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建立STAT6报告基因检测法用于筛选影响过敏性气道炎症的环境毒物

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DOI：

10.3791/71694

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2026年8月25日

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1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

本文内容

摘要

本方案描述了在人呼吸道上皮细胞中建立和验证稳定的 STAT6 荧光素酶报告基因检测的方法。该方法可在受控条件下高效筛选可调节 STAT6 活性的环境毒物和空气污染物组分 体外 条件。

摘要

与空气污染相关的过敏性气道炎症正日益成为重要的公共卫生问题。白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）可激活信号转导子与转录激活子6（STAT6）通路，该通路是过敏性气道炎症的核心介质，可能调节污染物引起的呼吸系统毒性。本研究描述了一种在人源气道上皮细胞中建立并验证稳定的STAT6荧光素酶报告基因检测方法，用于评估可调节STAT6信号通路的环境毒物。人支气管上皮16HBE14o-细胞− 细胞通过慢病毒载体转导了STAT6响应性荧光素酶报告系统，随后优化了嘌呤霉素筛选浓度和感染复数，并通过有限稀释法进行单克隆分离。筛选获得一个在连续传代中表现出强效且可重复诱导的稳定克隆。通过IL-4/IL-13刺激验证报告系统的响应性，并利用特异性STAT6、STAT5和STAT3抑制剂确认其对STAT6的依赖性。通过Z值量化检测性能′-因子分析，表明可重复的信号分离。此外，该检测方法还应用于单个空气污染物组分，以及苯并[b]荧蒽和颗粒物显著增加了STAT6报告基因活性。该方法为检测气道上皮细胞中STAT6活性以及筛选可调节过敏性气道信号通路的环境毒物提供了一种可扩展的策略。

引言

空气污染是当前最紧迫的全球公共卫生挑战之一，具有深远的健康影响和经济社会后果。目前，空气污染被列为全球第二大死亡风险因素，每年导致810万人死亡1,2,3。在各类空气污染物中，直径小于2.5微米的细颗粒物（PM2.5）因其可深入穿透呼吸道而构成最大的健康风险4,5。长期暴露于高浓度PM2.5已被明确证实与肺功能下降以及呼吸系统疾病住院率升高密切相关6。包括哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎在内的过敏性炎症性疾病的患病率在全球范围内持续上升，且在污染严重的特大城市中尤为突出4。

变应性气道疾病（如特应性哮喘）主要由2型炎症反应介导，其特征是白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）水平升高，并激活信号转导子和转录激活子6（STAT6）信号通路7。在气道上皮细胞中，IL-4和IL-13驱动的STAT6磷酸化可促进黏液过度分泌并破坏上皮屏障，表明STAT6是变应性气道病理过程的核心介质，也是重要的治疗靶点8,9。来自小鼠模型的实验证据表明，暴露于PM2.5和二氧化硫会增强STAT6信号传导，并加剧变应性气道炎症10,11。然而，尚无系统研究评估单个空气污染物组分是否可直接调节人源气道上皮细胞中STAT6的转录活性。

空气污染由多种化学成分复杂的物质组成，包括颗粒物、多环芳烃（PAHs）、重金属和无机盐，这些成分各自对气道STAT6活化的作用尚不明确12,13。目前用于检测气道上皮细胞中STAT6活性的方法，如终点磷酸化检测或基于瞬时转染的报告系统，均不适用于大规模化学物质筛选。因此，建立一种在人源气道上皮细胞中稳定表达的STAT6报告系统，将为识别可调节过敏性气道信号通路的污染物提供可扩展的工具。本实验方案描述了在16HBE14o−气道上皮细胞中构建和验证稳定的STAT6荧光素酶报告检测方法，从而实现对环境样品及单一化学毒物诱导STAT6活化的定量评估，用于系统性筛选。

