膜蛋白功能化聚合物及聚合物/脂质杂化大单层和巨单层囊泡的制备

摘要

本方案展示了通过去垢剂介导，将膜蛋白——细胞色素bo3泛酚氧化酶——重组到由PDMS-g-PEO制备的大单层囊泡中，并通过融合-电形成法将其转化为巨大囊泡。所获得的功能性聚合物基区室适用于高级生化与生物物理研究。

摘要

由两亲性嵌段共聚物单独形成或与磷脂混合形成的囊泡，相较于传统的脂质囊泡，具有更优异的机械和化学稳定性。这使其成为一种极具吸引力的底盘平台，可进一步开发和拓展以实现特定应用，例如药物递送、诊断型生物传感、人工细胞构建以及仿生微米和纳米反应器。特别是，通过膜蛋白的整合实现功能化，对其中许多应用至关重要。本文介绍了一种通过去垢剂介导的重组方法，制备由接枝共聚物PDMS-g-PEO构成的膜蛋白功能化大单层囊泡（LUVs）的实验方案。此外，我们还描述了如何通过融合-电致形成法将这些大囊泡转化为巨型单层囊泡（GUVs）。该方案涵盖膜蛋白的荧光标记、聚合物及杂化LUVs的制备、膜蛋白的重组、通过动态光散射（DLS）进行粒径分布分析、通过耗氧量测定评估蛋白活性、蛋白功能化GUVs的制备，以及通过共聚焦显微镜分析GUVs中蛋白插入和质子泵送活性。代表性结果表明，成功制备了单分散的蛋白-LUVs，其多分散指数（PDI）低于0.2，并生成了直径范围为5–35 µm的蛋白-GUVs。通过耗氧量测定证实了蛋白活性，在聚合物LUVs中为18.2 nmol/min/mL，在杂化LUVs中为26.9 nmol/min/mL。通过荧光强度定量了蛋白在GUVs中的插入情况，聚合物GUVs为20.6 ± 3.7 a.u.，杂化GUVs为26.2 ± 5.0 a.u.。通过包封的pH敏感性染料监测GUVs中的质子泵送活性，结果表明蛋白功能得以保持，且以内向质子泵送为主。该共聚物的机械柔软性及类脂双层厚度（约5.3 nm）有利于膜蛋白的高效插入并维持其功能活性。

引言

两亲性嵌段共聚物可在水溶液中自组装形成膜结构，这些膜会自发弯曲并闭合，构成球形的、由膜包封的区室，称为聚合物体（polymer vesicles，简称 polymersomes）。与脂质膜相比，基于聚合物的区室具有更高的化学多样性以及增强的化学¹和机械稳定性²，因此在药物递送、纳米和微米反应器以及构建耐用的人工细胞等应用中极具吸引力。我们课题组及其他研究团队已通过插入膜蛋白对聚合物膜进行功能化，以构建人工细胞器和人工细胞^{1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}。含有聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane), PDMS）疏水核心的聚合物尤其适用于膜蛋白的整合，因其具有高度的链段柔韧性，并且可调节膜的疏水层厚度，以更好地匹配蛋白质的跨膜结构域⁵。尽管本实验室主要聚焦于接枝共聚物聚二甲基硅氧烷-接枝-聚环氧乙烷（PDMS-g-PEO），该共聚物可形成高度动态的膜结构^4,16,17，其刚性低于传统脂双层，膜厚约为 5.3 nm¹；而其他研究组则成功使用了基于 PDMS 的三嵌段共聚物，如 PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA^{5,6,7,8,9,10,11} 和 PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹²，用于膜蛋白的重构。即使是相对刚性的二嵌段共聚物（如 PBD-b-PEO），特别是在与脂质混合的杂化体系中，也已被成功用于膜蛋白的整合¹³。这些实例凸显了基于聚合物的膜作为蛋白重构平台的广泛适用性，同时还能为整合的膜蛋白提供增强的化学稳定性¹和更长的功能寿命¹⁴。尽管聚合物/脂质杂化膜在化学稳定性方面可能无法始终媲美纯聚合物体系¹，但它们提供了一种理想的折中方案，即结合了聚合物的机械强度与脂质的生物学相关性。由此形成的膜环境更接近天然生物膜，同时保留了合成材料的关键优势。此类杂化结构还可带来额外优势，包括因纳米尺度重排¹和膜内结构域形成¹⁵而降低的质子通透性。

已有多种技术可用于将膜蛋白重构至纳米级囊泡（LUVs）中，包括有机溶剂介导的重构法（如反相蒸发法、脂质-蛋白薄膜再水化）、机械法（如超声处理、French压滤法、冻融循环）以及去垢剂介导的重构法（通过去除去垢剂、稀释或直接掺入）。¹⁸以及更新的策略，例如直接从苯乙烯-马来酸共聚物纳米盘转移¹⁹虽然已有通过直接插入法将孔蛋白成功整合到聚合物大单层囊泡（LUVs）中的报道，例如在水合过程中将蛋白质添加至聚合物膜中⁸这种方法通常导致较大或更复杂的膜蛋白插入效率较低，并且常常引起蛋白质方向的随机性。因此，去垢剂介导的重建方法仍然是应用最广泛的技术，该方法包括先可控地加入去垢剂，随后将其去除。对于将较大的膜蛋白整合到基于聚合物的大单层囊泡（LUVs）中，特别是对于功能依赖于定向控制的不对称蛋白，该方法也是首选策略。在此方法中，首先用所选的去垢剂使囊泡膜达到饱和（饱和去垢剂浓度记为 R）_饱和），部分溶解（囊泡与胶束共存），或完全溶解，即分解为胶束（去垢剂浓度记为 R_溶剂随后进行蛋白质添加、孵育及去污剂去除的初始膜处理步骤¹⁸后者可通过透析、尺寸排阻色谱或吸附到疏水性聚苯乙烯珠（如 Bio-Beads）上实现。去垢剂的选择、其浓度以及去除方法需针对每种膜类型和蛋白质进行优化，以最大化包埋效率并控制蛋白质取向。²⁰.

