利用脱附电喷雾电离结合轨道阱质谱仪进行单细胞质谱成像

摘要

该方案描述了利用解吸电喷雾电离结合Orbitrap质谱仪对OVCAR-8细胞进行单细胞质谱成像，实现高空间分辨率代谢组分析。

摘要

脱附电喷雾电离质谱成像（DESI–MSI）使得环境下无基质分子成像成为可能，且样品准备量极少。该协议描述了利用DESI结合Orbitrap质谱仪，用于OVCAR-8单元单细胞MSI的工作流程。该系统集成了DESI喷雾器、改良质谱仪接口、电动XYZ级和用于高空间分辨率成像的光学面包板。细胞在格栅玻璃盖片上培养，用铵甲酸溶液清洗以减少盐分干扰，干燥后在环境条件下分析。溶剂通过纳米液相色谱系统连续输送，氮气雾化被调节以保持喷雾稳定性。该协议还描述了光栅成像、像素控制以及用于单单元定位的光学到质谱图像配准。Orbitrap检测提供的高质量分辨率和质量精度使得密切相关的分子物种能够区分，并支持单细胞代谢组分析。该协议为利用多个Orbitrap质谱仪平台实现高空间分辨率单胞体MSI提供了可适应的策略。

引言

代谢组学旨在全面表征反映^{生物系统功能}状态的低分子代谢物1,2,3,4,5。由于代谢物是酶活性的直接产物，它们能够动态地读取细胞表型和生化调控。然而，传统的代谢组工作流程通常依赖于批量提取方法，平均信号覆盖数千至数百万个细胞，从而掩盖了细胞异质性 ^6,7,8。

单细胞代谢组学通过实现单个细胞层面的分子剖析，揭示复杂群体中的代谢多样性，并提升对疾病进展、药物反应和细胞分化的机制理解，解决了这一局限。质谱（MS）是生物样本分子分析中不可或缺的工具。MS技术的最新进展，包括样本制备、仪器和数据分析，使得MS代谢组学研究能够在单细胞层面进行^，9,10,11,12。

MS成像（MSI）实现生物样品的空间分辨分子分析，通过在样品表面^12、13、14的每个定义空间坐标处获取完整的质谱，整合精确的样品运动、最小化采样、高效电离和数据可视化。MS图像通过绘制选定的质量-电荷比（m/z）值在x–y坐标上的强度来重建，从而保留复杂生物系统12,13,15,16,17,18的化学空间信息。实现空间分辨的单细胞代谢组学需要能够保持分子定位的分析平台，同时保持足够的灵敏度和质量分辨率以检测低丰度物种9,12,19,20。

单细胞MSI还面临额外挑战，因为单个电池直径通常在5到20微米之间。在这个空间尺度下，每次抽样事件分析物丰度极为有限。因此，包括样品运动的精确控制、最小化采样、高电离效率和高效离子传递等多种因素，对于从单个细胞获得可解读的分子信息同样至关重要^14,22。基质辅助激光脱附/电离（MALDI）-MSI是一种基于真空的技术，常用于高空间分辨率MSI研究，需要基质沉积和真空操作;然而，MALDI中的基质结晶可以在单细胞尺度23,24,25,26,27引入分析物离域和变异性。相比之下，环境MSI方法在环境条件下工作，样品保持近乎本来的化学状态，因为几乎不需要样品准备。在环境MSI方法中，DESI²⁸、纳米DESI²¹、气动辅助纳米DESI²⁹和单探针8,30,31,32,33,34,35，曾用于单细胞MSI研究。虽然基于微液体提取的技术，包括纳米DESI、气动辅助纳米DESI和单探针，提供了高采样和电离效率，但它们依赖于在采样探针尖端保持稳定的液体桥，而液体桥的扰动，如表面形态变化或探针堵塞，则可能影响MSI实验的质量^5,8， 21,30,35。