方案

本研究使用已建立的16HBE14o−人支气管上皮细胞系，因此不适用人体受试者伦理审批。

1. 生成稳定表达STAT6活性报告基因的16HBE14o− 细胞

注意：图1 展示了工作流程的概览。

  1. 细胞培养
    注意：所有操作均须在 II 级生物安全柜中采用无菌技术进行。使用前须确认细胞无支原体污染。
    1. 将 16HBE14o− 细胞维持在添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的最低必需培养基中。将细胞在含 5% CO2 的湿润环境中 37 °C 培养，并每隔一天更换一次培养基。
    2. 让细胞生长至约 80% 汇合度。吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液冲洗细胞单层一次。
    3. 加入足量磷酸盐缓冲液覆盖细胞单层，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。完全吸除磷酸盐缓冲液。
      注意：采用 20 分钟磷酸盐缓冲液孵育步骤，有助于破坏该细胞系形成的紧密细胞间连接。此孵育时间是本实验室优化后的改良方案。
    4. 加入足量 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液覆盖细胞单层。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
      注意：使用倒置光学显微镜监测细胞脱落情况。必要时轻轻敲击培养容器以促进细胞脱落。
    5. 加入相对于胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液体积约五倍的完全培养基以终止酶活性。轻柔吹打悬浮液，获得单细胞悬液。
    6. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。在 25 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
    7. 小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。轻柔吹打混匀，并在倒置光学显微镜下确认形成单细胞悬液。
    8. 使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至后续实验所需密度。常规传代比例为 1:8。
      注意：有关培养容器的生长面积以及相应的磷酸盐缓冲液和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液体积，请参见 补充表 1 和 补充表 2。
  2. 确定嘌呤霉素诱导的细胞毒性
    ​注意：根据慢病毒载体编码的抗性基因选择相应的抗生素。
    1. 将 16HBE14o− 细胞以每孔 2 × 104 个细胞接种于 96 孔培养板中，每孔含 100 µL 完全培养基。将细胞孵育过夜。
    2. 将培养基更换为含嘌呤霉素的新鲜培养基，终浓度分别为 0.5、1、2 或 4 µg/mL。为 24、48 和 72 小时时间点分别准备独立的培养板。
    3. 向每孔加入 5 µL 细胞计数试剂。将培养板在 37 °C 下孵育 1 小时。
      注意：避免在加样过程中引入气泡，因其可能干扰吸光度测定。
    4. 使用 650 nm 作为参考波长，在 450 nm 处测定吸光度。在终点法模式下读数前，立即振荡培养板 15 秒。
    5. 使用公式 1 计算细胞活力14。
      细胞活力计算公式，样品、对照组、空白组的 OD450-650；生物测定分析公式。
      其中：
      吸光度计算公式 OD450-650，减法方法，用于分光光度法，公式。
      光密度公式（OD450-650），用于光谱实验中的吸收分析。
      光密度方程，OD450-650blank=OD450blank-OD650blank，用于光谱数据分析。
      注意：将未处理细胞定义为对照组，将不含细胞但含检测试剂的培养基定义为空白组。选择能够在 48–72 小时内完全清除未转导细胞的最低嘌呤霉素浓度。
  3. 确定最佳感染复数
    警告：须在注册的生物安全二级设施中，在生物安全二级条件下操作慢病毒颗粒，并遵守机构的生物安全规定。所有病毒操作均须在 II 级生物安全柜中进行。病毒污染的耗材或溢出物须用 10% 漂白剂覆盖至少 1 小时后，方可作为生物危害废物处理。
    ​注意：应优化感染复数，因其直接影响转导效率。
    1. 使用公式 2 计算所需慢病毒原液的体积15。