虽然大单层囊泡（LUVs）适用于整体活性测量，但单囊泡研究和基于光学显微镜的分析则需要将膜蛋白重建到巨型单层囊泡（GUVs）中。目前有五种主要方法用于将蛋白质整合到GUVs中：在蛋白质和有机溶剂存在下共形成²¹、在去垢剂存在下共形成²²、通过去垢剂稀释将蛋白质插入预先形成的GUVs中²³、通过与蛋白脂质体（proteo-LUVs）膜融合插入^16,24，以及融合-电形成法²⁵。尽管这些方法已成功应用于脂质GUVs，但将其应用于聚合物或聚合物/脂质杂化GUVs时往往面临挑战。特别是共形成法和去垢剂稀释法在聚合物膜中的插入效率通常较低，或与某些聚合物组成不兼容¹⁵。基于融合的策略^{4,16,24,26,27}依赖额外的促融合试剂，也可能存在问题，因为合成的阳离子脂质/聚合物或促融合肽可能破坏膜蛋白的稳定性、改变膜的性质，或降低目标蛋白的整合效率。融合-电形成法克服了上述许多局限性，已被证明是一种将膜蛋白高效、稳健地整合到聚合物及聚合物/脂质杂化GUVs中的有效方法^1,5,15。该方法能够在保持膜完整性和蛋白功能的同时实现对蛋白整合的可控性，因此特别适用于制备功能化膜蛋白的聚合物GUVs。

将质子泵重构到基于聚合物的囊泡中对于构建耐用的人工细胞至关重要，因为它能够产生跨膜质子梯度——这是生命系统的基本能量载体。通过在可控的最小膜环境中重现化学渗透能量转换²⁸，这些囊泡可驱动ATP合成、主动运输和代谢反应，从而建立实现自主、类生命功能所需的能量基础。在这些系统中使用的一种代表性质子泵是来自大肠杆菌（E. coli）的细胞色素bo₃ 氧化酶，这是一种末端呼吸酶，可将氧气还原与跨膜质子转运相偶联。由于电子传递与质子泵送过程紧密偶联，其在合成囊泡中的活性可通过氧气消耗量^1,20或通过监测质子梯度的形成¹进行定量检测。

在本方案中，我们介绍了一种基于PDMS-g-PEO的大单层囊泡（LUVs）的详细制备流程，包括纯聚合物膜及聚合物/脂质杂化膜的制备、膜蛋白的功能化修饰、扩增为大单层囊泡（GUVs），以及通过整体耗氧检测和单囊泡质子泵活性测量，对重组的质子泵细胞色素bo₃氧化酶进行活性测定。

方案

注意：本方案中产生的所有危险化学废弃物必须根据机构和当地法规进行处置。

1. Bio-Beads SM-2 的准备

注意：在进行去垢剂吸附之前，Bio-Beads SM-2 已预先用甲醇洗涤，以去除防腐剂和有机污染物。

1. 将滤纸放入置于洁净玻璃烧杯或烧瓶上方的玻璃漏斗中。
2. 向漏斗中加入至少 600 mg 的 Bio-Beads SM-2（足以完成杂交型和聚合物型大单室脂质体的三次重建）。
   注意：每次重建至少需要 90 mg 的 Bio-Beads SM-2，具体见步骤 4.4.1。若计划进行更多次重建，可准备更大用量。
3. 用纯甲醇清洗珠粒三次，每次使用足量甲醇完全浸没珠粒。
   警告：所有涉及甲醇的操作均须在化学通风橱中进行。
4. 立即用 Milli-Q 水清洗珠粒三次，以去除残留的甲醇。
   注意：清洗过程中切勿使珠粒变干。每次移除洗涤液时，应确保珠粒保持湿润，不得完全干燥。
5. 将清洗后的珠粒转移至合适的储存容器中（例如，带有紧密密封盖的无菌 50 mL 聚丙烯离心管或玻璃瓶），加入 Milli-Q 水直至完全浸没珠粒，并于 4 °C 下保存，最长可保存 3 个月。

2. 膜蛋白的荧光标记

1. 蛋白质稀释
   1. 将细胞色素 bo₃ 氧化酶溶解于含 0.05% 十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM，w/v）的 20 mM HEPES 缓冲液中，浓度为 2.2 mg/mL，pH 8.3。此 pH 值可确保有足够比例的未质子化（反应性）伯胺，从而实现高效标记。
      ​注意：使用 ATTO N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）染料进行最佳标记时，应将缓冲液 pH 值维持在 8.3 至 8.5 之间。对于其他染料，请遵循制造商关于蛋白质偶联的说明，包括推荐的标记条件。
2. 染料添加
   1. 将八倍摩尔过量的胺反应性 ATTO 643 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯（溶于无水 DMSO，浓度为 2 mg/mL）加入蛋白质溶液中。
      ​注意：对于其他染料，请遵循制造商关于蛋白质偶联的说明，包括推荐的染料与蛋白质摩尔过量比。
   2. 轻轻敲击微量离心管三次，以确保染料均匀分布。
3. 孵育
   1. 将反应混合物在避光条件下于恒温混匀仪中室温（20–25 °C）孵育 1.5 小时，轻柔振荡（250 rpm），以防止光漂白。
4. 去除未结合染料
   1. 使用 ÄKTA 纯化系统，以 0.3 mL/min 的流速，用至少 2 倍柱体积（约 48 mL）的膜蛋白洗脱缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.5，200 mM KCl，0.05% DDM（w/v））平衡 Superdex 200 10/300 GL 柱（柱体积：23.562 mL）。
      注意：为去除过量荧光染料，通常使用较短的凝胶过滤柱（10–20 cm 床高）即可，尤其适用于疏水性较强的染料。染料制造商建议使用 Sephadex G-25 基质进行脱盐。本研究因仪器可用性而采用 Superdex 200 10/300 GL 柱。
   2. 使用 1 mL 毛细管环进样，最多上样 500 µL 标记后的蛋白质，并以相同缓冲液在 0.3 mL/min 流速下洗脱。
   3. 通过检测 280 nm 处的吸光度（蛋白质）和 643 nm 处的吸光度（ATTO 643 染料）监测洗脱过程。
   4. 在 1.5 倍柱体积范围内收集 0.5 mL 的洗脱组分。鉴定同时含有蛋白质和染料的组分。若浓度过高可直接使用，否则使用 Amicon 离心过滤装置浓缩。使用 Amicon 滤器浓缩时，选择截留分子量为 30 kDa 的离心滤膜，在 4 °C 条件下以 14,000 × g 离心 30 分钟。
5. 蛋白质浓度与标记程度（DOL）测定
   1. 测定纯化后偶联物的吸光度光谱。
   2. 使用以下公式计算蛋白质浓度及每个酶分子平均结合的染料分子数：
      
      其中 A_max 表示偶联物在染料最大吸收波长（λ_abs；ATTO 643，λ = 643 nm）处的吸光度，A₂₈₀ 为 280 nm 处的吸光度（蛋白质吸收峰），ε_prot 为变性细胞色素 bo₃ 氧化酶的摩尔消光系数（184,720 M⁻¹cm⁻¹），ε_dye 为染料的摩尔消光系数（150,000 M⁻¹cm⁻¹），CF₂₈₀ 为 ATTO 643 在 280 nm 处吸光度的校正因子（0.04）。