DESI是一种环境电离技术，带电溶剂液滴撞击表面，提取分析物，并生成含有电离物³⁶的次级液滴。DESI提供非接触、无堵塞采样，兼容基于栅格的成像工作流程，非常适合在高分辨率的Orbitrap平台20,37,38,39,40时，进行高分辨率多离子分子映射光学识别单细胞。DESI广泛用于组织成像，但由于技术难题，很少应用于单细胞MSI（^20,28）。近期使用商业设备（Waters DESI XS与SELECT SERIES循环IMS质谱仪）的研究证明，多个细胞系均可实现单细胞分辨率。在DESI–MSI中实现高空间分辨率需要协调控制电离效率、离子传输、采集速率和喷雾器对准^12、20、28。特别是新一代DESI喷雾器设计的进步，包括DESI XS和脱附电流聚焦电离（DEFFI），显著减少了采样面积^41,42。此外，降低溶剂流量，如纳米液相色谱（LC）泵提供的纳米升每分钟流量，可显著改善空间约束，实现单细胞分子界定²⁸。尽管该方法实现了单单元分辨率的MSI，但它依赖于特定厂商（Waters）的仪器。因此，单细胞DESI–MSI的更广泛实现需要能够与广泛可用的高分辨率质谱仪（如Orbitrap系统）集成的策略，以提供高灵敏度、质量精度和分辨能力。将DESI与Orbitrap质谱仪结合，为单细胞MSI研究提供了新机遇，包括在复杂细胞提取物^20、43、44中区分紧密间距和等压色物。

该协议描述了一种模块化策略，用于将Waters DESI XS喷雾器与Orbitrap质谱仪集成，用于单细胞MSI研究。该工作流程集成了网格覆盖套用于细胞附着和光学相关，电动XYZ级用于受控光栅扫描，纳米级溶剂输送以实现稳定喷雾形成，以及高分辨率轨道陷阱检测。虽然选择了Thermo Orbitrap Tribrid Lumos质谱仪作为平台，但许多其他配备兼容源接口几何形状的Orbitrap质谱仪型号，经过适当的机械调整和优化后，有可能与类似定制的DESI XS配置耦合。

方案

OVCAR-8细胞来自美国模式培养收藏（ATCC）。所有细胞培养程序均遵循机构生物安全指南执行。根据制造商的说明，细胞常规使用支原体检测试剂盒检测以检测菌体是否受污染。

注意：所有操作均遵循机构生物安全指南。请佩戴适当的个人防护装备。在化学排气柜中处理有机溶剂。

1. 培养并制备格栅盖片上的OVCAR-8细胞

1. 通过补充10%胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素，制备完整培养基。将介质加热到37°C。
2. 将OVCAR-8细胞保存在10厘米的细胞培养皿中，内含10毫升完整培养基。在37°C湿度加湿的培养箱中孵育_细胞，含5%二氧化碳。
3. 当约80%的培养表面被粘附细胞视觉覆盖时，通常每2天进行一次，且在所述培养条件下进行。
   1. 从10厘米培养皿中抽取培养基，并用5毫升含1×磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞一次。
   2. 向培养皿中加入2毫升0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸。在37°C下培养细胞约3分钟，或直到大多数细胞在显微镜下明显脱离培养表面。
   3. 在盘中加入8毫升预热的全培养基以中和胰蛋白酶。使用10毫升血清学移液器，轻柔地上下移液15–20次，以分散细胞。
   4. 将1毫升悬浮液转移到9毫升新鲜全培养基中。
   5. 使用自动细胞计数器计数细胞。将10微升的再悬浮电池悬浮液直接装入计数滑套，无需额外稀释，并按照制造商说明进行电池计数。
      注意：本方案未使用如锥蓝等细胞存活性染料。在胰蛋白酶化前通过监测细胞形态和附着体，目视评估细胞状况。
4. 把细胞种在封面上。
   1. 使用全培养基稀释细胞至最终浓度~1×10⁶ cells/mL。计算细胞悬浮所需的体积，使用 C₁V₁ = C₂V₂，其中 C₁ 是计数的细胞浓度，V₁ 是所需细胞悬浮液体积，C₂ 是目标浓度，V₂ 是期望的最终体积。
   2. 将单独的28毫米格栅玻璃盖片，间距为50微米，放入6孔板的孔中。
      注意：在用于细胞培养前，请对玻璃盖片进行高压灭菌处理。将网格侧朝下放置，以减少对细胞生长的干扰。
   3. 每孔加入2毫升全培养基和200微升细胞悬浮液（~2×10个⁵ 细胞/孔）。轻轻摇动6孔板呈“X”形，使电池均匀分布在盖片表面。
   4. 将细胞培养约15–20小时，以便细胞附着。
      注意：请定期使用显微镜监测细胞形态，以确保细胞正常生长。如果细胞生长不良，使用支原体检测试剂盒检查潜在的支原体污染情况。

