和洗涤过程中的细胞损失（第2.1节），以及板制备过程中微量移液和细胞沉降的微小差异。
        ​为最小化变异性，每种条件至少设置三个技术重复，使用宽口移液吸头并轻柔重悬以保持类器官完整性，并在加入T细胞前（第2.3节）通过肉眼确认各孔中类器官分布均匀。
  4. 准备caspase-3检测试剂。
    1. 使用caspase-3底物；将储存浓度为200 µM的底物直接加入T细胞悬液中，配制成终浓度为2 µM的工作液，轻轻混匀。
      注：全程避光操作。
  5. 可选步骤：药物筛选或免疫调节研究
    ​注：本检测可适用于评估小分子抑制剂（如激酶抑制剂、代谢调节剂）、免疫检查点抑制剂（如抗PD-1、抗PD-L1）以及联合治疗方案。
    1. 在基质解离和加入T细胞前24–72小时预先将药物与类器官共孵育，或在加入T细胞的同时加入药物。
    2. 每种条件均需设置仅含溶剂的对照组。
    3. 若测试免疫检查点抑制剂，应在检测前确认类器官表达靶标（如PD-L1）且T细胞表达PD-1。

4. 建立共培养体系及实验对照。

  1. 共培养体系建立
    1. 从培养箱中取出已接种类器官的96孔成像板，转移至生物安全柜中。在接种前立即轻轻重悬已制备的T细胞悬液（第3节），以确保细胞均匀分布（图2A）。
    2. 使用多通道移液器，向每孔含有100 µL类器官的孔中加入100 µL T细胞悬液（含2 µM的caspase底物）。加样后，轻轻敲击培养板2–3次，以确保细胞均匀分布。
      注意：避免触碰孔底，以防破坏类器官结构。切勿在孔内反复吹打。过度震荡会破坏类器官完整性，并改变T细胞浸润动力学。
    3. 立即将培养板转移至活细胞成像系统，以尽量减少温度波动。
      ​注意：1:1混合后的终孔浓度：将100 µL类器官悬液（在完全类器官培养基中）与100 µL T细胞悬液（在基础T细胞培养基中）混合后，各组分浓度减半。终浓度如下：B27添加剂 0.5X；烟酰胺 5 mM；谷氨酰胺替代物 0.5X；青霉素/链霉素 50 U/mL / 50 µg/mL；HEPES 5 mM；N-乙酰半胱氨酸 0.625 mM；Primocin 50 µg/mL；碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）0.5 ng/mL；FGF-10 10 ng/mL；PGE2 0.5 µM；SB202190 5 µM；EGF 25 ng/mL；Y-27632 5 µM；A-83-01 250 nM；NRG1 5 ng/mL；Noggin和R-Spondin 各5% v/v；FBS（来自T细胞培养基）5%；caspase-3底物终浓度为1 µM（孔内）。
      1. 在活细胞成像软件中配置动力学采集参数，选择定时扫描以实现整个实验周期内的重复成像（图3B），选择标准扫描模式以兼容相差与荧光成像（图3C），并指定以10×物镜采集相差、绿色和红色通道图像，各通道采集时间优化设置（图3D）。
      2. 将绿色和红色通道的荧光采集（曝光）时间设置为约300–400 ms，并确认已选择10×物镜（10×下图像校准为1.24 µm/px）。
        注意：代表性数据集在所引用的活细胞分析系统上采集（见材料表）。图像分析使用Basic Analyzer软件及已保存的分析定义（命名为red-green-overlap-Bladder）完成。
      3. 设置每个96孔板内孔采集4幅图像，每2小时重复扫描一次，持续最长36小时（图3A、E）。
      4. 通过创建新的分析定义并启用相差、绿色和红色通道开始图像分析（图4A、B）。
      5. 优化红色通道的分割参数，包括面积阈值和边缘排除滤波器，以将肿瘤对象与碎片及双联体区分开（图4C）。
      6. 对于红色通道（肿瘤，CellTrace Far Red），将分割类型设为表面拟合，阈值为2.0 RCU；启用边缘分割，边缘敏感度 = 0；设置孔洞填充 = 0 µm2 和 调整大小 = 0 像素；并应用最小对象面积滤波器为50 µm2（不设最大面积、偏心率或强度滤波器）。
      7. 对于绿色通道（NucView 488 caspase-3/7），设置分割类型为表面拟合，阈值为2.0 GCU；启用边缘分割，边缘敏感度 = 0；设置孔洞填充 = 0 µm2 和 调整大小 = 0 像素；不应用面积或强度滤波器。
      8. 将凋亡肿瘤信号定义为绿色与红色双阳性对象。对重叠区域不施加额外的面积或强度滤波。通过自发凋亡组和阳性杀伤对照孔验证重叠标准，然后将该分析定义统一应用于所有孔。
      9. 为两个通道配置分析指标，以量化红色/绿色双阳性凋亡对象的比例；检查分割叠加图像，确认肿瘤对象识别准确（图4D）。
      10. 选择覆盖所有实验时间点的扫描时间和孔位（图4E），并确认已完成的分析可被查看，并支持表格或图形数据导出（图4F、G）。
      11. 导出各时间点的单个对象水平及每孔分析数据，用于后续定量分析。

