利用人牙本质圆盘构建垂直堆叠的牙本质-牙髓复合体类器官芯片装置

摘要

介绍一种垂直堆叠式牙本质-牙髓复合体器官芯片装置的制备与组装方法，该装置包含人牙本质圆片和通过光刻技术制备的微通道，随后进行牙髓干细胞的接种与培养。

摘要

牙科研究中常用的临床前模型，包括动物模型和静态细胞培养，存在重要局限性，难以重现牙本质-牙髓界面的生理条件，也无法准确预测人体对牙科生物材料的生物学反应。器官芯片（Organ-on-a-chip, OoC）技术通过在可控的微流控系统中重建组织特异性微环境，提供了一种替代方案。本文描述了一种逐步操作的实验方案，用于构建和组装一种包含人牙本质圆片的牙本质-牙髓复合体OoC装置，该装置集成于三层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控平台中。该方案包括牙本质圆片制备、利用光刻技术制备微结构模具、PDMS浇铸与固化、等离子体辅助层键合、装置组装、泄漏测试，以及在静态培养条件下接种牙髓干细胞。文中讨论了影响装置性能的关键制备参数，包括PDMS层厚度的控制、等离子体表面处理，以及牙本质圆片在装置内的整合以最大限度减少泄漏。通过扫描电子显微镜和共聚焦活/死细胞染色法评估了装置内细胞的黏附性和活力。代表性结果表明，牙本质圆片成功整合至微流控装置中，能够维持无泄漏状态，并且活的牙髓干细胞可黏附于牙本质表面。本方案为构建牙本质-牙髓复合体OoC平台提供了一种可重复的方法，有望支持未来关于细胞对牙科生物材料及微环境刺激反应的研究。

引言

动物实验长期以来在增进对病理和生理过程的理解方面发挥了重要作用，并在药物研发的早期阶段占据核心地位¹。在20世纪期间，人类预期寿命显著提高，尽管无法精确量化这一改善在多大程度上完全归功于动物研究，但普遍认为，许多现代医学治疗方法的开发或验证都依赖于动物模型²。显著的例子包括针对脊髓灰质炎、麻疹和乙型肝炎的疫苗研发，青霉素安全性和有效性的评估，以及胰岛素的生产。在牙科和生物材料研究领域，这些模型对于探索龋病过程、牙本质-牙髓复合体的生物学与再生，以及牙周组织的生理病理学具有关键意义^3,4。

尽管这些方法被广泛使用，当前的药物研发流程仍表现出较高的失败率，许多候选药物在临床前实验室环境和动物模型中显示出有效性和安全性，却在临床试验阶段失败⁵。这种差异与物种间的差异有关，由于不同物种之间在解剖结构、遗传和生理方面的差异，可能限制了动物模型在转化预测方面的可靠性⁶。此外，新治疗手段的开发仍然耗时且成本高昂⁷。同时，传统的体外模型主要采用在非生理性的塑料基质上建立的简单二维（2D）单层细胞培养，无法重现人类口腔中存在的生化与物理信号、细胞间相互作用以及细胞外基质（ECM）信号传导^8,9.。尽管二维模型具有一定的实验优势，但其本质上无法模拟多种组分之间同时发生的复杂相互作用，例如生物膜、生物材料、牙本质和牙髓细胞之间的相互作用¹⁰。因此，人们日益关注能够更准确地再现人类生物学反应的替代性实验平台的开发。2022年，美国《现代化法案2.0》取消了药物审批过程中强制进行动物实验的要求，并认可包括器官芯片（organ-on-a-chip, OoC）技术在内的替代平台在临床前研究中的潜在应用¹¹。