      MOI 计算公式，病毒颗粒与靶细胞的比值，分子生物学公式。
      其中：
      功能性病毒滴度公式，T_virus = TU/mL，病毒学研究数据分析公式。
      病毒体积公式，V_virus=病毒体积（mL），公式，病毒学研究，计算方法。
      静态平衡，公式：N_cells = 靶细胞数量，用于教育研究的示意图。
      注意：本方案中使用的 STAT6 荧光素酶报告慢病毒原液的功能性滴度为 5 × 107 转导单位/mL。对于 2 × 104 个靶细胞，MOI 为 20 时对应每孔 8 µL 慢病毒原液。对于不同滴度的病毒制剂，应重新计算病毒体积。
    2. 将 16HBE14o− 细胞以每孔 2 × 104 个细胞接种于 96 孔白色透明底培养板中，每孔含 100 µL 完全培养基。将细胞孵育过夜，直至达到约 80% 汇合度。
    3. 将培养基更换为含 5 µg/mL 多聚素（polybrene）和 STAT6 荧光素酶报告慢病毒（MOI 分别为 1、5、10 和 20）的新鲜培养基。设置一个不含慢病毒的未转导模拟对照孔。
      注意：根据病毒原液的功能性滴度计算各 MOI 所需的慢病毒体积。
    4. 将细胞与慢病毒颗粒共孵育 48 小时。将转导培养基更换为新鲜培养基，并继续孵育 24 小时。
    5. 将培养基更换为含白细胞介素-4 和白细胞介素-13（各 10 ng/mL）的新鲜培养基。将细胞孵育 24 小时。
    6. 向每孔加入 25 µL 荧光素酶检测试剂16。避光保护培养板，并在室温下孵育 20 分钟。
    7. 以线性方式振荡培养板 20 秒。使用全板读数模式和增益设置为 120 的条件测定发光强度。
      警告：加入荧光素酶检测试剂后 1 小时内记录发光信号，以捕获最大信号。请遵循试剂生产商的安全与操作说明。
      注意：所有吸光度和发光强度测定均应使用相同的多功能微孔板读数仪和采集参数。
  4. 转导细胞的筛选
    1. 将 16HBE14o− 细胞以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种于 24 孔培养板中。将细胞孵育过夜。
    2. 将培养基更换为含 MOI 为 20 的 STAT6 荧光素酶报告慢病毒和 5 µg/mL 多聚素的新鲜培养基。将细胞孵育 48 小时。
    3. 将转导培养基更换为新鲜培养基。继续孵育细胞 24 小时。
    4. 吸除培养基，并加入含 1 µg/mL 嘌呤霉素的新鲜培养基。将细胞孵育 5 天，每 2 天更换一次筛选培养基。
    5. 持续进行嘌呤霉素筛选，直至未转导的模拟对照孔中所有细胞均被清除。
      ​注意：转导后至少等待 24 小时再开始抗生素筛选，以允许抗性基因充分表达。
  5. 通过有限稀释法分离单细胞克隆
    1. 消化并计数经嘌呤霉素筛选的 STAT6 报告细胞。通过连续稀释制备浓度为 5 个细胞/mL 的单细胞悬液。
      ​注意：稀释过程中防止细胞聚集。必要时可通过细胞筛过滤悬液。
    2. 将 200 µL 细胞悬液分配至 96 孔培养板的每孔中，以获得平均每孔约一个细胞的密度。
    3. 在 24 小时内使用倒置显微镜检查每孔，识别仅含单个细胞的孔。排除含多个细胞或多个空间分离细胞集落的孔。
    4. 在第一周内监测选定孔，确认克隆性生长。每 3 天更换一次培养基。
    5. 在原始 96 孔板中扩增每个克隆约 20 天，或直至细胞汇合。将每个克隆依次转移至 6 孔板，再转移至 T-25 培养瓶。
      注意：在将细胞转移至 T-25 培养瓶前，应在 6 孔板中培养约 6 天，或待其达到适当汇合度后再转移。
      ​暂停点：可继续扩增克隆，或以每管 1 × 106 个细胞的密度，在含 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜的 1 mL 冷冻保存液中进行冷冻保存。
    6. 将扩增后的每个克隆以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种于 96 孔白色透明底培养板中。将细胞孵育过夜。
    7. 将培养基更换为含 IL-4 和 IL-13（各 10 ng/mL）的新鲜培养基。将细胞孵育 24 小时。
    8. 按照步骤 1.3.6–1.3.7 所述方法测定荧光素酶活性。比较各单个克隆的诱导报告基因活性。
    9. 在细胞传代次数增加的情况下重复荧光素酶检测。选择在多次传代中保持一致细胞因子诱导报告基因活性的克隆。
      注意：克隆 3 因其基础发光水平低，且在连续传代中能维持稳定的细胞因子诱导激活信号而被选中。