结果

用于展示本实验结果的肿瘤类器官培养物已建立并传代超过第5代，且以每管1 × 106个细胞的密度冻存于6个以上的冻存管中；每次实验均从解冻后重新扩增的培养物中进行。通过靶向测序确认了其恶性上皮特性，并排除了正常上皮或间质细胞过度生长的可能，测序结果显示保留了亲本肿瘤中的体细胞突变；同时通过组织学包埋分析证实类器官形态与原始肿瘤病理特征一致。所有细胞系在使用前均确认无支原体污染。对于呈现正常上皮形态或未能保留亲本肿瘤分子特征的培养物，均已识别并剔除，从而最大限度地减少非肿瘤成分对实验的污染。

所有结果（图1、图2、图3、图4 和 图5）均来自一位肺腺癌患者的一对匹配的类器官-肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。肿瘤标本取自未接受过新辅助治疗的手术切除组织，类器官使用第21代。类器官自初次分离至进行本实验（第21代）期间在体外培养维持约12周。肿瘤切除日期属于受保护的健康信息，因此不予报告。

重扩增后，收集并计数PDTO，随后接种至96孔成像板中。与此同时，将TIL以2:1的效应细胞与靶细胞比例进行准备，并在共培养体系建立前立即加入NucView 488 caspase-3底物（图2A）。单个孔在中间时间点的代表性图像显示了预期的四通道输出结果：相位对比图像确认类器官和免疫细胞的存在（图2B）；绿色荧光标识caspase-3激活的凋亡信号（图2C）；红色荧光特异性标记CellTrace Far Red标记的肿瘤类器官（图2D）；合并叠加图像则显示出红/绿双阳性凋亡肿瘤结构，即本检测的主要读出指标（图2E）。在无TIL介导杀伤的情况下，红阳性结构内仅出现微弱的自发绿色信号属正常现象。定量分析时，将红/绿双阳性（凋亡）类器官表示为凋亡PDTO的百分比，并以均值±标准误（SEM）形式随时间绘制曲线，同时通过分割叠加图像验证肿瘤结构识别的准确性（图4D）。

在一项代表性实验中，以1 µM浓度测试了六种小分子，结果显示从约24小时开始，药物4和药物5诱导的凋亡水平显著高于对照组（图5A；** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）；该比较基于单次代表性实验。在36小时时间点的小提琴图提供了各重复样本中反应分布的补充视图，显示在此代表性实验中，药物4和药物5导致PDTOs凋亡比例的增幅最大，而药物3则表现出轻微降低的杀伤效应，这与可能存在的免疫抑制活性一致（图5B）。

为了确认所检测到的细胞凋亡反映的是肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）依赖性杀伤作用，而非药物直接细胞毒性或效应细胞来源信号，选择了一种代表性化合物（Drug 5），在三个平行组中进行了评估：共培养组（TIL + 类器官）、仅类器官组（无TIL）和仅T细胞组，检测时间为36小时（图5C）。