3. 大单层囊泡（LUVs）的制备

1. 制备薄聚合物或聚合物/脂质膜
   1. 使用正向置换移液器配备耐溶剂吸头，或使用无漏气玻璃注射器，按照 表1 中列出的组分，将溶解于氯仿:甲醇（2:1, v/v）中的聚合物、脂质和荧光染料溶液转移至洁净的玻璃小瓶中。
      警告：所有溶剂操作均应在通风橱内进行，并佩戴防护手套和护目镜。
   2. 将小瓶直立，轻轻涡旋混合溶液，确保其均匀一致。
      警告：需谨慎调节涡旋速度，防止液体飞溅或喷出小瓶接触手部。
   3. 在通风橱中，用温和的氮气流吹扫约 1 小时，蒸发有机溶剂，直至在小瓶内壁形成均匀的薄膜（图1）。
      注意：调节氮气流速，使液体缓慢移动而不飞溅；过高的流速可能导致成膜不均。5–10 分钟后，可略微提高气流以确保完全干燥，并使囊泡混合物均匀铺展至小瓶底部。
2. 薄膜再水化
   1. 加入 1 mL 再水化缓冲液（1 mM Tris-HCl，pH 7.5，200 mM 蔗糖），使干燥薄膜再水化，最终两亲分子浓度为 5 mg/mL（对应聚合物囊泡为 1.67 mM，杂合囊泡为 2.14 mM）。若用于重构的为聚合物囊泡，则在再水化缓冲液中添加 0.1% 胆酸钠。
      警告：胆酸钠为轻度刺激物，避免皮肤长期接触及吸入粉末。请依照制造商提供的安全数据表（SDS）进行操作。
   2. 剧烈涡旋，直至薄膜完全脱离并悬浮，形成多层囊泡（MLVs）。
3. 冻融循环（仅适用于杂合囊泡）
   1. 对杂合 MLV 悬液进行五次冻融循环：将样品在液氮中冷冻 1 分钟，随后在 35 °C 水浴中完全融化，再使用管式振荡器在 2500–3000 rpm 下涡旋 30 秒。重复此过程共五次。
      注意：纯聚合物囊泡无需进行此步骤。
      警告：液氮（−196 °C）可导致严重低温灼伤。操作时应在通风良好的区域，并穿戴适当的个人防护装备（低温手套、护目镜和实验服）。避免接触皮肤和眼睛。
4. 挤出
   1. 将囊泡悬液转移至配备 100 nm 孔径聚碳酸酯膜的微型挤出器中。
   2. 挤出 21 次，以获得粒径均一的大单层囊泡（LUVs）。
      注意：确保最终一次挤出后，LUV 悬液位于与初始装样注射器相对的另一端注射器中。这可最大程度减少最终样品中混入较大囊泡或未完全通过膜的残留物质的污染。
5. 储存
   1. 将 LUV 悬液在 4 °C 下储存，并在一周内使用，以维持囊泡粒径分布，防止在含蔗糖缓冲液中发生聚集或微生物生长。
   2. 使用前，通过轻微涡旋使 LUV 悬液均匀化。

4. 将膜蛋白重组入大单层囊泡（LUVs）

1. 囊泡的去垢剂预处理
   1. 将 200 µL 大单层囊泡（LUVs）转移至 2 mL 微量离心管中（图 1）。若使用杂合型 LUVs，加入 1 µL 的 20% (w/v) 胆酸钠，使最终去垢剂浓度达到 0.1% (w/v)。若使用聚合物囊泡（polymersomes），则无需额外添加去垢剂，因胆酸钠已预先存在。
      ​注意：去垢剂储备液应使用与实验相同的缓冲液配制，以确保与囊泡的相容性。
   2. 通过轻轻敲击微量离心管三次进行温和混匀。避免剧烈震荡或涡旋，以防产生泡沫和引入气泡。
2. 将蛋白加入经去垢剂处理的囊泡
   1. 向经去垢剂去稳定的囊泡中加入细胞色素 bo₃ 氧化酶（用于活性测定）或细胞色素 bo₃ 氧化酶–ATTO 643（用于荧光成像），以达到以下最终蛋白浓度：对于聚合物囊泡，LUV 实验为 0.556 µM，GUV 实验为 1.112 µM；对于杂合囊泡，LUV 实验为 0.714 µM，GUV 实验为 1.428 µM。
      注意：这些浓度分别对应 LUVs 中蛋白与聚合物的摩尔比为 1:3,000，GUVs 中为 1:1,500。
   2. 在温和搅拌的同时缓慢加入蛋白，目的是使其在溶液中均匀分布，避免局部浓度过高。
      注意：由于不同蛋白储备液浓度存在差异，所加蛋白体积可能有所不同。
3. 蛋白–去垢剂–聚合物复合物的组装
   1. 将混合物在 4 °C 下于恒温混匀仪中以 400 rpm 轻柔振荡孵育 30 分钟，以促进在去除去垢剂前形成蛋白–去垢剂–聚合物混合组装体。
4. 去除去垢剂
   1. 通过分步加入 Bio-Beads SM-2（Bio-Rad）去除去垢剂。从储存液中取出 30 mg Bio-Beads，确保其保持湿润状态（湿润但无过量液体）。将珠粒加入样品中，并在 4 °C 下以 600 rpm 轻柔振荡孵育 30 分钟。重复此步骤两次，共使用 90 mg Bio-Beads，总孵育时间为 1.5 小时。
      注意：仅使用充分水合的 Bio-Beads。切勿转移干燥的珠粒、附着在 Bio-Beads 储存管管壁上的珠粒或漂浮在液面上的珠粒。若加入后珠粒附着在重构反应管液面以上的管壁上，可短暂离心（例如，在台式小型离心机中离心 3–5 秒），使珠粒沉降至管底后再进行孵育。
   2. 使用台式小型离心机在 2,000 × g 下离心 2 分钟，使 Bio-Beads 沉淀。小心收集上清液，避免扰动珠粒沉淀。
      注意：除离心外，也可让珠粒在静置条件下自然沉降约 5 分钟，随后小心移走上清液。
5. 储存
   1. 将重构后的 bo₃-LUVs 储存于 4 °C，并于同日内用于蛋白活性测定。

5. 通过动态光散射（DLS）测定大单层囊泡（LUVs）的尺寸和分散度

1. 用于DLS测量的LUV加载
   1. 将45 µL未稀释的LUV或蛋白-脂质体（proteo-LUV）悬浮液转移至洁净的石英比色皿中。确保比色皿无灰尘、指纹或其他残留物，以尽量减少光散射伪影。
      ​注意：避免引入气泡，因为气泡会干扰DLS测量。为防止产生气泡，应沿比色皿壁缓慢移液，且不要用力排出最后一滴液体。若出现小气泡，请等待其上升并消散后再进行测量。
2. 通过DLS测定LUV的尺寸和分散性
   1. 使用配备633 nm氦-氖激光器和背向散射检测（固定角度为173°）的DLS仪器，测量流体动力学直径和多分散系数（PDI）。
   2. 每份样品至少进行三次独立测量，以确保可重复性。
   3. 采用通用（正态分布）模型分析数据，获得平均粒径和PDI。