2. 用铵甲酸钠（AF）溶液清洗细胞

注意：每次使用前都要准备新鲜的超自然液。

1. 使用前请立即准备等渗超速洗涤缓冲液。称重0.45克AF，溶解于50毫升LC/MS级水中，制备最终AF浓度0.14 M（0.9% w/w）。不要调整pH ^5,45。
   注意：当天使用新鲜调制的自动对焦溶液。使用前保持溶液冰冷（0°C–4°C）。
2. 从6孔板的每个槽抽取培养基。立即向每个井加入2毫升冷水溶液。
3. 使用无菌镊子，轻轻将含有粘附细胞的盖玻片从井上提起，同时保持细胞表面朝上。将盖玻片短暂放入预装2毫升冷0.9% AF溶液的单独井中，浸泡2–3秒。
4. 每次用新鲜的AF溶液重复冲洗过程，总共冲洗两次。最终冲洗后，将AF溶液中的盖片取出，并在室温化学烟雾罩中自然风干约20–30分钟，然后进行DESI–MSI分析。
   注意：清洗时应轻轻冲洗细胞，以免扰动细胞。

3. 制造修改版基于FAIMS的MS接口

1. 拆卸FAIMS Pro电极离子源壳适配器以访问内部电极区域。确认该适配器是否兼容配备FAIMS Pro接口配置的Thermo Orbitrap质谱仪。
2. 拆除FAIMS电极组件，包括内部导线、电极组件、O型圈及支撑内部结构。保留外部外壳壳体、安装法兰及质谱仪识别适配器所需的接口检测针。
3. 使用标准机加工工艺修改圆形开口。扩大开口，直到在突出的Orbitrap入口/离子漏斗组件周围留出足够的空间。
4. 切割后磨平并去除毛刺。确认修改后的开口允许质谱仪上无阻碍地定位壳体适配器。
5. 用锯子修改外壳适配器两条腿的长度。将腿部修剪至大约2又1/4英寸的最终长度，以便与光学面包板连接。
   注意：使用合适的加工工具，避免损坏剩余外壳的结构完整性。
6. 准备一块铝制光学面包板（10英寸×12英寸×0.5英寸，1/4英寸-20个攻孔）。将面包板水平放置在修改后的FAIMS适配器下方。
7. 使用两个安装支架将改装后的FAIMS适配器连接到光学面包板。根据需要修剪支架，减轻重量，并使面包板相对于Orbitrap入口能够正确定位。
8. 使用与面包板1/4英寸-20锥孔对齐的机械兼容安装硬件，将修改后的AIMS接口固定在光学面包板上。确保成像实验中的稳定定位。
   注意：确保接口固定坚固，以减少级级移动和数据采集时的振动。
9. 在光学面包板上，直接在AIMS外壳接触区下方切割或切割一个浅槽。槽槽的大小和位置，以提供足够间隙，保证固定座椅和修改后的FAIMS壳体相对于轨道陷阱入口的对齐。
   注意：槽槽尺寸应适配FAIM壳体适配器底座，并提高位置重复性。
10. 将安装接口与质谱仪入口对齐。确认固定的固定法兰正确安装在仪器上，并且光学面包板在接口下方保持水平。
11. 在安装DESI喷雾器前，请确认修改后的圆形开口是否能在Orbitrap入口/离子漏斗组件周围提供无阻碍的间隙。