共培养组显示出进行性、时间依赖性的凋亡PDTO累积，在36小时时达到19.2 ± 1.0%（均值 ± 标准误，n = 6孔），而仅类器官组（无TIL）在整个过程中保持较低水平，在36小时时仅上升至4.0 ± 0.3%（n = 3孔），信号强度低4.8倍。T细胞单独对照组在整个时间过程中维持在基线水平（0.0%；n = 3孔），这与仅有肿瘤类器官被荧光标记的结果一致，证实检测信号并非来源于效应细胞。上述各组共同确定了超出肿瘤单独基线水平的净TIL依赖性凋亡杀伤效应。由于仅类器官组是在药物存在下检测的，因此它也作为药物加肿瘤（无TIL）对照：在药物存在但无TIL的情况下，凋亡水平仍保持较低（36小时时为4.0 ± 0.3%），表明共培养组中升高的杀伤作用不能归因于该化合物对类器官的直接细胞毒性。仅针对药物5设置了匹配的单独药物组；对于其余化合物，因此将升高的凋亡描述为一种联合效应，尚无法明确归因于免疫增强作用，且已确定每种化合物均需进行单独药物对照实验作为必要的验证步骤。

本研究的所有支持数据均可无限制获取。原始延时成像序列、对象层级导出文件、Incucyte 分析定义文件、分割参数设置、元数据以及图5的统计源数据均已存入公共数据库，并在开放许可下免费提供，doi: 10.5281/zenodo.21676769。用于生成图5的对象层级源数据、孔板图谱、分割设置和分析定义文件详见补充文件2。

类器官重建过程：示意图显示单细胞悬液、染色、在Matrigel滴中铺板。
图1：患者来源肿瘤类器官的荧光标记与三维重建。（A）PDTO制备流程示意图：将类器官从Matrigel中解离，消化为单细胞悬液，用CellTrace Far Red染料标记，重悬于Matrigel基质中，并以三维液滴形式铺板，共培养实验前培养72小时以实现再扩增。（B）15 mL离心管中已标记细胞沉淀的代表性照片，可见明显着色，表明CellTrace Far Red染色成功。（C）相差显微图像，显示培养72小时后重新扩增的肿瘤类器官所在的Matrigel液滴。（D）荧光叠加图像，显示红色标记的肿瘤类器官（CellTrace Far Red），证实共培养实验设置前类器官保持完整的三维形态且荧光标记均匀。图像采集放大倍数为10×。比例尺 = 800 µm（C）和400 µm（D）。缩写：PDTO = 患者来源肿瘤类器官。请点击此处查看该图的放大版本。

类器官-TIL 共培养实验流程图；NucView 488 染料；细胞凋亡检测；Incucyte 系统。
图 2。TIL 介导的肿瘤类器官杀伤的共培养实验流程及代表性荧光成像。 （A）完整的共培养实验流程示意图，显示两条平行的制备路径：（上路径）从 Matrigel 中回收类器官，计数并接种至 96 孔成像板；（下路径）TIL 扩增、重悬，并加入 caspase-3 底物。两条路径最终汇合于 96 孔板中的共培养体系，随后将板放入活细胞成像系统，进行动力学数据采集和自动分析。来自共培养孔的代表性图像为单一时间点采集结果：（B）相差图像，（C）绿色荧光通道，显示凋亡细胞中 caspase-3 激活的 NucView 488 信号，（D）红色荧光通道，显示 CellTrace Far Red 标记的肿瘤类器官，（E）荧光叠加图像，显示红色/绿色双阳性凋亡肿瘤结构。图像采集放大倍数为 10×。比例尺 = 400 µm。缩写：TIL = 肿瘤浸润性淋巴细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