6. 大型单层囊泡耗氧量分析

1. 温度设置
   1. 将克拉克型氧电极系统的测量室设定为 22 °C，并使系统达到平衡。
2. 缓冲液的添加
   1. 向测量室中加入 1 mM Tris-HCl (pH 7.5)、200 mM 蔗糖缓冲液，总体积为 1,000 µL。根据样品类型调整缓冲液体积：聚合物 bo₃-LUVs 使用 942.9 µL，杂化 bo₃-LUVs 使用 953.7 µL。
      ​注：剩余体积将由 LUVs 和 DTT/Q₁ 混合物填充，以达到最终测量体积。
3. LUVs 的添加
   1. 向测量室中加入 bo₃-LUVs，并在 22 °C 下以 100 rpm 的速度启动磁力搅拌器进行轻柔搅拌。调整 bo₃-LUVs 的体积，使理论上的 bo₃ 氧化酶浓度约为 27 nM：聚合物 bo₃-LUVs 为 48.6 µL，杂化 bo₃-LUVs 为 37.8 µL。
      ​注：对于阴性对照，用相同脂质/聚合物组成和浓度的无蛋白 LUVs 等体积替代 bo₃-LUVs。后续所有步骤保持不变。
4. 基线测量
   1. 让氧浓度稳定，在 22 °C 恒定搅拌条件下测量 3 分钟，以获得稳定的基线。
5. 还原剂/醌混合物的制备
   1. 使用前立即新鲜配制 DTT/Q₁ 混合物：将 9.6 µL 的 1 M DTT 溶于 Milli-Q 水中，与 0.6 µL 的 80 mM 泛醌-1 (Q₁) 溶于 DMSO 中混合，然后充分涡旋以确保均匀。
6. 酶活化
   1. 通过向测量室中加入 8.5 µL 新鲜配制的 DTT/Q₁ 混合物来激活 bo₃ 氧化酶，最终浓度为 8 mM DTT 和 40 µM Q₁。
7. 重复实验
   1. 每份样品测量三次，以确保可重复性。
8. 数据分析
   1. 绘制氧浓度随时间变化的曲线。确定曲线线性部分的斜率，该斜率对应于氧消耗速率。
9. 结果报告
   1. 以三次测量的平均值及其标准偏差报告氧消耗速率。

7. 蛋白质功能化大单层囊泡的制备

1. ITO 涂层玻璃片的等离子清洗
   1. 将氧化铟锡（ITO）涂层玻璃片放入等离子清洗仪中，导电面（ITO 涂层侧）朝上。在高功率设置（“HI”，230 V，最大射频功率 18 W）和约 0.5 mbar 压力下进行等离子清洗 1 分钟。
      ​注意：可通过观察腔室内出现粉红色/紫色辉光来目视确认等离子体是否成功点燃。
2. 蛋白脂质大单层囊泡（proteo-LUVs）的部分脱水
   1. 将 20 µL 无蛋白脂质大单层囊泡（LUVs）与 20 µL 含有重组 bo₃ 氧化酶-ATTO 643 的蛋白脂质大单层囊泡（proteo-LUVs）混合。轻轻涡旋以确保均匀混合。
   2. 将所得的 5 mg/mL LUV/proteo-LUV 悬液以每滴 2 µL 的体积，在用于电形成实验的每张载玻片的导电面（ITO 涂层侧）上滴加七滴（图 2A）。将液滴均匀分布在 160.6 mm² 的表面上，保持彼此分离，以促进形成均匀的薄膜。
      注意：对于其他聚合物体系，LUV 浓度和液滴体积可能需要优化（典型范围：5–100 mg/mL LUVs；0.2–2 µL 液滴）。
   3. 在室温（约 22 °C）和约 20% 湿度条件下使液滴部分脱水约 40 分钟，或直至液滴边缘出现白色环状结构（图 2B）。
      ​注意：脱水过程依赖环境湿度。若相对湿度高于 40%，需相应延长脱水时间（最多延长 20 分钟）。终点应根据液滴边缘是否出现白色环状结构来判断，而非固定时间。在稳定的环境条件（温度和湿度）下，所需脱水时间具有可重复性。避免过度干燥，表现为液滴完全扁平且整体呈均匀白色，这可能导致蛋白质沉淀。
3. 电形成腔室的组装
   1. 通过将两张 ITO 涂层玻璃片（涂层面向内）夹住一个厚度为 1.81 mm 的硅胶垫片来组装电形成腔室，垫片一侧有切口，便于在填充和收集过程中加入或移除缓冲液。
   2. 用再水化缓冲液（1 mM Tris-HCl，pH 7.5；200 mM 蔗糖）填充腔室。
      对于 pH 敏感实验，向缓冲液中加入 10 µM 吡喃（8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，HPTS）。
4. 电形成
   1. 施加正弦交流电场，程序如下：50 Hz 下依次施加 50、100、200、300、500、700 和 900 mV，每个电压持续 6 分钟；随后在 50 Hz 和 1.1 V 下持续 2 小时。
      ​注意：为促进形成更大的蛋白巨型脂质囊泡（proteo-GUVs），此步骤可延长至 12 小时，并在脱离步骤中使用 4 Hz 和 2 V 持续 30 分钟。当缓冲液中含有 10 µM 吡喃（pyranine）时，在前两个电压梯度阶段应将频率提高至 500 Hz。
5. GUVs 的收集
   1. 使用镊子小心打开腔室，并使用 FineTip Ultra-Micro Pastette 移液器（或等效的低剪切力转移移液器）收集 GUVs，以尽量减少机械应力。
      注意：避免使用标准的低于 200 µL 的低体积移液器吸头，因其可能破坏较大的 GUVs。作为替代方案，可将标准吸头末端剪开以扩大开口，从而在收集过程中降低剪切力。
6. 储存
   1. 将蛋白巨型脂质囊泡（proteo-GUVs）在 4 °C 下保存，并在 48 小时内使用，以保持蛋白质活性。
      注意：活性丧失速率取决于所重构膜蛋白的类型和稳定性，以及膜的组成。