4. 组装DESI喷雾器和Orbitrap接口

1. 将DESI喷雾器安装到由定制FAIMS框架、电动XYZ级、气体调节器和光学面包板组成的集成装置上。使用由CONEX-MFACC控制器控制的电动舞台。
2. 定义x轴为从左到右的光栅扫描方向，定义y轴为从上到下的线步进方向。采集前先设定z轴位置，成像时保持固定。
3. 使用约1毫米的舞台行程范围，X方向和1毫米。采集时不要进行Z轴移动。
4. 将DESI喷雾器相对于样品表面约70°角放置。将样品直接放在喷雾器下方，并尽量将喷头尖端靠近Orbitrap入口，避免物理接触。
5. 将DESI接地金属连接到质谱仪下方的接地源。使用舞台控制软件控制栅格运动（见图1）。
   注意：本研究中使用的DESI喷雾器仅供使用DESI–MSI仪器的用户使用。
6. 使用电动XYZ舞台控制器进行舞台移动和定位。在运行前，先连接电压线、氮气管线、溶剂管线和接地线。
7. 安装一根定制不锈钢离子传输管（外径1/16英寸×内径0.033英寸），设计以匹配Orbitrap离子源入口。将离子转移管定位，使其直接与轨道陷阱入口对齐，同时向外延伸足够，以便DESI羽流畅通。
   注意：根据质谱仪配置定制离子转移管。使用适当的加工工艺制造离子转移管。
8. 使用带有弯曲几何形状的离子转移管，以改善DESI喷雾器相对于样品表面和Orbitrap入口的位置。
9. 将喷雾器与样品表面以约70°角对准，使DESI喷雾羽流与Orbitrap入口区域相交而不接触样品表面。
10. 通过采集过程中存在稳定质谱和一致归一化水平（NL）值来定义稳定喷雾羽流。调整喷雾器位置，直到观察到稳定的离子信号。
11. 将喷雾器与表面距离设为约1.0–1.5毫米作为起始条件。手动微调喷雾器位置，同时监测NL值，以获得最高稳定的离子信号。

图1。集成解吸电喷雾电离（DESI）-质谱成像（MSI）装置，配合Orbitrap质谱仪。 DESI喷雾器安装在一个集成平台上，平台由改良型高场非对称波形离子迁移率（FAIMS） 适配器、电动XYZ级、气体调节器和光学面包板组成。溶剂通过纳米液相色谱系统输送，氮气以约12 psi的压力供应以实现喷雾稳定。图中还显示了电离电压连接、溶剂管线以及喷雾器相对于轨道陷阱入口的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 配置溶剂输送和喷雾条件

1. 在DESI–MSI分析前，制备由甲醇/水/甲酸（98：2：0.1，v/v/v/v）组成的新鲜喷雾溶剂。
   注意：优化后可使用其他DESI兼容溶剂系统，包括基于乙腈的溶剂和不同的甲醇/水比。甲醇/水/甲酸（98：2：0.1，v/v/v）作为该协议的标准起始条件，因为它在单细胞DESI–MSI实验中提供了稳定的羽流形成、减少溶剂扩散以及可重复的正离子模脂质信号。
   注意：甲醇易燃且有毒。甲酸具有腐蚀性。把溶剂放进化学排气柜。
2. 使用Ultimate 3000纳米液晶系统，作为等裂溶剂泵，以750 nL/min的速率输送该溶剂，用于报告的实验。用PEEK管（外径1/16英寸×内径0.005英寸）将纳米液质溶液管连接到DESI喷雾器。
3. 在直线中安装一个C18柱（例如nanoEase M/Z肽BEH;130 Å，1.7微米，300微米×150毫米），以提供足够的背压，以实现低流量下稳定的喷雾形成。
4. 将质谱仪方法设置为正离子模式，使用Orbitrap检测，喷雾电压为0.85 kV，Orbitrap分辨率为120,000，m/z 200，m/z范围为150–1200。
5. 将归一化后的AGC目标设置为100%，最大注射时间为100毫秒，射频透镜为45%，显微扫描为1。禁用四极隔离和源碎片化。
6. 通过氮发生器或液氮源以约12 psi的压力供应氮鞘气体，以稳定DESI喷雾羽流。以12 psi为起始操作压力，只有在需要时才进行微调以提升自然值并保持质量谱稳定。