自动扫描配置；设置界面；数据采集；成像分析；软件指南
图3活细胞成像的仪器扫描设置与采集参数配置 (A) 仪器调度仪表板，显示正在进行的扫描及其孔板图和扫描参数，包括容器类型、成像通道、物镜、扫描时长和采集时间表。B) 反复扫描还是一次扫描？ 与……对话 按时扫描 用于在完整检测期间实现纵向动力学成像。C扫描类型选择面板 标准 选择的模式，支持相衬和基于荧光的分析应用。D) 扫描设置 指定图像通道（相位、绿色、红色）、各通道采集时间以及10×物镜选择的面板。E扫描模式面板，显示为96孔板内圈孔的选择，每孔配置四幅图像，并附有预计扫描时长。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图像分析软件工作流程；显微镜图像设置；数据扫描/整合；教学示意图。
图4。使用集成软件的活细胞成像仪器设置及图像分析工作流程。（A）分析启动界面，显示选择创建新分析定义以启动新的分析流程。（B）图像通道选择面板，启用相位、绿色和红色通道以进行双荧光采集。（C）分析定义界面，显示红色通道的分割参数，包括最小和最大面积阈值、边缘排除以及用于识别肿瘤对象的碎片过滤器。（D）分析定义界面，显示绿色和红色通道配置的分析指标，并配有代表性分割叠加图，确认准确识别出红色/绿色双阳性凋亡肿瘤结构。（E）扫描时间与孔位选择界面，用于在96孔成像板的内圈孔中安排重复图像采集。（F）在图像文件下选择已完成的分析定义。（G）完成后的分析汇总视图，显示容器信息、分析类型、可用指标以及数据导出选项，包括微孔板图、图表和表格导出。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞凋亡药物反应图：时间过程、小提琴图分析、类器官药物测试、治疗效果。
图 5。小分子药物对TIL介导的肿瘤类器官杀伤作用的代表性分析。（A）动力学杀伤曲线，显示在多个小分子处理条件和溶剂对照组之间，随时间变化的凋亡PDTO百分比，以均值±标准误（SEM）表示。（B）小提琴图展示36小时终点分析，作为可视化不同处理条件下凋亡反应分布的另一种图形方法，便于在本代表性实验中对药物处理组与溶剂对照共培养组进行描述性比较。（C）代表性化合物（药物5）的TIL依赖性对照：在36小时时间过程中，共培养组（TIL + 类器官）、仅类器官组（无TIL）和仅T细胞组的凋亡PDTO百分比，证实凋亡信号依赖于TIL，而非来源于效应细胞（共培养n = 6孔；仅类器官和仅T细胞组n = 3孔；均值±SEM）。缩写：PDTO = 患者来源肿瘤类器官；TIL = 肿瘤浸润淋巴细胞；SEM = 均值标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：培养基与缓冲液的制备。请点击此处下载该文件。

补充文件2：图5的源数据和分析文件。 该ZIP文件夹包含用于生成图5化合物筛选实验及Drug 5对照分析的物体层级源数据、孔板图、分割设置以及分析定义文件。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了一种基于成像的活细胞成像方法，用于评估患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）与配对的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）之间的细胞毒性相互作用。通过整合三维肿瘤结构、自体免疫效应细胞以及实时caspase-3活化检测，该系统能够在生理相关条件下动态评估肿瘤细胞的凋亡过程。该工作流程结合了已建立的类器官和TIL扩增方法、受控的共培养条件以及自动化的基于图像的定量分析，为免疫功能研究提供了一种基于成像的研究手段。由于上游的PDTO和TIL分离与扩增步骤依据先前已发表的方案进行，而非在本方案中完整描述，因此要完整重现该流程，还需参考这些原始文献。

该方法的一个关键优势在于能够保留类器官内肿瘤固有的异质性。与二维单层培养系统不同，类器官可维持三维结构以及肿瘤细胞间的相互作用。当与匹配的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）共培养时，可实现对T细胞浸润、依赖细胞接触的杀伤作用以及随时间变化的动力学反应进行评估。通过使用caspase-3激活的荧光底物，能够直接测量细胞凋亡，而无需依赖汇合度降低或基于ATP的终点活力检测等间接替代指标。

多个关键参数决定了实验的成功。铺板时类器官的完整性至关重要；在初始肿瘤解离过程中过度消化或在共培养建立过程中过度机械破坏，可能导致类器官断裂，人为增加红色物体的计数，并影响凋亡计算结果。保持一致的类器官大小分布可提高分割准确性，并减少孔间差异。效应细胞与靶细胞（E:T）比例在重复实验中也必须准确维持，因为T细胞计数不准确或细胞聚集会引入杀伤动力学的变异性。在铺板前立即轻柔重悬细胞可最大程度减少此问题。在所示代表性数据集中仅评估了单一E:T比例（2:1），这与本实验室标准操作流程中确立的参数一致。根据已有的T细胞细胞毒性文献，通常预期更高的E:T比例会增强肿瘤杀伤效果，对该参数进行系统滴定仍是未来验证该平台的一个研究方向。分割参数的选择与验证是另一个关键步骤。最小和最大物体尺寸的阈值必须能够排除碎片，同时捕获完整的肿瘤结构；过于宽松的阈值会导致肿瘤计数偏高，而过于严格的阈值则会低估肿瘤负荷。红色与绿色信号重叠的判定标准必须通过自发性凋亡对照和阳性杀伤对照进行验证，并在所有孔中一致应用，以避免百分比凋亡计算中的偏差。