2. STAT6 活性报告基因检测方法的建立与验证

注意：图2 展示了工作流程的概览。

  1. STAT6 活性报告基因检测的验证
    1. 使用完全培养基，以每孔 100 µL 将 STAT6 报告基因细胞接种于 96 孔白色透明底板中，细胞密度为 2 × 105 个细胞/mL。将细胞培养过夜。
    2. 更换新鲜培养基，其中加入终浓度均为 10 ng/mL 的 IL-4 和 IL-13。同时加入以下选择性抑制剂：100 nM AS1517499（STAT6 抑制剂）、2.5 µM AC-4-130（STAT5 抑制剂）或 2.5 µM Stattic（STAT3 抑制剂）。
    3. 设置含 0.1% 二甲基亚砜（DMSO）的溶剂对照组。将细胞继续培养 24 小时。
    4. 按照步骤 1.2.3–1.2.5 所述方法，通过细胞计数实验测定细胞活力。
    5. 按照步骤 1.3.6–1.3.7 所述方法检测荧光素酶活性。
    6. 将每孔的发光信号根据其对应的细胞活力进行归一化处理，并以细胞因子处理的对照组为参照表达归一化值。
      注：细胞活力下降可能独立于 STAT6 活性而降低荧光素酶信号。只有在确认细胞活力处于可接受范围后，方可解释报告基因活性结果。
  2. 检测方法稳健性的评估
    1. 通过阳性对照组和阴性对照组各设置 21 个重复孔，计算 Z′ 因子以评估检测的稳健性。
    2. 使用公式 3 计算 Z′ 因子。
      静态平衡方程，Z因子公式，用于检测质量控制的数学表达式。
      其中：
      静态平衡方程，σₚ 表示对照组的标准差，用于教育目的的公式图示。
      标准差方程，σn，用于阴性对照准确性的统计分析。
      方程 μ<sub>p</sub>= 阳性对照的平均信号；统计数据分析概念。
      静态平衡，方程 μn= 阴性对照的平均信号，用于教育分析。
      注：Z′ 因子在 0.5 至 1.0 之间表明该检测适用于高通量筛选。

3. STAT6 报告基因检测在环境毒物筛选中的应用

警告：多环芳烃和重金属盐类具有毒性且可能致癌，操作时需谨慎。应使用适当的个人防护装备，所有操作均须在经认证的化学通风橱中进行，并按照机构危险废物处理程序处置被污染的材料。

  1. 环境毒物筛选
    1. 使用完全培养基，以每孔100 µL、细胞密度为2 × 105 个细胞/mL的条件，将STAT6报告细胞接种至96孔白色透明底板中。将细胞置于培养箱中过夜培养。
    2. 更换培养基，加入含有待测化合物的新鲜培养基，终浓度按实验需求设定（本方案中为10 µM），并在无IL-4和IL-13的条件下处理细胞。
    3. 设置阴性对照组，加入0.1%二甲基亚砜；设置阳性对照组，加入IL-4和IL-13，浓度均为10 ng/mL。将细胞继续培养24小时。
    4. 按照步骤1.2.3–1.2.5所述方法，通过细胞计数法测定细胞活力。
    5. 按照步骤1.3.6–1.3.7所述方法，检测荧光素酶活性。
    6. 将每孔的发光信号根据对应的细胞活力值进行归一化处理，并以阴性对照组为基准表示归一化结果。
    7. 在分析STAT6报告基因活性时，排除使细胞活力低于80%的化合物。
      注：细胞毒性条件下获得的报告信号应视为不可靠，因为细胞活力下降可能独立于STAT6信号通路而影响发光强度。

结果

为确定用于稳定筛选的最佳嘌呤霉素浓度，将亲本16HBE14o−细胞用逐渐增加浓度的嘌呤霉素（0.5–4 µg/mL）处理，并在24、48和72小时后通过细胞活力检测评估细胞活力。嘌呤霉素以剂量和时间依赖的方式降低细胞活力，所有浓度在48–72小时后均使细胞活力降至20%以下（图3）。1 µg/mL的浓度是能够完全清除未转导细胞的最低浓度，可在48小时内将残留的细胞活力信号降低至约4.5%（p < 0.0001）。进一步提高嘌呤霉素浓度并未导致细胞活力进一步下降。因此，选择1 µg/mL嘌呤霉素用于后续转导细胞的筛选。