6. 执行栅格成像和像素控制

1. 利用网格覆盖单作为参考，识别包含光学可见单细胞的兴趣区域。选择与邻近细胞明显视觉分离、形态相连完整且无明显与碎片或细胞簇重叠的孤立细胞。
2. 使用Fance Stage Controller软件⁴⁶定义光栅区域。将光栅步长设置为0.01毫米，舞台速度为0.01毫米/秒，停留时间为20秒。
3. 使用从左到右扫描每条线，然后沿Y方向移动到下一条线。将光栅线之间的正交步长设置为10微米。
4. 根据Orbitrap采集速率调整级速度，以获得所需的扫描方向像素尺寸（例如约2.5–6.5微米）。计算扫描方向像素尺寸，关系如下：扫描方向像素尺寸=级速度×每次扫描获取时间。
5. 使用0.01毫米/秒（10微米/秒）的级速，在102秒内获得376次扫描，获得每次扫描0.271秒的采集时间，对应的扫描方向像素尺寸约为2.7微米。通过将轨道陷阱采集时间略短于阶段移动和停留时间参数的总和，同步级级移动和质谱采集。
   注意：正交像素尺寸由程序化步长及级的物理和机械限制决定，而扫描方向尺寸则由级速度和光谱获取速率决定。
6. 在预定义的栅格区域完成之前，获取选定质量范围内的成像数据。对于使用0.01毫米线步和0.01毫米/秒级速度获得的1毫米×1毫米成像区域，总采集时间约为4–5小时。
7. 采集过程中生成RAW数据文件，完成指定x–y光栅坐标及相应仪器方法持续时间后停止采集。在此处描述的正离子模式条件下，每条栅格线通常生成约50MB的RAW文件，101条栅格线的总数据约为5 GB。

7. 光学到MS图像配准

1. 在AF洗干后、DESI采集前，使用配备10×物镜的明场显微镜拍摄选定网格区域的细胞明场图像。
2. 使用 ProteoWizard⁴⁸ 中的 msConvert 将 RAW 文件转换为 mzML 文件。使用 imzML Converter⁴⁹ 将 mzML 文件转换为 imzML 格式。
3. 使用与所获数据格式一致的中心棒/配置文件转换设置。将 imzML 文件直接上传到 METASPACE （https://metaspace2020.eu）⁵⁰ 进行图像可视化。
4. 在可视化前，请勿进行归一化、热点移除或额外的图像处理修正。手动用网格标志作为位置参考对准光学和MS图像。
5. 利用已知的图像尺寸和网格间距对光学图像进行缩放。手动叠加MS图像，以评估光学可见细胞位置与局部离子信号之间的对应关系。
6. 通过视觉一致性确认单细胞定位，通过明场图像中分离细胞与相应的MS离子分布。

结果

该协议成功执行后，会产生DESI–MSI数据集，其中光学识别的单细胞在空间上对应于局部分子离子信号（见图2）。在DESI–MSI分析前拍摄的明场显微镜图像，能够目视识别单个OVCAR-8细胞，并利用网格覆盖片作为位置参考，促进光学与MS图像的对准。代表性的DESI–MSI离子图像显示出与对应明场图像中识别的单个细胞空间相关的局部离子分布（图2A–2D）。

图2。OVCAR-8细胞明场显微镜与微成像的比较。 （A） OVCAR-8细胞的明场显微镜图像，采用10×倍放大。（B–D）使用DESI–MSI拍摄的MS图像，像素尺寸为5.5微米×10微米。代表性离子分布分别为（B）m/z 317.111、（C）m/z 808.562和（D）m/z 788.616。比例条=50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

单个细胞生成包含多种脂质相关离子和小分子的完整质谱。每个细胞不依赖单一分子标记，而是展现出多离子分子谱，作为化学指纹。m/z 317.111、m/z 808.562 和 m/z 788.616 的代表性离子图像显示了邻近细胞间的分子分布异质性，表明单细胞层面的代谢异质性可测量（见图 2B–2D）。基于METASPACE的注释表明，m/z 808.562和m/z 788.616的离子主要与磷脂酰胆碱和磷酰乙醇胺脂类相关，而m/z 317.111则对应若干候选小分子和二肽相关物种。这些结果表明，该平台能够在环境条件下检测光学识别单细胞的空间定位分子特征。其他结果，包括初步注释的物种、MS/MS鉴定的物种、代表性的MS图像和质谱，见于之前的研究²⁰。

集成的DESI–MSI平台由一个DESI喷雾器、一个改良的AIM适配器、一个电动XYZ级和安装在Orbitrap入口旁的光学面包板组成（见图1）。该装置实现了稳定的溶剂输送、受控的级段移动，以及DESI喷雾羽流与质谱仪入口的对齐，用于环境单细胞成像实验。 图3 所示的定制离子转移管实现了DESI源区与Orbitrap入口之间的离子传输。弯曲的毛细管几何结构便于DESI喷雾器相对于样品表面和入口区域的位置，同时保持离子传输畅通。