器官芯片（OoC）是一种微流控装置，旨在模拟特定器官或组织组分的结构、功能及其微环境¹²。这些装置中培养有活细胞和组织，位于经过工程化设计的微通道内，可重现细胞在体内自然暴露的关键生理微环境特征。除了结构上的模拟外，微通道还能实现对细胞环境的时空精确控制，并支持组织特异性功能的维持，从而提供比传统培养系统更接近体内生理状态的实验条件¹²。尤为重要的是，OoC装置中的微通道可实现培养基的可控流动，从而对驻留细胞施加剪切应力¹³。这些机械刺激会影响细胞的多种响应，包括黏附、增殖、迁移、基因表达以及细胞间相互作用^14,15。此外，持续的培养基流动通过提供营养物质并清除代谢废物，有助于维持稳定的微环境¹⁶。进一步研究表明，与传统的二维（2D）培养相比，某些OoC平台在三维（3D）芯片模型中能够更好地调控与氧化应激相关的检测指标，如细胞内活性氧水平和细胞活力¹⁷。因此，OoC系统已成为在受控实验条件下研究组织生理、生物材料相互作用及疾病过程的有前景平台¹⁸。在牙科研究中，OoC技术已逐步应用于构建日益复杂的口腔组织界面模型¹⁹。早期的“牙芯片”平台模拟了生物材料–牙本质–牙髓界面²⁰，而更先进的版本则进一步整合了血管系统和三叉神经支配，以更真实地再现牙髓-牙本质复合体的结构与功能复杂性²¹。在牙髓之外，针对未成熟根管的三维模型已被用于评估根管冲洗剂以及对来自根尖乳头的干细胞的促血管生成出芽效应^22,23。在牙周层面，“牙龈芯片”平台已被用于研究宿主-微生物相互作用，并评估益生菌作为治疗剂的免疫调节潜力²⁴；而“牙周韧带芯片”装置则揭示了间质液流动如何调控血管网络形成以及牙周韧带干细胞球体的成骨分化过程^25,26。作为上述模型的补充，特化的“口腔黏膜芯片”和“牙种植体芯片”系统进一步拓展了牙科微流控研究的范围，可在生理相关条件下表征宿主-材料相互作用以及牙科单体的细胞毒性^27,28。

尽管器官芯片（OoC）系统在牙科、口腔及颅面研究中的应用日益广泛，但持续推进制造流程的标准化与可重复性仍至关重要。已有若干“牙芯片”模型见于文献报道^20,29,30,31，展示了不同的装置构型与实验应用。然而，装置结构、制造方法、牙本质的引入方式以及实验参数报告方面的差异，可能限制研究间的可重复性与直接比较。特别是微通道几何形状、牙本质整合策略及制造方法的差异，可能影响装置内的生物学与机械微环境。部分已报道的模型引入牙本质以模拟牙本质-牙髓界面的某些特征^20,29,30，而其他模型则采用替代构型³¹。此外，光刻、激光切割、微铣削和3D打印等制造方法各自具有特定的优势与局限性，具体取决于预期的装置设计与应用。进一步地，装置的结构取向是决定其生物学适用性的关键因素，尤其是通道与牙本质切片呈水平或垂直排列^19,32。在水平堆叠构型中，相邻排列的腔室有利于横向区室化及细胞的实时观察，因此特别适用于建模具有固有横向空间组织的组织，如牙周复合体^24,32。然而，这种设计在重建垂直生物学界面（如生物材料-牙本质-牙髓复合体）方面存在固有局限，因为腔室的横向排列无法真实再现牙本质屏障在体内从龋洞至牙髓的垂直取向^20,32。垂直堆叠构型通过沿y轴叠加两个腔室，并以天然牙本质切片分隔，克服了这些局限，可同时量化分子在完整牙本质中的跨膜运输，并通过出口介质实时监测牙髓细胞反应³⁰。然而，该取向的一个公认局限在于牙本质-细胞界面的横截面成像，因为在同一焦平面内获取牙本质-细胞界面的横截面图像在技术上比水平堆叠构型更具挑战性，后者中细胞与细胞外基质呈横向排列。尽管已有多种牙本质-牙髓复合体芯片模型见于文献报道，但大多数采用水平堆叠构型，其中腔室在同一平面内并排排列^10,20,21,29，而将天然牙本质切片整合于垂直堆叠构型的研究相对较少³⁰。尽管如此，这些模型在制造方法与参数报告方面的差异仍持续限制着可重复性与跨研究比较³³。本论文旨在通过提供一种垂直堆叠式牙芯片装置的详细制造方案，提升方法学的可重复性，从而促进该平台在牙科研究领域的更广泛应用。

本文描述了一种垂直堆叠的牙本质-牙髓复合类器官芯片装置的逐步制备与组装方案，该装置在由光刻法制备的模具加工而成的三层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控平台中整合了人牙本质圆片。该方案还描述了在静态条件下将牙髓干细胞接种并培养于该装置内的方法。

方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行，并已获得涉及人类样本研究的拉弗龙特拉大学伦理委员会批准。