8. 蛋白质功能化GUVs的显微镜观察

1. 显微镜设置
   1. 打开共聚焦显微镜。若使用徕卡（Leica）系统，请启动 LAS X 软件；对于其他品牌的显微镜，请使用制造商推荐的图像采集软件。
   2. 选择63×油浸物镜（NA 1.40）；根据GUV大小，必要时可调整为更高或更低的放大倍数。
   3. 打开两个对应于荧光染料的成像通道：Rhodamine Red（膜）和 ATTO 643（重组蛋白）。
      注意：对于光谱部分重叠的荧光染料，应选择适当的激光线和窄带检测窗口，以最大限度减少光谱串扰。应依次采集每个通道，以防止信号渗漏，确保荧光定量的准确性。
2. GUV的沉降
   1. 将压密封硅胶隔离器置于洁净的1.5号玻璃盖玻片（厚度0.17 mm）上。
      注意：对于直立式（非倒置）显微镜，可使用较厚的玻璃载片。
   2. 用移液器将60 µL缓冲液（1 mM Tris-HCl，pH 7.5；200 mM葡萄糖）加入间隔层中央。
   3. 轻轻将20 µL GUV悬液加至缓冲液上方。
   4. 立即用第二块玻璃盖玻片覆盖腔室，以避免蒸发。
   5. 让GUVs沉降约5分钟，然后成像。
3. 图像采集
   1. 聚焦于腔室底部以捕获GUVs的横截面。
   2. 以系统扫描方式从腔室的左上角至右下角（“蛇形”模式）获取不同GUV的图像，以获得具有代表性的群体（约100个GUV）。扫描过程中遇到的所有囊泡均需成像，不得进行预先筛选，无论其大小或荧光强度如何，以避免选择偏差并确保可重复性。
      注意：避免对同一GUV进行重复成像，以防止光漂白。
4. 图像分析
   1. 通过沿单个GUV的膜绘制折线，定量重组的ATTO 643标记蛋白的荧光强度。使用LAS X软件时，选择“定量”→“线轮廓”，然后选择折线工具并沿每个GUV的膜进行描迹。为获得平均荧光强度，打开“统计”并记录平均值。仅分析清晰的单层GUV；排除多囊泡囊泡和聚集的囊泡。
      注意：如果在不同日期获取测量数据，应将荧光强度根据激光功率进行归一化处理，激光功率需在相同的成像设置（波长和标称功率）下测定。为校正激光输出的逐日变化，采用以下归一化方法： ，其中 F_a.u. 以任意单位表示的测量荧光强度， P_参考文献 是参考日测得的激光功率，是采集当天测得的激光功率。该校正假设在非饱和照明条件下，激光功率与荧光强度之间存在线性关系。在本研究中，所有图像均在同一天采集，因此无需进行归一化处理。
   2. 以100个GUV的平均荧光强度及其对应的标准差进行报告。

9. 人造大单层囊泡中质子泵功能的分析

1. 显微镜设置
   1. 打开共聚焦显微镜并启动相应的图像采集软件（例如，Leica 系统使用 LAS X）。
   2. 选择 63× 油浸物镜（NA 1.40）。根据 GUV 的大小，必要时可调整为更高或更低的放大倍数。
   3. 设置三个对应于荧光染料的成像通道。对于罗丹明红（膜标记物），使用 561 nm 激发光，发射光范围为 570–620 nm；对于吡喃宁（包封的 pH 敏感性染料），使用 448 nm 和 405 nm 激发光，收集 499–551 nm 范围内的发射光。
      ​注意：如果具备 458 nm 激光器，建议使用该波长代替 448 nm，以激发吡喃宁的去质子化（碱性）形式。
   4. 调节激光功率和探测器增益，避免像素饱和并最小化光漂白。在整个实验过程中保持采集参数恒定。
2. GUV 沉降
   1. 向 8 孔腔室载玻片的一个孔中加入 280 µL 缓冲液（1 mM Tris-HCl，pH 7.5；200 mM 葡萄糖）（孔总容积约为 874 µL）。
      注意：加入体积不得少于 200 µL，否则会加剧蒸发和 pH 漂移；也不得超过 400 µL，以防溢出并确保移液操作方便。若使用其他类型的腔室，应相应调整体积。对于倒置显微镜，请使用适配 #1.5H 盖玻片厚度的腔室载玻片。
   2. 将 20 µL bo₃-GUV 悬液轻轻加至缓冲液表面，避免引入气泡。
      ​注意：作为阴性对照，将 bo₃-GUV 悬液替换为等体积（20 µL）的无蛋白 GUV，其脂质/聚合物组成相同，并在相同条件下制备和沉降。该对照用于排除 DTT 和 Q₁ 对吡喃宁荧光比值的非特异性影响，这些影响与 bo₃ 氧化酶活性无关。
   3. 让 GUV 沉降约 5 分钟后再进行成像。
3. 基线采集
   1. 聚焦于腔室底部 GUV 沉降的平面。
   2. 调整缩放倍数，使视野中包含 3–6 个 GUV。
   3. 在激活前连续采集所有通道的荧光信号，持续 5 分钟以记录基线。
4. 质子泵激活
   1. 使用前立即配制新鲜的 DTT–Q₁ 混合液：将 4.8 µL 的 1 M DTT 与 0.3 µL 的 80 mM Q₁（溶于 DMSO）混合，并通过涡旋充分混匀。
   2. 通过将 2.6 µL DTT–Q₁ 混合液轻轻加至溶液表面（移液枪头不得插入缓冲液中）来激活细胞色素 bo₃ 氧化酶，使腔室中 DTT 和 Q₁ 的终浓度分别约为 8 mM 和 40 µM。
   3. 在连续采集模式下监测囊泡内吡喃宁荧光 30 分钟。
5. 囊泡内吡喃宁荧光分析
   1. 对每个 GUV，在囊泡腔内定义一个感兴趣区域（ROI）。在 LAS X 软件中，进入 Quantify → Stack Profile，选择 Draw Ellipse，并在每个 GUV 内绘制圆形 ROI。
   2. 为确定在两种激发波长（448 nm 和 405 nm）下 499–551 nm 发射光的平均荧光强度，在软件中打开 Statistics 功能并记录平均值。
   3. 计算荧光比值 R = I₄₄₈/I₄₀₅。
   4. 将比值随时间作图，获得囊泡内 pH 变化的动力学曲线。

结果

这 E. coli 细胞色素 bo₃ 氧化酶由质粒pETcyo表达 E. coli 菌株 C43 (DE3) ΔcyoABCDE，并按先前所述方法纯化²⁹纯化 bo₃ 氧化酶可直接用于重组和活性测定，或使用荧光染料标记，例如 ATTO 643（本研究）或其他 ATTO 染料^1,15对于ATTO 643等高度亲水性染料，应使用30 cm色谱柱，以实现未结合染料与标记蛋白的有效分离（图3A）。标记程度（DOL）由吸收光谱计算得出，通常每种酶分子上的染料分子数在1.1–1.3之间，具体数值取决于所使用的ATTO染料。对于 bo₃ 标记有 ATTO 643 的氧化酶，其标记度（DOL）为 1.16（图3B).