图3。Orbitrap MSI定制离子转移管。 用于将DESI喷雾器与Orbitrap聚变Lumos质谱仪连接的定制离子转移管照片。图中展示了用于环境单细胞MSI实验中离子传输的弯曲转移毛细管几何形状和安装组件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4 展示了经过修改的AIMS适配器与光学面包板和电动XYZ级集成。上视图（图4A）展示了样品级和修改后的适配器相对于轨道阱入口的位置，而下视图（图4B）展示了用于支撑成像平台的安装支架和级组件。集成组件的机械稳定性对于保持光栅运动的一致和在成像采集过程中最小化位置漂移至关重要。

图4。改进型高场非对称波形离子迁移光谱仪（FAIMS）适配器，集成于光学面包板和电动XYZ级。 （A）安装在轨道阱入口和样品级旁的改良适配器的俯视图。（B）底部视图，显示用于支撑和校准成像平台的改良支架、光学面包板和电动XYZ级组件。 请点击此处查看该图的放大版本。

Orbitrap检测提供的高质量分辨率使得近距且等压脂质物种的区分成为可能，从而提升分子特异性和图像对比度，相较于低质量分辨率系统。通过同步级速度和光谱采集率，可以实现小像素尺寸。例如，通过快速采集的Orbitrap平台和优化的栅格参数⁴²，实现了2.7微米×10微米的像素尺寸。高空间分辨率成像能够在最小化邻近细胞间信号重叠的同时，对近邻细胞细胞进行分子划分。

成功的DESI–MSI实验特点是喷雾条件稳定、光栅线间离子强度一致，以及对应光学图像中单个细胞的分子信号空间定位。次优实验可能导致离子分布散布、信号强度低、光栅图样不一致，或因喷雾形成不稳定、喷雾器对齐不当、溶剂过度扩散或样品采集过程中移动而导致细胞定位丧失。对喷雾比对、溶剂流量、级段速度和样品定位的精心优化，可以提升单细胞成像实验中的空间精度和离子信号稳定性。

讨论

该协议通过精确的阶段控制、纳米级溶剂输送、光学靶向和高空间分辨率质量分析，使环境单细胞DESI–MSI能够使用高质量分辨率的Orbitrap质谱仪实现。这些元素的结合解决了历史上限制DESI–MSI在单单元层面应用的多重技术障碍。特别是，对喷雾稳定性、离子传输和采集时序的协调控制，使得从对应单个细胞极小采样体积的分子信号能够可靠检测。该工作流程中性能的核心因素是DESI喷雾羽流的稳定性和约束性。在微米级空间分辨率下，溶剂流量、气体压力或喷雾器位置的微小扰动都可能显著改变有效采样面积。结合纳米级溶剂输送配合适当背压，提升喷雾稳定性并减少溶剂扩散，从而提升空间精度。此外，保持喷雾器与表面距离和角度一致对于可重复的电离效率至关重要。即使是几何上的微小偏差，也可能导致信号强度的显著变化，尤其是在分析异质细胞样本时。实际上，DESI喷雾条件的优化通过在采集过程中监测总离子电流、光谱稳定性和NL值（通常在10⁵–10⁶左右）来实证进行。通过迭代调整喷雾器位置、溶剂流动稳定性、气体压力以及DESI羽流相对于轨道陷阱入口的对齐，实现了可复现的信号质量。

离子传输效率是单细胞尺度的另一个关键限制，因为单个细胞内分析物丰度本质上较低。在这些空间尺度下，高效的离子传输可能成为某些实现中比电离效率更大的实际限制，因为最终只有极少部分脱附离子到达质谱仪入口。因此，将离子从采样区高效转移到质谱仪入口至关重要。该协议中使用的改良版FAIMS外壳适配器为DESI喷雾源与热质谱仪提供接口，支持多种仪器型号，包括Orbitrap Tribrid、Exploris和Astral系列平台。将修改后的FAIMS外壳适配器与光学面包板集成，也提供了机械稳定性，从而最大限度地减少长时间成像实验中的错位。级段运动与质谱采集的同步对于实现高空间分辨率同样至关重要。在DESI–MSI中，扫描方向的像素维度由级速度与获取速率的关系决定，而正交维度由编程步长定义。对这些参数的精确控制使得精确采样成为可能。由于许多哺乳动物细胞直径通常在约5–20微米之间，像素尺寸仅需接近几微米，以减少相邻细胞间的信号重叠，并改善分子特征对单个细胞区域的定位。然而，标称像素大小不一定对应真实采样足迹，因为溶剂羽流与样品表面的相互作用可能导致横向扩散和相邻像素间的部分信号重叠。因此，报告的像素尺寸应在有效空间分辨率的背景下解释，而非严格的几何定义。本研究所用的定制离子转移管设计基于标准离子转移管的几何形状，以保持离子传输特性，同时实现与DESI源配置的集成。