1. 牙本质圆盘的获取

注意：在开始实验方案之前，先准备好设备设计（图1A–1C）。

1. 牙齿的采集与保存
   1. 在获得患者知情同意后，采集健康的恒磨牙或前磨牙。
   2. 将所有样本保存在0.5%氯胺溶液中，4°C条件下以防止牙本质脱水和蛋白质变性。
   3. 储存期间每周更换一次氯胺溶液。
2. 牙本质圆片的制备
   1. 使用转速为350,000 rpm的高速手机，配备直径为1 mm、粒径为100–150 µm的圆柱形金刚砂车针，将每颗牙齿在牙冠中1/3处进行水平截断。
   2. 截断过程中持续以约50 mL/min的水流进行冷却冲洗。
   3. 将截断位置定于牙冠中1/3处，以避开髓腔以及咬合面沟裂处的釉质，从而获得主要由牙本质组织构成的圆片。
      注意：牙齿截断操作必须在持续冲洗条件下进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、口罩和护目镜。
3. 牙本质圆片的修整
   1. 依次使用粒径递减的修整片对牙本质圆片进行抛光处理。
   2. 持续抛光至牙本质最终厚度约为0.8 mm（±± 0.3 mm），侧向尺寸约为5 mm × 5 mm（±± 0.3 mm）（图1D）。
4. 牙本质圆片的保存
   1. 将制备好的牙本质圆片保存于0.5%氯胺溶液中，4°C条件下，直至进行OoC装置组装。

图1：牙本质-牙髓复合体类器官芯片（OoC）装置的设计与制备流程。（A）装置的三维设计图，显示三层结构。（B）装置设计的俯视图，标注主要尺寸。（C）三层装置结构的侧视图。（D）制备的代表性牙本质圆片，厚度约为0.8 mm，横向尺寸约为5 mm × 5 mm。（E）通过光刻技术制备的硅质母模，用于浇铸顶部和底部的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层。（F）热聚合后，将固化的PDMS层从硅模具中剥离。（G）在层间键合前对PDMS表面进行等离子体处理。（H）通过等离子体键合组装完成的三层牙本质-牙髓复合体OoC装置，并整合了牙本质界面。（I）组装好的装置连接管路，用于渗漏测试及微流控实验的准备。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 牙本质-牙髓复合体类器官芯片装置的制备