设置适当的对照组可增强结果的可解释性。仅含肿瘤细胞的孔用于建立红色荧光稳定性的基线，而肿瘤细胞加底物的对照组则用于量化与免疫活性无关的自发性凋亡。仅含T细胞的对照组用于确定因淋巴细胞死亡而产生的背景caspase信号。阳性凋亡对照组可确认底物的功能性，并验证分割阈值的合理性。当比较独立的肿瘤-肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）配对样本时，这些对照尤为重要，因为不同类器官系之间的基础凋亡率可能存在差异。

这种基于成像的平台相较于传统的细胞毒性检测方法（如铬释放试验或终点ATP法细胞活力测定）具有多项优势。实时成像能够对肿瘤-免疫相互作用进行连续、非破坏性的监测，从而精确解析免疫介导杀伤的动力学过程。与仅提供单个累积测量值且可能掩盖短暂或序贯性细胞毒事件的终点检测法不同，纵向成像可区分快速的早期细胞毒反应与延迟或渐进性凋亡。这种时间分辨率使得研究人员能够识别与T细胞活化或浸润相关的滞后阶段、杀伤高峰时段，以及可能反映T细胞耗竭或靶细胞耐受的平台期。对同一孔进行多次重复测量可减少样本间变异，并避免在多个时间点使用平行培养板。由于在每个时间间隔内可同时量化肿瘤负荷和凋亡转化情况，因此可实现动态归一化，相较于无法区分免疫杀伤与自发性细胞死亡的总体裂解检测，其准确性更高。综上所述，该方法相较于传统单时间点检测，能够提供更具生理相关性且更易于从机制层面解读的细胞毒功能评估结果。

然而，应考虑若干局限性。尽管患者来源的肿瘤类器官相较于传统的二维培养更能准确模拟原发肿瘤的结构，但其无法完全重建肿瘤微环境中的间质、血管或髓系组分。此外，10×放大倍数下的成像可满足纵向分析的通量需求，但可能无法分辨紧密堆积的类器官内部的单细胞相互作用。更高倍数的成像虽可提高空间分辨率，但会缩小视野范围并降低检测通量。本实验专门用于定量依赖caspase-3的肿瘤细胞凋亡性死亡。通过非caspase依赖机制（如坏死或坏死性凋亡）发生的T细胞介导的细胞毒性作用，无法被该检测方法识别，因此结果的解读需限定在本实验的检测范围内。此外，单细胞解离、标记及72小时再扩增过程在理论上可能筛选出特定亚群；然而，在此期间重新形成的100–300 µm结构仍保留了亲本类器官的多细胞三维结构，且相对于亲本培养物未观察到明显的形态学改变，尽管尚未对再扩增前后克隆组成的正式比较进行评估。本研究未包含药理学阳性对照基准，例如在PD-L1⁺/PD-1⁺类器官–肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）配对体系中使用免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体）以预期增强杀伤效应，从而正式校准该检测的动态范围；引入此类参考性免疫增强剂是下一步重要的验证步骤，本文所报告的对比化合物结果应据此加以解读。在本示例中，仅对药物5设置了匹配的单药（无TIL）对照；因此，其他化合物所观察到的细胞死亡相对增强效应无法归因于其本身，因缺乏针对每种化合物的单独药物对照。本研究未对基于图像的检测结果进行正交、同一样本的验证，例如通过流式细胞术Annexin V染色或共聚焦显微镜单细胞确认等独立的细胞死亡金标准方法进行验证，该验证被视为下一步关键工作，以进一步确立红/绿双阳性信号检测的特异性17。

另一个需要考虑的因素是，随着肿瘤细胞每次分裂，CellTrace Far Red 荧光会逐渐被稀释。因此，在72小时类器官恢复期及随后的成像窗口期间发生的细胞增殖可能会降低后期时间点的荧光强度，从而可能减少可检测到的CellTrace阳性肿瘤细胞数量，并因分母减小而略微提高计算出的凋亡百分比。为了监测这一潜在的混杂因素，在整个成像期间纵向追踪了CellTrace Far Red阳性物体的数量，并评估各孔中红色阳性信号是否出现与凋亡相关caspase-3/7激活无关的显著下降。在成像期间未观察到CellTrace阳性物体出现明显且无法解释的减少，表明染料稀释不太可能是观察到的凋亡测量值变化的主要原因。然而，这仍是基于荧光稀释的肿瘤细胞追踪技术本身固有的局限性，在解读晚期时间点测量结果时应予以考虑。