Orbitrap质谱仪提供的高质量分辨能力和质量精度对于解析单个细胞内复杂的代谢物和脂质混合物至关重要。许多检测到的分子特征通过精确的质量测量和METASPACE分析进行了初步注释。由于多个候选选项可能对应单一测量的m/z值，进一步的MS/MS验证和正交分子确认策略将进一步强化未来研究中的分子鉴定。在正离子模式下，DESI光谱通常由磷脂物种主导，这些磷脂物质的m/z值间距较近或等压。高分辨率轨道陷阱检测使这些物种能够区分，从而提高分子特异性并减少光谱模糊性。这一能力对于单细胞分析尤为重要，因为依赖有限数量的离子可能导致对细胞异质性的误解。这种适应性表明，类似策略可能适用于其他质谱平台，使用相应接口并经过适当修改。尽管有这些优势，但仍需考虑若干限制。首先，当前工作中使用的DESI源仅供拥有DESI–MSI系统的用户使用，因此DESI喷雾器/Orbitrap系统的构建可能受限于DESI源的可用性。然而，包括DEFFI在内的替代DESI设备也可用于高空间分辨率MSI研究^42,47。其次，该平台的实现需要大量定制，包括仪器接口的加工和安装部件的制造。这些要求可能限制了没有仪器开发或机械制造经验的实验室的可及性。在当前实现中，FAIMS接口壳体作为一个方便的机械安装平台，用于将DESI喷雾器组件相对于Orbitrap入口定位。因此，对于拥有FAIMS兼容Orbitrap系统和基础加工支持的实验室来说，上述配置的实现更为实用。然而，机械性耦合DESI源与轨道陷阱入口的更广泛概念，可以通过不同设计实现，而无需修改FAIMS接口硬件。第三，虽然低溶剂流量改善空间约束，但也可能降低整体离子产额，因此需要在灵敏度和空间分辨率之间进行精细优化。

另一个重要考虑是采样过程中分析物可能的离域。虽然DESI在环境条件下工作且不需基质应用，但溶剂液滴与样品表面的相互作用可能导致分析物重新分布，尤其是对于高度可溶的物种。因此，最小化溶剂体积和优化喷雾条件对于单细胞层面的空间完整性至关重要。同样，使用等渗铵甲酸的清洗过程可以在保持细胞完整性和保护细胞物种的同时减少盐相关离子抑制，正如此前单细胞MS工作流程中报道的^5。

未来的发展可能会进一步提升该平台的性能和适用性。例如，与更快的数据采集系统集成可能实现更小的有效像素尺寸和更高通量的MSI实验。实施自动校准系统或实时反馈控制可能减少变异性并提高重复性。此外，将该方法与荧光成像或靶向标记策略等互补技术结合，有望增强细胞类型识别并实现多模态分析。