1. 工作区与材料的准备
   1. 准备材料和设备
      1. 在开始器件制备之前，准备好材料表中列出的所有材料和设备。
      2. 在器件组装前准备好活检打孔器。
      3. 所有制备步骤均需在洁净、无尘的环境中进行。
      4. 在整个器件制备与组装过程中佩戴手套、防护眼镜及适当的个人防护装备。
         注：在开始本方案前，需预先制备光刻法制备的模具（图1E）。
2. 微结构模具的制备
   1. 硅片的准备
      1. 在4英寸单面抛光硅片（N型，砷掺杂，CZ生长法，<100>晶向，厚度500 ±± 25 µm，TTV ≤ 10 µm，BOW ≤ 35 µm，电阻率0.001–0.005 Ω·cm）上制备模具。
      2. 在超声条件下，依次用丙酮、异丙醇和超纯水各清洗硅片10分钟。
      3. 用压缩空气吹干硅片。
      4. 将硅片置于热板上，在200°C下烘烤10分钟以去除残留水分。
      5. 让硅片冷却至室温（RT；20°C–25°C）。
   2. 表面活化与光刻胶涂覆
      1. 使用真空等离子清洗机，在空气等离子体模式下（等级7）处理硅片表面120秒以实现表面活化。
      2. 采用旋涂法涂覆GM 1060环氧基负性光刻胶，转速为300 rpm，持续10秒。
      3. 继续以200 rpm/s的加速度，在565 rpm下旋涂100秒，随后在965 rpm下旋涂1秒。
      4. 让涂覆后的硅片静置10分钟。
      5. 在65°C下进行前烘10分钟。
      6. 继续在95°C下前烘1小时。
      7. 让硅片冷却至室温。
   3. 曝光与显影
      1. 使用直写激光光刻系统对光刻胶进行曝光，剂量为1,950 mJ/cm²。
      2. 在65°C下进行后烘10分钟。
      3. 继续在95°C下后烘30分钟。
      4. 让硅片冷却至室温。
      5. 让硅片静置10分钟。
      6. 在PGMEA中显影4分钟。
      7. 若仍有残留光刻胶，每次延长显影30秒，直至完全清除。
      8. 用异丙醇冲洗以终止显影过程。
      9. 用压缩空气吹干硅片。
   4. 硬烘
      1. 在135°C下进行硬烘2小时。
      2. 获得包含微通道的微结构主模具，微通道尺寸为宽1 mm、高50 µm。
3. PDMS混合物的配制与脱气
   1. PDMS混合物的配制
      1. 按10:1的质量比混合PDMS基体与固化剂。
      2. 在塑料烧杯中用玻璃棒手动搅拌约5分钟。
      3. 混合过程中保持缓慢且连续的环形搅拌。
         注：避免在混合过程中引入气泡。
   2. 脱气
      1. 将PDMS混合物置于连接真空泵的真空干燥器中。
      2. 在约700 mmHg的真空度下脱气5分钟。
      3. 短暂释放真空，使表面气泡破裂。
      4. 重新施加真空。
      5. 重复该循环，直至无可见气泡。
         注：总脱气时间通常约为30分钟。
4. 在模具上浇铸PDMS
   1. 模具的准备
      1. 将模具放置在平坦表面上。
      2. 用压缩空气清洁模具。
      3. 避免直接接触图案化表面。
      4. 确认模具表面无灰尘和污染物。
   2. PDMS的分配
      1. 在牙本质圆片周围分配约8 g PDMS，用于制备牙本质包埋层。
      2. 调整PDMS高度以匹配牙本质圆片厚度（0.8 ±± 0.3 mm）。
      3. 防止PDMS覆盖牙本质表面。
      4. 每个模具单元分配约0.26 g PDMS，用于制备每个微通道层。
      5. 轻轻敲击模具或施加振动，以促进微结构的填充。
      6. 让PDMS充分流入最小结构特征中。
      7. 使用盖子或平板覆盖模具，避免接触PDMS表面。
         注：牙本质包埋层厚度约为0.8 mm，每个微通道层厚度约为0.4 mm，总器件厚度约为1.6 mm。
         注：若计划进行共聚焦成像，应根据共聚焦物镜的工作距离调整各层厚度。
5. 固化
   1. 将模具放入50°C的烘箱中。
   2. 使PDMS固化4小时。
6. PDMS层的剥离
   1. 剥离固化后的PDMS
      1. 小心地将固化后的PDMS层从模具上剥离（图1F）。
      2. 操作PDMS层时需小心，避免损坏微结构。
7. PDMS层的键合及进样口与出样口的制备