对于蛋白质重构，首先通过薄膜水化法制备大单层囊泡（LUVs），随后进行冻融循环和挤出处理，以获得均一的囊泡尺寸。对于聚合物囊泡的制备，水化缓冲液中需添加去垢剂。在进行蛋白质重构之前，通过动态光散射分析囊泡的尺寸分布（图4，表2）。杂合囊泡和聚合物LUVs的平均直径通常为85–95 nm，尺寸分布较窄（PDI < 0.2）。基于PDMS-g-PEO的囊泡尺寸预计略小于挤出膜的标称孔径。典型的聚合物囊泡表现出高度均一的尺寸，PDI值低于0.1；而杂合囊泡形成的群体也具有较好的均一性，PDI值偶尔超过0.1，但始终低于0.2。

随后，在去垢剂（本研究中为胆酸钠）存在的情况下，将膜蛋白bo₃氧化酶插入大单室脂质体（LUVs）中。接着使用Bio-Beads去除去垢剂。重组完成后，聚合物囊泡的尺寸仅略有增加（图4A），而杂化囊泡的尺寸则保持不变（图4B）。在两种体系中，多分散系数（PDI）均出现轻微上升（表2）。此类微小的尺寸变化是可预期的，因为去垢剂介导的溶解与去除过程可能重新排列膜中的聚合物链。通过测定氧气消耗量来评估蛋白质活性，以判断蛋白质是否保留了功能活性（图5A）。无蛋白LUV阴性对照中未检测到氧气消耗，证实所观察到的信号特异性来源于bo₃氧化酶的活性。在本实验所用浓度下，通过胆酸钠介导的重组，杂化囊泡中的蛋白活性通常略高于聚合物囊泡（图5B）。不同纯化批次之间，甚至同一批次内的不同组分之间，蛋白活性均存在一定变异性。因此，在进行比较研究（例如比较不同膜体系中蛋白活性）时，应使用同一纯化组分的蛋白，以确保结果的一致性。

为了制备蛋白质功能化的PDMS-g-PEO以及PDMS-g-PEO/大豆PC GUV，采用了融合-电形成法。该方法中，将蛋白脂质体（proteo-LUVs）与不含蛋白质的LUVs混合后滴加到镀有ITO的玻璃片上，随后进行部分脱水，以促进囊泡融合并形成聚合物/蛋白质或聚合物/脂质/蛋白质薄膜。脱水不足会导致蛋白GUV产率降低、GUV尺寸变小，并残留未融合的（蛋白）LUVs。

通过共聚焦显微镜观察GUVs在蔗糖/葡萄糖密度梯度中沉降后的情况，证实了标记蛋白bo₃氧化酶–ATTO 643成功整合入膜（图6A，B）。使用简单的直线轮廓对膜相关荧光进行定量可能会产生偏差，因为测量的强度取决于所画线条的角度。为尽量减少这种影响，采用沿每个GUV整个膜轮廓绘制的折线来评估荧光强度。

为了评估囊泡大小与蛋白质整合之间的可能关联，平行分析了GUV的直径（图6C，D）。较大的GUV（大于20 µm）通常表现出较低的膜相关蛋白荧光强度，相较于较小的囊泡。这一现象可能归因于融合-电形成机制：较小的囊泡形成较早，可能更高效地整合蛋白质；而较大的囊泡来源于后续的融合事件和膜的生长，可能因与蛋白质含量较低的材料混合而导致稀释。

总体蛋白质的整合效率主要由大单层囊泡（LUVs）重构早期阶段的条件决定，特别是去垢剂的类型、浓度以及添加时机。对于聚合物LUVs，当去垢剂在囊泡形成后加入时，其蛋白质整合效率略低于在囊泡形成过程中（即再水化步骤）加入的情况，对应的荧光强度分别为18.9 ± 3.9 a.u.和20.6 ± 3.7 a.u.（图6C，D，左侧）。在杂合体系中，去垢剂是在囊泡形成后添加的，此时去垢剂浓度具有显著影响：将牛磺胆酸钠浓度从0.015%增加至0.1%，蛋白质整合显著提高（22.1 ± 5.2 a.u. 对比 26.2 ± 5.0 a.u.，图6C，D，右侧）。比较聚合物体系与杂合体系，通常在杂合GUVs中观察到bo₃氧化酶在膜上的整合程度略高。这可能是由于聚合物-脂质界面存在堆积缺陷，这些缺陷连同去垢剂诱导产生的缺陷，共同为膜蛋白提供了有利的插入位点。

通过第二次2小时的电形成步骤，bo₃氧化酶功能化的GUVs的平均直径约为14–15 µm（聚合物GUVs为13.5 ± 3.7 µm，杂化GUVs为15.4 ± 6.3 µm），尽管也存在明显更大的囊泡（图6C，D）。将第二次电形成步骤的持续时间延长至12小时，可整体增加GUV的尺寸^1,27。

融合-电形成方案还可通过在电形成过程中将染料加入再水合缓冲液，实现对水溶性物质（如pH敏感性染料（例如，吡喃素））的包封（图7A）。当存在水溶性染料时，所形成的囊泡其GUV尺寸通常会减小。为补偿此效应，初始电形成步骤中的频率应从50–500 Hz提高。

包封一种比率型 pH 敏感性染料（如吡喃宁），可实现对单个囊泡质子泵送的监测，并提供关于质子泵取向的信息。当囊泡腔内发生酸化时，吡喃宁在 448 nm 和 405 nm 激发下的荧光比值会下降。该比值反映了吡喃宁的质子化状态，因此与 pH 值相关。比率型测量具有优势，因其对染料包封效率的差异和光漂白效应不敏感。图 7B 展示了质子泵活性的一个示例：在添加电子供体 DTT 和电子介体 Q₁ 后，含有重组 bo₃ 氧化酶的杂合 GUV 中，囊泡内吡喃宁的荧光比值（I₄₄₈/I₄₀₅）出现下降。荧光比值在激活后约 1 分钟开始急剧下降，并在随后约 1 分钟内持续快速降低，之后在接下来的大约 18 分钟内减缓。这一行为表明，大多数 bo₃ 氧化酶分子的取向使得质子泵送方向朝向 GUV 内部。在相同条件下，不含蛋白质的 GUV 仅表现出较小的荧光比值下降，作为阴性对照，证实了在 bo₃-GUV 中观察到的更大幅度下降特异性来源于 bo₃ 氧化酶的质子泵活性，而非 DTT 和 Q₁ 对吡喃宁荧光比值的非特异性影响。