除了技术层面，该平台对生物和生物医学研究具有广泛影响。在环境条件下，能够在单个细胞层面表征分子轮廓，为研究复杂系统中的细胞异质性提供了新机遇。DESI–MSI已成功应用于组织层面肿瘤微环境、神经疾病、宿主-病原体相互作用及耐药细胞群体的研究12,15,16,35。将DESI–MSI扩展到单细胞层面，可能进一步提升区分邻近细胞局部化学异质性、识别稀有细胞亚群以及发现在大体组织测量中可能被掩盖的分子标记的能力。然而，本研究采用简化的单层细胞培养模型，尚需更多研究以证明其与其他复杂生物系统的兼容性，包括不同细胞模型、组织、类器官和三维培养。当前工作流程可能为在进一步验证和优化后，将高空间分辨率DESI测量扩展到日益异质的生物环境中奠定基础。由于该方法在提供详细分子信息的同时保持空间上下文，可以作为成像与基于组学的方法之间的桥梁。总之，该协议建立了一个灵活且可适应的框架，用于在Orbitrap质谱仪上实现单细胞分辨率的DESI–MSI。通过解决电离效率、离子传递、空间控制和质量分辨率等关键挑战，该方法实现了对单个细胞的详细分子表征。虽然还需要进一步优化和验证，但该方法为扩大环境MSI在单细胞和空间代谢组学研究中的应用奠定了基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
−80 °C冰箱	Eppendorf New Brunswick	U700	生物样本在制备前的储存。
6"垂直支架用于面包板，1/4"-20个孔（2个）	Millipore Sigma	VB01A	自定义喷嘴安装装置的机械支撑和稳定
乙腈	Fisher Chemical	240744	DESI兼容溶剂制备和优化的有机溶剂
甲酸铵	Thermo Fisher Scientific	401152500	在DESI-MSI之前进行细胞洗涤的等渗甲酸铵洗涤缓冲液的制备
明视显微镜	Fisher Scientific	12575252	在DESI-MSI采集之前对附着细胞进行光学成像和可视化
C18色谱柱	Waters	186009259	用于稳定纳米流DESI喷雾形成的在线背压产生
铜线	N/A	N/A	在喷嘴安装装置的制作过程中进行电气连接和接地
DESI XS喷嘴	Waters	700014033	单细胞DESI-MSI实验的环境DESI电离源
环氧树脂	Devcon	20945	自定义喷嘴安装装置组件的机械稳定和固定
FAIMS Pro电极电离源挂件适配器	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	自定义Orbitrap兼容DESI接口的改装和制造
甲酸	Ward’s Science	470301-120	DESI喷雾溶剂制备的酸性修正剂
甲醇	Fisher Chemical	A456-4 Optima	DESI喷雾溶剂制备的有机溶剂
气体调节器	Millipore Sigma	23831-U	在DESI操作过程中调节氮气庇护气压力
带网玻璃盖片	Ibidi	10817	细胞培养基底和光学到MS图像配准的位置参考
接地线	N/A	N/A	DESI喷嘴和接口组件的电气接地连接
培养箱	HeraCell	51026282	在受控温度和CO2条件下维护哺乳动物细胞培养
LC/MS级水	Thermo Fisher Scientific	W6500	制备甲酸铵洗涤缓冲液和DESI喷雾溶剂
METASPACE平台	METASPACE	https://metaspace2020.eu	基于云的MS图像可视化和空间代谢组学数据分析
改装FAIMS接口	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	用于将DESI喷嘴与Orbitrap质谱仪耦合的定制接口
电动XYZ平台	Newport Corporation	CONEX-MFACC	在DESI-MSI采集过程中控制扫描平台的移动
MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒	Lonza	LT07-703	对培养细胞中的支原体污染进行常规监测
纳米液相色谱系统	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	用于DESI喷雾生成的纳米流溶剂输送系统
光学面包板	Thorlabs	MB1012	DESI喷嘴和改装接口组件的机械支撑平台
Orbitrap Fusion Lumos质谱仪	Thermo Fisher Scientific	UVPD	用于DESI-MSI数据采集的高分辨率Orbitrap质谱仪
PEEK管	IDEX	1535	纳米LC系统和DESI喷嘴之间的溶剂管路连接
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	哺乳动物细胞培养基的抗生素添加剂
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	VWR	0780-50L	传代过程中对培养细胞的洗涤溶液
RPMI-1640培养基	Gibco	11875093	哺乳动物细胞培养基，用于维护OVCAR-8细胞
平台控制软件	Lasken Group	版本6	光栅扫描、平台移动和图像采集参数的软件控制
不锈钢管	MicroGroup	316H16H	用于Orbitrap接口集成的定制离子转移管路（1/16" OD，0.033" ID）
250 µL注射器	Hamilton	1725LTN250UL	溶剂加载和纳米流溶剂输送
合成胎牛血清（FBS）	HyClone	SH3006603	用于制备完全哺乳动物细胞培养基的血清添加剂
TC20自动细胞计数器	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	在铺涂盖片前对培养细胞进行自动计数
组织培养皿，100 mm	Fisher Scientific	FB012924	附着OVCAR-8细胞培养的扩大和维护
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	传代过程中对附着细胞的酶解分离
UV固化树脂	Prime Dental	6.03	自定义DESI喷嘴安装装置组件的制作和稳定
Xcalibur软件	Thermo Fisher Scientific	4.7	仪器控制、Orbitrap方法设置和质谱数据采集