为了优化慢病毒转导效率，将16HBE14o−细胞分别以1、5、10和20的感染复数（MOI）转导STAT6荧光素酶报告慢病毒，转导时间为48小时，随后用IL-4和IL-13（各10 ng/mL）刺激24小时，以激活STAT6信号通路。如图4所示，相对荧光素酶活性（RLUs）随MOI的增加而升高。MOI为20时报告基因的诱导效果最强，与未刺激对照组相比，荧光信号增加了约50倍（p < 0.0001）。根据这些结果，后续实验选择MOI为20。

在优化条件下进行转导并经嘌呤霉素筛选后，未转导的细胞出现广泛的细胞死亡，而转导的细胞则保持正常的形态和活力（图5）。随后对存活细胞进行有限稀释，以建立单克隆STAT6报告细胞系。

对三个源自单个细胞的单克隆报告细胞系进行了STAT6报告基因活性评估。所有克隆均表现出较低的基础发光水平（<1,000 RLU）。用IL-4和IL-13刺激后，克隆2和克隆3显示出强烈的报告基因活性，发光值超过20,000 RLU，诱导倍数大于20倍（图6A）。其中克隆3的基础发光水平最低，因此被选中用于进一步表征。对克隆3在连续传代（P9–P21）过程中的报告基因活性进行了检测，以评估其长期稳定性。如图6B所示，在所检测的传代范围内，STAT6依赖性报告基因诱导活性保持稳定。当克隆表现出正常的生长速率、基础发光值低于约1,000 RLU，并且在细胞因子刺激后诱导倍数大于20倍时，即被视为适用于后续实验。

由于IL-4和IL-13可激活其他STAT家族成员（包括STAT3和STAT5），因此进一步评估了报告基因检测的特异性17,18。STAT6报告基因细胞在存在或不存在选择性抑制剂（靶向STAT6、STAT5或STAT3）的条件下，经IL-4和IL-13刺激24小时19,20,21。在所有处理条件下，细胞活力均保持在90%以上（STAT6抑制剂AS1517499，100 nM：98.4%；STAT5抑制剂AC-4-130，2.5 µM：97.4%；STAT3抑制剂Stattic，2.5 µM：96.2%；图7A）。抑制STAT6显著降低了荧光素酶活性（p < 0.0001），而抑制STAT5或STAT3对报告基因活性无显著影响（p = 0.2593 和 p = 0.8857，分别对应；图7B）。这些结果证实，报告基因的激活主要依赖于STAT6。

通过使用IL-4和IL-13刺激的细胞作为高信号对照，STAT6抑制剂处理的细胞作为低信号对照，计算Z′因子以评估该检测方法的稳健性。该检测得到的Z′因子为0.703 ± 0.097，表明检测性能优异、信号窗口宽，适用于高通量筛选。

最后，应用STAT6报告基因检测方法筛选了颗粒物中选定的环境成分，以评估其对STAT6信号通路的调节能力。经24小时处理后，苯并[b]荧蒽（10 µM）使STAT6报告基因活性显著增加约1.75倍（p = 0.0006），而颗粒物（100 µg/mL）使报告基因活性增加约1.5倍（p = 0.0398；图8）。相比之下，其余多环芳烃及重金属化合物（包括CdCl2、HgCl2和NiSO4，各10 µM）均未显著改变报告基因活性。综上所述，这些结果表明，STAT6报告基因检测方法具有稳定性、特异性、稳健性，适用于对调节STAT6信号通路的环境化合物进行高通量筛选。

细胞转导示意图；STAT6 荧光素酶报告基因；抗生素筛选；MOI 优化。
图1：生成16HBE14o− STAT6 报告细胞的工作流程。 生成稳定表达STAT6荧光素酶报告基因的16HBE14o−细胞的实验方案示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

STAT6 报告基因细胞检测流程图；IL4/13 刺激、CCK8、荧光素酶添加、结果。
图 2：STAT6 报告基因检测的建立与应用流程。STAT6 报告基因检测用于检测方法验证及环境毒性物质筛选的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