   1. 进样口与出样口的制备
      1. 使用1 mm活检打孔器在指定的进样口和出样口位置打孔。
      2. 打孔时使微通道侧朝上。
         注：将PDMS层置于切割垫上，以避免结构损伤。
      3. 在顶层打两个孔，对应上层微通道。
   2. PDMS层的清洗
      1. 使用异丙醇或乙醇清洗PDMS层。
      2. 使用无菌胶带去除残留的灰尘颗粒。
      3. 在组装前确认所有键合表面无污染物。
   3. PDMS表面的等离子活化
      1. 将顶层和中层PDMS层置于等离子处理位置（图1G）。
      2. 使用手持式电晕等离子处理仪，以环境空气为工作气体，功率约25 W，对表面进行活化。
      3. 保持等离子源与PDMS表面之间的工作距离约为1 mm。
         警告：应在适当通风条件下进行等离子处理，并避免直接暴露于等离子产生的臭氧中。
      4. 启动等离子处理装置并稳定5秒。
      5. 处理前确认产生均匀的等离子束。
      6. 以约5 mm/s的速度连续往复移动，对顶层PDMS处理10秒。
      7. 以相同运动方式和距离对中层PDMS处理10秒。
      8. 在键合前立即对顶层再进行1秒的等离子处理。
   4. 顶层与中层的键合
      1. 等离子处理后立即对齐上层微通道与牙本质圆片。
      2. 将顶层与中层键合在一起。
      3. 将键合后的组件置于75°C烘箱中5分钟。
      4. 在孵育过程中巩固键合。
         注：牙本质圆片和微通道肉眼可见，无需额外对齐工具即可对齐。
   5. 下层微通道端口的制备
      1. 通过已键合的顶层和中层，打两个孔对应下层微通道。
      2. 同时穿透两层打孔，以确保对齐。
         注：此操作在顶层产生四个孔，在中层产生两个孔。
      3. 打孔前将键合组件置于坚固的切割垫上。
      4. 单次动作中施加稳定向下的压力。
         注：避免旋转或侧向力，以最小化分层风险。
      5. 使用浸有异丙醇的无绒无菌纱布清除孔位处的碎屑。
      6. 在充足照明下检查孔及周围键合区域。
      7. 确认无分层、撕裂或未完全打穿的孔后，再进行下一步。
   6. 底层的键合
      1. 按步骤2.7.4所述对底层进行等离子处理。
      2. 对齐下层微通道的进样口和出样口与顶层和中层的孔。
      3. 将底层键合以完成器件组装。
         注：键合前可在底层外表面标记进样口和出样口位置，以方便对齐。
         注：文献报道，等离子腔室可能比等离子笔提供更强的键合效果³⁶。
         注：完成的器件为三层微流控平台，包含牙本质界面（图1H）。下层牙本质表面代表模型的牙髓侧，上层牙本质表面代表冠部侧，用于暴露于牙科生物材料或细菌制剂。
8. 微流控器件的漏液检测
   1. 组装器件的检查
      1. 检查组装后的器件是否存在错位。
      2. 检查组装件是否存在键合不完全或可见漏液。
   2. 漏液检测
      1. 将19G鲁尔锁针头连接至进样口（图1E）。
      2. 将针头连接至微流控泵管路。
      3. 轻轻将针头接头压入打孔的端口，以获得气密性连接。
      4. 以10 µL/min的流速注入无菌PBS或培养基。
      5. 维持液体流动至少5分钟。
      6. 在流动过程中检查所有键合界面、通道边缘及牙本质圆片边界。
      7. 在注射期间和之后，在充足照明下观察器件。
      8. 确认无液体积聚、湿润或液滴形成。
      9. 若未检测到泄漏，则判定器件无泄漏。
      10. 丢弃出现泄漏的器件。
          注：在细胞接种或实验使用前，应对每个制备的器件进行漏液检测。
9. 微流控器件的灭菌与储存
   1. 灭菌
      1. 在超净工作台内，将组装后器件的顶面暴露于紫外光（254 nm）下30分钟。
      2. 将底面再暴露于紫外光下30分钟。
      3. 用70%乙醇冲洗微通道20分钟。
      4. 用无菌PBS冲洗微通道三次，以去除残留乙醇。
   2. 储存
      1. 灭菌后立即用于细胞培养实验。
      2. 或者，将器件浸没在无菌PBS中，置于无菌容器内，于4°C保存至使用。
         ​警告：器件组装后不得使用氯胺或其他消毒溶液，因为PDMS可能吸收这些化合物而影响细胞活力。