患者来源样本之间的生物学变异性既是该检测平台的优势，也带来了挑战。尽管这种变异性反映了具有临床相关性的肿瘤异质性，但在确定研究规模和重复次数要求时，合理的实验设计应充分考虑生物学变异的影响。每个独特的肿瘤-肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）配对应被视为一个独立的生物学重复，而技术重复则用于评估单个样本内的检测变异。图 5 所示的代表性数据集反映了一个类器官-TIL 配对样本的技术性三重复分析；因此，所采用的双因素重复测量方差分析描述的是该单个样本内的检测变异，不应被解读为对患者间生物学变异性的评估。每项研究所需的独立类器官-TIL 配对数量，应基于预期效应大小、生物学变异程度及实验目标，通过前瞻性功效计算来确定。应包含技术重复以量化检测的精确度，但技术重复不可替代独立的生物学重复。

未来对该方案的改进可能引入免疫检查点阻断、细胞因子调节、小分子抑制剂或基因扰动，以解析调控T细胞介导的细胞毒性的机制。结合单细胞转录组学或空间成像技术可进一步增强对作用机制的理解。此外，适应高通量384孔板格式后，该平台可用于药物筛选应用。该体系还可便捷地用于评估嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法以替代多克隆肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），仅需在共培养前确认PDTOs上存在靶抗原表达，并适当加入抗原阴性类器官对照，以验证靶向特异性18,19,20。

综上所述，本方案提供了一种基于图像的定量方法，用于实时测量肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）对同源肿瘤类器官的细胞毒性作用。通过仔细关注类器官的完整性、保持效应细胞比例的一致性、验证分割阈值以及设置适当的对照，可确保定量结果的可靠性。该系统广泛适用于肿瘤免疫学研究、免疫检查点调控、过继性细胞治疗优化以及个体化功能性免疫谱分析。

披露

B.D.H. 是 Faeth Therapeutics 的联合创始人并担任该公司的顾问。O.E. 持有 Volastra Therapeutics 和 Owkin 的股权，但这些与本项目无关。Faeth Therapeutics、Volastra Therapeutics 和 Owkin 均未为本研究提供资金、材料、设备、软件、知识产权或研究设计方面的支持。其余作者声明不存在竞争利益。

人工智能使用声明：
在本作品的撰写过程中，作者使用了Claude进行语言编辑。在使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审阅和修改，并对已发表文章的内容承担全部责任。