显示嘌呤霉素在0.5-4µg/mL浓度下作用24-72小时对细胞活力影响的柱状图；含统计学分析。
图3：确定用于稳定细胞筛选的最优嘌呤霉素浓度。亲代16HBE14o−细胞用嘌呤霉素（0.5、1、2或4 µg/mL）处理24、48或72小时。对照组细胞加入0.1%二甲基亚砜（DMSO）。采用细胞活力检测试剂盒测定细胞活力。细胞活力通过扣除空白值后，以450 nm与650 nm吸光度差值相对于对照组进行归一化计算得到。数据来自三次独立的生物学重复实验，每次实验设技术重复双样本（n = 3），以均值±标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验确定统计学显著性。图中所示为与对照组比较的p值。请点击此处查看该图的放大版本。

发光强度与感染复数的柱状图；RLU倍数变化的数据分析及统计p值。
图4：慢病毒转导效率的优化。16HBE14o−细胞在48小时内以感染复数（MOI）为1、5、10或20的STAT6荧光素酶报告慢病毒感染。经过24小时恢复期后，细胞用IL-4和IL-13（各10 ng/mL）刺激24小时。（A）对照组（未感染病毒）细胞和报告病毒转导细胞在指定MOI下的相对发光单位（RLUs）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Dunnett多重比较检验。（B）相对于未刺激的MOI 20对照组，细胞因子刺激后的诱导倍数。统计分析采用非配对Student t-检验。数据表示为三次独立生物学重复实验的均值±标准差（n = 3）。p值已标明。请点击此处查看该图的放大版本。

嘌呤霉素暴露下的细胞形态；显微镜图像显示在50 μm尺度下的变化。
图5：嘌呤霉素筛选后细胞的代表性图像。16HBE14o−细胞经或未经STAT6荧光素酶报告慢病毒（MOI = 20）转导，随后用1 µg/mL嘌呤霉素处理5天。图像使用倒置相差显微镜在相同成像条件下以100×放大倍数获取。未经处理的亲代细胞形成正常的上皮单层（左）。经嘌呤霉素处理的未转导细胞表现出广泛的细胞死亡和脱落（中），而经嘌呤霉素筛选的转导细胞仍保持存活并维持正常形态（右）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

发光检测结果；比较细胞克隆和传代中对照组与IL条件的柱状图。
图6：STAT6报告细胞克隆的鉴定及报告系统稳定性的评估。 经有限稀释法分离后，扩增了三个单克隆STAT6报告细胞系，并用IL-4和IL-13（各10 ng/mL）刺激24小时。(A) 细胞因子刺激后各报告克隆的荧光素酶活性，与未刺激对照组比较。(B) 克隆3在连续传代（P9–P21）过程中STAT6报告活性的稳定性。数据以技术重复的均值±标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

比较药物处理细胞实验中细胞存活率百分比和归一化发光强度的柱状图。
图7：选择性抑制STAT6报告基因活性而不影响细胞存活率。使用IL-4和IL-13（各10 ng/mL）刺激STAT6报告基因细胞24小时，同时加入STAT6抑制剂AS1517499（100 nM）、STAT5抑制剂AC-4-130（2.5 µM）或STAT3抑制剂Stattic（2.5 µM）。细胞因子刺激的对照组加入0.1% DMSO。（A）通过细胞存活率检测确定细胞存活率。（B）将STAT6依赖性荧光素酶活性归一化至细胞因子刺激对照组。数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）。标示了p值。请点击此处查看该图的放大版本。

将化学处理组与对照组样本的归一化发光检测结果进行比较的柱状图。
图8：环境毒物对STAT6调节作用的评估。STAT6报告细胞用颗粒物（100 µg/mL）或指定的环境毒物处理24小时，环境毒物包括多环芳烃（PAHs）和重金属（各10 µM）。STAT6依赖性荧光素酶活性以溶剂对照组（0.1% DMSO）为基准进行归一化。数据来自三次独立的生物学重复实验（n = 3），表示为均值 ± 标准差（SD）。通过与溶剂对照组比较确定统计学显著性，并标示出p值。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表 1： 16HBE14o− 细胞培养的培养容器规格及传代参数。请点击此处下载该文件。