3. 牙髓干细胞黏附性与活力的评估

1. 牙本质表面预处理
   1. 向装置中注入10% EDTA。
   2. 将EDTA溶液与牙本质表面保持接触15分钟。
   3. 每3分钟注入0.5 mL EDTA，以维持微通道内液体的流动。
   4. 用超纯水将牙本质圆片清洗三次。
   5. 每次洗涤维持 5 分钟。
      注意：EDTA 处理可去除玷污层，并暴露牙本质基质蛋白。
      警告：操作EDTA溶液时应佩戴手套和护目镜，以避免刺激皮肤和眼睛。
2. 牙髓干细胞接种
   1. 牙髓干细胞的扩增
      1. 以每平方厘米1个种子牙髓干细胞的密度接种于T75培养瓶中 × 10⁶ 每瓶细胞数
      2. 将细胞置于培养箱中孵育 37°C 和5% CO₂ 直至达到约80%的汇合度。
      3. 使用胰蛋白酶消化细胞使其脱落。
      4. 使用完全培养基中和胰蛋白酶。
      5. 离心细胞悬液以获得细胞沉淀。
      6. 使用台盼蓝评估细胞活力。
      7. 使用活率 ≥90% 的细胞悬液。
   2. 细胞悬液的制备
      1. 制备预热的细胞悬液 37°C.
      2. 用完全培养基将细胞浓度调整至100,000个细胞/mL。
      3. 制备终体积为1–2 mL的悬浮液。
         注意：本研究使用了第5代细胞。
   3. 细胞接种
      1. 将细胞悬液注入下层微通道的入口端。
      2. 接种细胞后倒置装置
         注意：装置倒置可促进细胞向牙本质表面沉降，并增强细胞黏附。
   4. 孵育
      1. 将倒置的装置放入培养皿中。
      2. 向培养皿中加入 1 mL 培养基以减少蒸发。
      3. 将装置孵育于 37°C 和5% CO₂₂ 24小时。
      4. 在整个孵育期间保持静态培养条件。
         注：本研究未进行动态流验证。
         注：本方案描述了用于初始设备验证和细胞黏附评估的静态培养条件。
   5. 初步设备验证
      1. 使用扫描电子显微镜评估细胞黏附性
      2. 通过拆卸装置在分析前取出牙本质圆片。
3. 扫描电子显微镜样品制备
   1. 样本的取出与洗涤
      1. 孵育24小时后拆卸装置。
      2. 取出牙本质片并转移至培养板或培养皿中。
      3. 将接种细胞的牙本质表面朝上放置。
      4. 用 1 mL PBS 清洗牙本质圆片两次。
   2. 固定
      1. 加入2 mL 2.5%戊二醛（溶于0.1 M Sorensen磷酸盐缓冲液中）。
      2. 在室温下孵育样品30分钟。
         警告：戊二醛具有毒性，可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。固定操作应在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
   3. 固定后的洗涤
      1. 去除戊二醛溶液。
      2. 在室温下用超纯蒸馏水清洗牙本质圆片三次。
   4. SEM分析
      1. 使用环境扫描电子显微镜分析样品。
      2. 在低真空条件（25 Pa）下操作显微镜。
      3. 使用10.0 kV的加速电压和7.0 mm的工作距离。
      4. 使用背散射电子三维检测模式（BSE-3D）采集图像。
      5. 捕获图像于 ×200 倍放大图2A).
4. 通过共聚焦显微镜评估细胞活力
   1. 样品制备
      1. 按照步骤3.2所述接种和培养细胞。
      2. 将装置在37°C、5% CO₂培养箱中孵育24 h 37°C 和 5% CO₂.
      3. 拆卸装置并暴露牙本质表面。
      4. 将牙本质圆片转移至含有预热 HBSS 的孔板中⁺/+ 添加 Ca²⁺ 和 Mg²⁺.
   2. 样品洗涤
      1. 用HBSS清洗牙本质圆片两次⁺/⁺.
      2. 染色前去除残留的血清和酚红。
         注意：残留的血清和酚红可能会增加背景自发荧光。
   3. 活细胞染色
      1. 现配Calcein AM工作液 2 µM 在 HBSS 中⁺/⁺.
      2. 加入足量染色液以完全覆盖牙本质表面。
      3. 将样品在20 min内孵育 37°C 在暗处。
      4. 孵育后移除染色液。
   4. 死细胞染色
      1. 加入碘化丙啶工作液（1–2 µg/mL 在 HBSS 中⁺/⁺).
      2. 将样品在5–8分钟内孵育 37°C 在暗处。
      3. 孵育时间不得超过10分钟。
      4. 用HBSS洗涤样本两次⁺/⁺.
      5. 保持样本浸没在缓冲液中直至成像。
   5. 共聚焦显微镜图像采集
      1. 染色后30分钟内获取共聚焦图像。
      2. 依次在绿色和红色通道中采集图像。
      3. 使用 λ_ex 490 nm 和 λ_em 活细胞成像使用515 nm。
      4. 使用 λ_ex 535 nm 和 λ_em 617 nm用于死细胞成像。
         ​注意：在孵育和成像过程中，需避免荧光染色溶液及染色样本暴露于光线下图2B).

图2：牙髓干细胞在牙本质–牙髓复合类器官芯片装置中的黏附性与存活率的代表性评估。（A）扫描电子显微镜图像显示，在类器官芯片装置中静态培养24小时后，牙髓干细胞（白色星号标记）已黏附于牙本质表面。培养24小时后，黏附细胞覆盖了暴露于微通道的牙本质表面的54.35 ± 0.92%。聚二甲基硅氧烷（PDMS）覆盖的牙本质区域未见细胞（黑色星号标记），表明装置各层之间实现了有效密封。比例尺 = 200 µm。（B）共聚焦显微镜图像显示，经绿色染色的活牙髓干细胞在静态培养24小时后黏附于牙本质表面（白色箭头）。同时可见经红色染色的非活细胞（蓝色箭头）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看此图的高清版本。