图 1．大单层囊泡（LUV）的制备、细胞色素 bo₃ 氧化酶膜蛋白在 LUV 中的重组，以及通过融合-电形成法制备功能化 bo₃ 氧化酶的大单层囊泡（GUV）的示意图。 LUV 通过薄膜水合、冻融循环以及通过孔径为 100 nm 的膜挤出法制备。细胞色素 bo₃ 氧化酶的重组在去垢剂存在下进行，随后使用 Bio-Beads 去除去垢剂。bo₃-GUV 的形成是将 bo₃-LUV 沉积到涂有氧化铟锡（ITO）的玻璃载片上，随后在电流存在下进行部分脱水和再水合。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 通过脱水形成融合的大单层脂质体（LUV）薄膜。 将七滴 2‑µL 混合的蛋白-大单层脂质体（proteo-LUVs）和大单层脂质体（LUVs）溶液滴加到涂有氧化铟锡（ITO）的玻璃载片上：（A）滴加后立即观察，以及（B）部分脱水后观察。请点击此处查看该图的放大版本。

图3荧光标记 细胞色素 bo₃ 氧化酶 (A色谱图（洗脱曲线） bo₃ 经Superdex 200 10/300 GL柱纯化的氧化酶-ATTO 643。灰色标示的组分被收集并随后浓缩。（B浓溶液的吸光度光谱 bo₃ 氧化酶-ATTO 643，在280 nm（蛋白质）、400 nm（血红素辅因子的Soret带）处显示吸收峰 bo₃ 氧化酶）和 643 nm（染料）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 4. 大单层囊泡 (LUVs) 在蛋白质重构前后的尺寸分布：（A）聚二甲基硅氧烷-接枝-聚环氧乙烷 (PDMS-g-PEO) 聚合物，以及（B）PDMS-g-PEO/大豆磷脂酰胆碱 (PC) 杂化囊泡。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5. 在大单层囊泡（LUVs）中重建的bo₃氧化酶的氧气消耗。 （A）加入二硫苏糖醇（DTT）和泛醌-1（Q₁）激活重建的细胞色素bo₃氧化酶后，氧气浓度随时间变化的代表性曲线。绿色曲线对应于蛋白质重建的LUVs，灰色曲线对应阴性对照（无蛋白质的LUVs）。（B）在聚（二甲基硅氧烷）-接枝-聚（乙二醇）（PDMS-g-PEO）以及PDMS-g-PEO/大豆磷脂酰胆碱（PC）LUVs中重建的bo₃氧化酶的氧气消耗速率（OCR）。柱状图表示三次独立测量的平均值±标准差（SD）（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6。 荧光标记的bo₃氧化酶插入巨型单层囊泡（GUVs）。 （A）聚二甲基硅氧烷-接枝-聚环氧乙烷（PDMS-g-PEO）和（B）PDMS-g-PEO/大豆磷脂酰胆碱（PC）GUVs 的代表性显微图像（膜用磷脂酰乙醇胺-罗丹明（PE-Rho）标记，红色），其中包含重组的细胞色素bo₃氧化酶-ATTO 643（品红色）。不同重组条件下，bo₃氧化酶-ATTO 643 荧光强度随 GUV 尺寸变化的定量分析（N = 100）：（C）向预先形成的聚合物大单层囊泡（LUVs）中加入 0.2% 胆酸钠（SC），向预先形成的杂化 LUVs 中加入 0.015% SC；（D）在 0.1% SC 存在下形成聚合物 LUVs，以及形成后用 0.1% SC 处理的杂化 LUVs。数据表示单个 GUV 的荧光强度（每种条件 N = 100）。平均值 ± 标准差（SD）在正文中有报告。比较为描述性；未进行正式的统计学检验。a.u.（任意单位）。比例尺 = 20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7质子泵送由 bo₃ 在巨大单层囊泡（GUVs）中重建的氧化酶。 (A聚二甲基硅氧烷的代表性荧光显微照片-移植物-聚（乙烯氧化物）（PDMS-g-PEO)/大豆磷脂酰胆碱（PC）GUVs，膜上用0.05 mol%磷脂酰乙醇胺-罗丹明（PE-Rho，红色）标记，含有重组的细胞色素 bo₃ 氧化酶和包埋的pH敏感性染料吡喃灵（激发波长405和448 nm；蓝色和绿色通道），沉降于带腔室的玻片中。B) 使用二硫苏糖醇（DTT）和辅酶Q1（ubiquinone-1，Q）激活后，囊泡内吡喃荧光比率的变化₁) 在 PDMS 中g-含重建的PEO/大豆PC GUVs bo₃ 氧化酶。绿色曲线对应蛋白质重构的GUVs，灰色曲线对应阴性对照（无蛋白质GUVs）。曲线表示均值 ± 标准差（SD）（n = 3个囊泡）。比例尺 = 20 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

	组分	储备液浓度	用量	最终膜组成
聚合物囊泡	PDMS-g-PEO 溶于氯仿:甲醇 (2:1, v/v)	10 mg/mL	499.9 µL	99.95 mol%
	PE-罗丹明溶于氯仿	1 mg/mL	1.1 µL	0.05 mol%
杂化囊泡	PDMS-g-PEO 溶于氯仿:甲醇 (2:1, v/v)	10 mg/mL	450.1 µL	70 mol%
	大豆磷脂酰胆碱 (95%) 溶于氯仿	10 mg/mL	49.8 µL	29.95 mol%
	PE-罗丹明溶于氯仿	1 mg/mL	1.4 µL	0.05 mol%

表1：用于制备大单层囊泡（LUV）的薄膜所用储备液及其体积。 储备液浓度以 mg/mL 表示。体积按总薄膜两亲物浓度为 5 mg/mL 计算。最终膜组成以摩尔百分比（mol%）表示。PDMS-g-PEO：聚二甲基硅氧烷-接枝-聚乙二醇；PE-Rhodamine：磷脂酰乙醇胺-罗丹明；soy PC：大豆磷脂酰胆碱；v/v：体积/体积。

	重建条件	直径 (nm)	PDI
聚合物囊泡	重建前	84.34 ± 0.22	0.084
	重建后	100.73 ± 0.81	0.109
杂化颗粒	重建前	89.21 ± 0.77	0.129
	重建后	85.01 ± 0.42	0.17

表2： 重组前后聚合物囊泡（聚二甲基硅氧烷-接枝-聚环氧乙烷，PDMS-g-PEO）和杂化囊泡（PDMS-g-PEO/大豆磷脂酰胆碱（PC））的平均囊泡尺寸和多分散系数（PDI）。 数据为三次独立测量的平均值。

讨论

与传统的脂质体相比，聚合物囊泡（polymersomes）以及聚合物/脂质杂化囊泡具有更高的化学和机械稳定性，因此在药物递送、生物传感、纳米和微米反应器以及人工细胞等应用中极具吸引力。然而，由于其独特的膜结构和生物物理特性，通常难以将针对脂质体优化的实验方案直接应用于基于聚合物的体系^15,20,30。本文所述方案针对这些差异进行了优化，提供了一套完整的膜蛋白重构流程，可将膜蛋白重组到基于PDMS-g-PEO的聚合物及杂化大单层囊泡（LUVs）中，并通过融合电致形成法进一步扩增为大单层囊泡（GUVs）。