补充表 2： STAT6 活性检测方法的比较。请点击此处下载该文件。

讨论

IL-4/IL-13–JAK–STAT6 信号通路不仅是过敏性疾病（包括哮喘和过敏性鼻炎）发病机制中的关键驱动因素，也是重要的治疗靶点22。本方案描述了一种基于稳定细胞系的简单报告基因检测方法，用于鉴定调节 STAT6 活性的化合物。该检测可用于评估多种环境化合物对 STAT6 的调节作用，并可轻松适用于高通量筛选，如概念验证筛选研究中所示（图8）。通过将荧光素酶报告系统与平行的细胞活力检测相结合，该方法能够在最小化化合物诱导的细胞毒性干扰效应的同时，实现对 STAT6 信号通路调节作用的定量评估。

该方法的一个显著特征是使用稳定转导的永生化人支气管上皮细胞16HBE14o−，这是一种生理学上相关的细胞类型，其中污染物诱导的IL-4/IL-13信号通路参与过敏性气道炎症的发生。目前检测STAT6活性的方法存在重要的实际局限性。通过蛋白质印迹法（Western blotting）或酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测STAT6磷酸化水平或其下游靶蛋白，操作繁琐且通量相对较低。瞬时转染的荧光素酶报告基因检测法虽可直接测量STAT6的转录活性，但其结果易受转染效率差异、批次间变异以及每次实验均需重复转染等因素影响，从而降低了实验的可重复性和通量。

本研究中描述的稳定报告细胞系克服了上述诸多局限。由于报告基因构建体已整合到基因组中，并经过克隆筛选，报告基因的表达在细胞群体中保持均一，并在连续传代过程中具有可重复性，从而消除了瞬时转染带来的变异性。发光信号在活细胞中进行检测，并可通过平行的细胞活力测定进行归一化处理，以排除细胞毒性的干扰因素。此外，该检测方法易于兼容96孔板格式，适用于中高通量应用。该检测的Z′因子达到0.703，表明高信号与低信号对照之间具有优良的区分度，证实其适用于高通量筛选。常用STAT6活性检测方法的比较见补充表2。然而，由于该检测反映的是STAT6响应性启动子的激活状态，而非内源性靶基因的表达，因此仍需通过STAT6下游靶基因（如MUC5AC和CCL26）进行正交验证。

STAT6 报告基因检测的成功建立和应用涉及多个关键步骤。优化慢病毒的感染复数（MOI）至关重要，因为病毒用量不足会降低转导效率，而病毒暴露过量则可能引起细胞应激并影响细胞活力。同样，嘌呤霉素筛选浓度也需要优化，以清除未转导的细胞，同时维持耐药报告细胞的存活率。由于不同细胞类型对慢病毒转导和抗生素筛选的敏感性存在差异，因此在建立稳定报告细胞系之前，应对这两个参数进行经验性优化。16HBE14o− 细胞系是一种永生化的人支气管上皮细胞系，因其可形成功能性紧密连接并分泌黏液，被广泛用于气道炎症研究8,23。用于构建报告系统的细胞应表达功能性的 IL-4 和 IL-13 受体，并保持完整的下游 JAK–STAT 信号通路24。在建立稳定报告细胞系之前，应通过以下方式验证报告基因载体的功能：确认其对细胞因子刺激具有响应性、可被通路特异性抑制剂所抑制，并在选定的实验条件下不产生细胞毒性效应。这些验证步骤有助于确保报告基因活性的变化真实反映 STAT6 依赖性信号通路的激活，而非非特异性的细胞应激反应。

该方法也存在一些局限性，应予以考虑。慢病毒载体随机整合到宿主基因组中，可能导致不同克隆间基础报告基因活性、可诱导性以及长期表达稳定性的差异。此外，由于该检测方法测量的是STAT6响应性启动子的激活情况，因此无法直接评估上游受体的激活状态或下游内源性信号事件。稳定报告细胞的长期培养还可能导致表观遗传沉默或转基因表达水平下降。为尽量减少这些影响，应建立早期传代的主细胞库，并在规定的传代范围内定期验证报告基因的响应能力。此外，该检测尚未在原代人支气管上皮细胞中或完全自动化的高通量筛选平台上得到验证。最后，本研究中评估的环境毒物仅代表概念验证性质的化合物组合，而非全面的化学文库。