致谢

我们衷心感谢威尔康奈尔医学院英格兰医学精准医学研究所提供的大力支持和机构资源的使用权限。本研究还得到了卓越医学基金会（The Medical Excellence Foundation, Inc.）MERIT项目捐赠（资助号# 61500857）的支持，该资助授予Olivier Elemento和Benjamin D. Hopkins。资助方在研究设计、数据收集、分析或稿件撰写过程中未发挥任何作用。分泌Noggin和R-Spondin的HEK293T生产细胞系由纪念斯隆-凯特琳癌症中心Yu Chen实验室慷慨惠赠，并按先前所述方法构建21。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管Corning430791细胞收集与离心
6孔非组织培养处理板Greiner Bio-One6571853D类器官铺板与扩增
A-83-01（TGF-β抑制剂）Tocris Bioscience2939完全类器官培养基
高级DMEM/F12赛默飞世尔科技12634010培养基组分
B27添加剂（50倍浓缩），无血清赛默飞世尔科技17504044完全类器官培养基
黑色壁96孔光学底微孔板，黑色，TC表面Nunc165305用于杀伤实验的活细胞成像板
细胞回收溶液Corning354253在保持三维类器官结构的前提下对Matrigel进行低温溶解
CellTrace 远红细胞增殖试剂盒赛默飞世尔科技C34564肿瘤细胞的荧光标记（红色通道）
II级生物安全柜赛默飞世尔科技1375（1300系列 A2，4英尺）生物安全二级（BSL-2）条件下的无菌操作
CO2 培养箱（37 °C，5% CO2，加湿的）赛默飞世尔科技51030400（Heracell VIOS 160i）类器官扩增与共培养孵育
Countess 3 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技（英坦科技）AMQAX2000自动细胞计数/活力检测（与 Countess 载玻片 C10312 一起使用）
Countess 细胞计数板（或血细胞计数板）赛默飞世尔科技C10312自动细胞计数
二甲基亚砜（DMSO），无菌Sigma-AldrichD2650细胞追踪深红染料的重悬
不含钙的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（PBS，1X）2+/毫克2+Corning21-040-CVR用于计数和染料标记的细胞重悬
胎牛血清（FBS），热灭活赛默飞世尔科技16140071培养基组分
GlutaMAX-I 补充剂（100倍浓缩）赛默飞世尔科技35050061培养基组分
GraphPad Prism (v10.6.1)GraphPad Software / Dotmatics版本 10.6.1统计分析（双向重复测量方差分析）与作图
分泌 Noggin 和 R-Spondin 的 HEK293T 生产细胞系Yu Chen 实验室，纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）Gift（参见 Gao 等，Cell 2014）条件培养基制备（第0.2节）；由陈昱实验室（MSKCC）惠赠；制备方法见Gao等，Cell 2014，DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.016
HEPES（1 M 溶液）赛默飞世尔科技15630080培养基组分
人重组 FGF-10赛默飞世尔科技PHG0204完全类器官培养基
人重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）赛默飞世尔科技PHG0261完全类器官培养基
Incucyte Base 软件（v2024B）赛多利斯集成软件 v2024B图像采集调度与自动分割/分析
Incucyte S3 活细胞分析系统Sartorius4647活细胞成像仪器（37 °C，5% CO₂）；相位与双荧光采集
倒置相差/荧光显微镜尼康Eclipse Ts2-FL类器官质量控制与可视化分割验证
实验室冰箱（−20 °C / −80 °C)赛默飞世尔科技TSX40086A（TSX 系列） −86 °C)生长因子与条件培养基样品的保存
实验室摇床 / 摇动平台4 °C 兼容的Benchmark ScientificB3D2300（BenchRocker 3D）在冰冷的细胞回收溶液中进行基质溶解（第 2.1 节）
基底膜基质（Matrigel），生长因子减量型康宁356231用于类器官包埋与扩增的3D基质
小鼠重组EGFPeproTech315-09完全类器官培养基
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165完全类器官培养基
烟酰胺Sigma-AldrichN0636完全类器官培养基
Noggin（条件培养基或重组蛋白）实验室制备的分装样本—完全类器官培养基
NRG1（神经调节蛋白-1 / 黑雷古林）R&D系统396-HB完全类器官培养基
NucView 488 Caspase-3 底物（200 µM 储备液Biotium30029实时检测caspase-3活化（细胞凋亡读数，绿色通道）
青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）赛默飞世尔科技15140122培养基组分
PGE2（前列腺素 E2）Sigma-AldrichP0409完全类器官培养基
PrimocinInvivoGenant-pm-1完全类器官培养基
冷藏离心机（摆桶式，300 × 克， 4 °C)Eppendorf022628187（离心机 5810 R，A-4-62 转子）解离与洗涤离心步骤
RPMI 1640 培养基赛默飞世尔科技11875093T细胞重悬用基础培养基
R-Spondin（条件培养基或重组蛋白）实验室制备的等分试样—完全类器官培养基
SB202190（p38 MAPK抑制剂）Sigma-AldrichS7076完全类器官培养基
StaurosporineSigma-AldrichS4400阳性杀伤对照；促凋亡剂，用于验证caspase底物功能
Stericup 无菌真空过滤系统0.22 µm)MilliporeSigma (Merck)S2GPU05RENoggin 和 R-Spondin 条件培养基的过滤/制备（第 0.2 节）
无菌细胞刮刀Corning3008Matrigel 圆顶的机械破坏
0.4% 台盼蓝溶液赛默飞世尔科技15250061通过染料排除法评估细胞活力
TrypLE Express 酶 (1X)赛默飞世尔科技12604021Matrigel 和类器官的酶解离
水浴锅37 °C)赛默飞世尔科技TSGP05（Precision GP 05）酶解离与培养基预热
Y-27632（ROCK 抑制剂）Sigma-AldrichY0503完全类器官培养基

参考文献

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