该实验方案中的一个关键步骤是制备具有窄且可重复尺寸分布的大单层囊泡（LUVs）。与脂质膜类似，PDMS-g-PEO 膜在用水性缓冲液再水化时会自组装形成囊泡。与通常产生单层和多层囊泡混合物的脂质体系不同，PDMS-g-PEO 优先形成单层结构¹，因此无需采用冷冻-解冻循环来降低脂质制备物中的多层性。通过挤出法可标准化囊泡的尺寸分布。由于 PDMS-g-PEO 膜相对于脂双层具有更高的柔软性¹，因此仅需较低的挤出压力即可。尽管制造商推荐的11次挤出通常已足够，但增加挤出次数通常可获得更窄的尺寸分布并提高重复性。然而，过度挤出可能导致囊泡尺寸略小于膜的标称孔径。多次挤出还可能因材料损失而降低囊泡产率；我们此前发现，在通过100 nm膜进行21次挤出后，约有31%的PDMS-g-PEO和25%的PDMS-g-PEO/大豆PC囊泡材料损失¹。因此，应优化挤出次数，以在尺寸均一性、囊泡完整性和产率之间取得平衡。

去垢剂介导的重构是决定成功与否的另一个关键因素。最佳的去垢剂类型和浓度取决于特定的膜蛋白以及膜的组成^3,20。对于纯聚合物膜而言，在饱和条件最优的情况下，将去垢剂加入薄膜水化过程中，比对预先形成的囊泡进行饱和处理能获得更高的插入效率。更刚性的聚合物膜（例如由PBD-b-PEO形成的膜）需要显著更高的去垢剂浓度才能实现膜的溶解³⁰，这凸显了针对不同聚合物进行特异性优化的必要性。成功的蛋白插入不仅应通过活性测定（与去垢剂胶束或脂质囊泡相比）来验证，还应通过结构分析（如冷冻透射电镜）来评估插入深度以及膜对疏水不匹配的适应情况¹。蛋白取向同样至关重要，特别是对于质子泵而言，因为功能性质子梯度的建立要求大多数质子泵具有统一的取向。理想情况下，质子泵应将质子向内运输，以便与消耗梯度的过程（如ATP合成）相偶联^3,15。可通过蛋白标签来评估取向，例如选择性淬灭暴露于囊泡外表面的荧光染料，或置换连接在His标签上的荧光标记²⁰。这些方法作为实验方案优化的一般性建议提出，但在本研究中并未实施。

通过融合-电形成法从蛋白脂质体（proteo-LUVs）扩增至大单层囊泡（proteo-GUVs）时，需严格控制沉积与脱水参数。LUVs的浓度和液滴尺寸对最终GUV的产率和纯度具有关键影响。LUVs浓度过高（≥10 mg/mL）会导致未融合的LUVs残留在最终样品中；而浓度过低（<5 mg/mL）则因沉积材料不足而降低GUV产率。脱水过程应为部分脱水而非完全脱水——表现为液滴边缘出现白色环状结构，而非整个液滴完全变白——因为过度脱水可能损害甚至完全抑制膜蛋白活性，尤其是质子泵的功能。因此，必须精确控制湿度与温度，以在充分破坏膜结构促进融合的同时，维持蛋白质的功能完整性。

高蛋白载量会减小 GUV 的尺寸，但通过将蛋白功能化的 LUV 与无蛋白 LUV 混合稀释，可缓解这一效应。通过这种方法，可在沉积前精确调控 GUV 膜中的蛋白密度。例如，将高载量的 bo₃-LUV 与空载 LUV 混合（最高至 1:10，v/v），可形成直径为 5–30 µm、蛋白含量可调且膜分布均匀的 GUV²⁷。尽管该策略在蛋白密度方面会导致囊泡群体的异质性，但通过校准程序仍可对蛋白掺入水平进行定量评估^23,31。重要的是，混合方法能够在不显著减小 GUV 尺寸的前提下实现更高的总体蛋白载量²⁷。

通过在电形成缓冲液中包封对pH敏感的染料（如吡喃荧光素），可对重建的蛋白质进行功能分析，以监测囊泡内pH的变化。为实现可靠的活体成像，必须使囊泡沉降或固定，以防止其移动，否则会导致荧光信号模糊，影响对囊泡内pH动态变化的准确量化。可通过使用生物素化脂质和链霉亲和素包被的表面，利用生物素–链霉亲和素偶联实现囊泡固定。³² 提供稳定的附着，但可能改变膜的组成或张力。在微流控捕获装置中进行半固定化是一种替代方法，可避免引入额外的膜组分，并将干扰降至最低^1,33尽管在通过反复沉淀和缓冲液置换去除外部染料后仍可进行整体荧光测量，但残留的膜结合染料可能会干扰检测结果；因此，通常更倾向于采用共聚焦显微镜对单个GUVs进行观测。

与尝试将蛋白质直接插入预先形成的GUV中的其他方法相比，融合电形成策略允许在LUV水平上独立优化重组条件，然后再扩增至GUV。这种模块化的工作流程提高了可重复性和功能产率，尤其适用于对传统基于脂质的方案适应性较差的聚合物和杂化膜。该方法适用于多种膜蛋白¹，包括多蛋白系统¹⁵，并可实现膜的功能化以及额外组分的共包封。因此，该方法为构建稳定的人工细胞、微反应器以及在受控条件下研究聚合物-蛋白相互作用的模型系统提供了一个多功能平台。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ÄKTA pure™ 色谱系统	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8孔腔室盖玻片	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS 酯	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
胆酸钠盐（胆酸钠）	Serva	361-09-1
辅酶 Q1	TargetMol	TGM-T19594
共聚焦显微镜 STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT（二硫苏糖醇）	Merck	10197777001
细尖超微量移液管	Pastette	LW4243
HPTS（吡喃荧光素，8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐）	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO涂层玻璃载片（25×75×1.1 mm，≤20 Ohm/方）	pgo	CEC020S
LAS X 软件	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
迷你离心机 MCF-2360	LMS	24572
微型挤出器	Avanti Research	610000
Oxytherm+P 系统	Hansatech Instruments	/
等离子清洗仪（台式）	Harrick Plasma	PDC-32G-2
聚碳酸酯膜，0.1 μm	Avanti Research	610005
按压密封硅胶隔离器（圆形，直径 20 mm，深度 1 mm）	Grace Bio-Labs	41161502
硅胶垫片（圆形，外径 24.2 mm，内径 14.3 mm，深度 1.8 mm）			实验室自制，由硅胶片切割而成
大豆 PC（95%）	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS 分光光度计	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL 柱（柱长 × 内径 30 cm × 10 mm）	Cytiva	28-9909-44
试管振荡器（2800 rpm）	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329（PDMS-g-PEO；分子量 3000）	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600