空气污染，尤其是细颗粒物（PM2.5），由化学和物理性质各异的多种组分构成的复杂混合物，包括黑碳、无机盐、多环芳烃和重金属12,13。由于排放源和大气过程的差异，颗粒物的组成存在显著变化，这可能导致不同的不良健康效应。因此，在流行病学和体内研究中，确定引发过敏反应的具体组分仍具挑战性。本研究中描述的STAT6报告基因检测方法提供了一种实用的体外平台，可用于筛选单个空气毒物、源解析颗粒物提取物或化学定义的颗粒组分对STAT6的调节活性。该方案有助于在机制研究中优先选择候选毒物，并支持对复杂空气污染混合物进行以风险为导向的评估。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由泰国国家研究理事会（NRCT）（资助编号：N42A680388）资助，本研究项目由玛希隆大学（2025年战略研究基金）（资助编号：35）支持。图1和图2使用BioRender.com创建（Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200072细胞解离试剂
15 mL 圆锥形离心管CorningCLS430791无菌聚丙烯离心管
16HBE14o- 人支气管上皮细胞系由泰国宋卡王子大学 Nawiya Huipao 博士和美国加州大学旧金山分校 Dieter C. Gruenert 教授惠赠RRID:CVCL_0112人支气管上皮细胞系（传代次数 35–40）；经确认无支原体污染，保留分化气道上皮形态及屏障特性。参考文献：Cozens AL, 等. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
24 孔透明平底组织培养处理板Corning3527细胞培养板
6 孔透明平底组织培养处理板Corning3516细胞培养板
96 孔透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板Corning3599细胞活力检测板
96 孔白色透明底聚苯乙烯组织培养处理微孔板Corning3610发光检测板
AC-4-130（STAT5 抑制剂）MedChemExpressHY-124500选择性 STAT5 抑制剂
AS1517499（STAT6 抑制剂）MedChemExpressHY-100614选择性 STAT6 抑制剂
苯并[b]荧蒽AccuStandardH-128N多环芳烃
II 级生物安全柜NuaireNU-543-400E用于无菌细胞培养操作
氯化镉（CdCl2）Sigma202908重金属化合物
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）MedChemExpressHY-K0301细胞活力检测
细胞培养瓶，25 cm²（T-25）Corning430639组织培养瓶
CO2 培养箱NuaireNU-5710E维持在 37 °C、5% CO2、湿润气氛中
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2650溶剂（终浓度 0.1%）和冷冻保护剂（10%）
胎牛血清（FBS）SigmaF7524培养基添加剂（10%）和冻存液成分（10%）
血细胞计数板BOECOBOE14手动细胞计数
倒置相差显微镜ZEISSPrimovert细胞形态观察
荧光素酶检测试剂系统（ONE-Step）BPS Bioscience60690荧光素酶报告基因检测
氯化汞（HgCl2）Sigma215465重金属化合物
微孔板读板仪BioTekSynergy Neo2由 Gen5 软件（v3.08.01）控制的多功能微孔板读数仪/发光检测仪。在 15–20 秒线性振荡后，于 450 nm 波长测定吸光度，650 nm 作为参比波长。在 20 秒线性振荡后，使用 120 增益设置以终点模式测定发光值。
最低必需培养基（MEM）Gibco11095-080基础培养基
硫酸镍（NiSO4）东京化成工业N1203重金属化合物
颗粒物（PM）美国国家标准与技术研究院SRM 2975颗粒物标准参考物质
青霉素-链霉素（100×）Gibco15140122抗生素添加剂（终浓度 1%）
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco18912014洗涤缓冲液
聚凝胺SigmaTR-1003-G慢病毒转导增强剂
嘌呤霉素MedChemExpressHY-B1743A用于稳定细胞筛选的抗生素
重组人 IL-13Thermo Fisher ScientificA42526用于刺激的细胞因子
重组人 IL-4Thermo Fisher ScientificA42602用于刺激的细胞因子
STAT6 荧光素酶报告基因慢病毒BPS Bioscience78799慢病毒报告载体；储存液滴度为 5 × 107 TU/mL
Stattic（STAT3 抑制剂）MedChemExpressHY-13818选择性 STAT3 抑制剂

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气道上皮细胞STAT6信号通路荧光素酶报告基因IL-4刺激IL-13刺激Z因子分析慢病毒转导

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