结果

牙芯片装置的成功制备遵循了图1A–1I所示的工作流程，包括牙本质圆片制备（图1D）、光刻法制备模具（图1E）、去除固化后的PDMS层（图1F）、键合前的等离子活化处理（图1G）、最终装置的组装（图1H）以及装置与微流控系统的连接（图1I）。所获得的装置由三层PDMS结构组成，其中牙本质圆片完全集成于中间层，上下微通道分别位于牙本质表面的两侧（图1H）。

此阶段的成功结果表现为无可见气泡或分层现象，并且在通过入口注入 PBS 或培养基后无液体泄漏（图 1I）。微通道端口错位、等离子体键合不完全，或牙本质–PDMS 界面处发生泄漏，均表明组装失败，需重复制备流程。

共制备了30个装置，其中约20%在制备或测试过程中失败。失败主要与微通道边界之外的液体泄漏有关，原因是等离子体键合不完全；而较小比例的失败则源于装置其他区域的脱层。未发现因牙本质–PDMS界面泄漏或微通道进出口端口错位导致的失败情况。

静态培养24小时后，通过观察牙本质表面贴壁的牙髓干细胞呈现成纤维细胞样形态，确认细胞接种成功。扫描电子显微镜用于评估细胞贴壁情况及装置完整性（图2A）。根据本实验方案，培养24小时后，贴壁细胞覆盖了微通道暴露区域牙本质表面的54.35 ± 0.92%。阳性结果表现为细胞仅存在于微通道区域内，而被PDMS覆盖的牙本质表面无细胞附着（图2A）。该空间分布表明装置各层之间实现了有效密封，装置组装正确。相反，若在微通道边界以外区域观察到细胞，则提示存在泄漏，应视为阴性结果。

采用活/死染色法结合共聚焦显微镜可对装置内细胞的活力进行无损评估。成功的结果表现为大量具有绿色荧光和成纤维细胞形态的活细胞，仅有少量呈红色染色的死细胞（图2B）。相反，若死细胞比例较高，则提示牙本质预处理不充分、洗涤不彻底或培养条件不合适。

在方案优化过程中，曾评估一种初始的制备策略，该策略采用带有预设凹槽的固定模具，将牙本质圆片定位在中间的PDMS层内（图3A）。尽管该方法旨在标准化圆片的位置并减少圆片与PDMS界面处的泄漏，但在实际操作中效率较低。由于对应牙本质圆片凹槽的区域必须从固化的PDMS层中手动切割下来，因此无法可靠地实现圆片边缘与切割后的PDMS边缘之间的精确贴合，导致约50%的制备装置出现界面缝隙并引发泄漏（图3A）。

图3：在优化牙本质–牙髓复合体类器官芯片（OoC）装置过程中，识别出的不成功制备方法的代表性图像。（A）含有固定凹槽的硅胶模具，用于标准化牙本质圆片的定位（白色箭头）。由于手动制备样本导致牙本质圆片尺寸存在固有变异，难以可靠地适配固定模具的几何结构，导致约50%的制备装置出现界面间隙和泄漏。（B）在牙本质圆片与聚二甲基硅氧烷（PDMS）界面处涂覆密封材料后，牙本质表面的扫描电子显微镜图像。图中显示暴露的牙本质（黑色星号）和密封材料沉积物（白色星号）。密封材料意外扩散至牙本质表面，影响了细胞黏附，并减少了细胞定植的可用表面积。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

为解决这一局限性，在圆盘与聚二甲基硅氧烷（PDMS）界面处应用了一种密封材料。然而，该方法引入了另一个缺点，即密封材料扩散至牙本质表面，阻碍了覆盖区域的细胞黏附，扫描电子显微镜结果证实了这一点（图3B）。这些不理想的结果凸显了初始制备策略的两个关键局限：手工切割的PDMS凹槽与牙本质圆盘之间贴合不充分，以及密封材料导致的细胞黏附能力下降。

讨论

本研究描述了一种逐步构建垂直堆叠式牙芯片装置的实验方案，该装置整合了牙本质和牙髓干细胞，并展示了在静态培养条件下装置内细胞黏附和存活的代表性结果。该方案的开发旨在为构建和组装适用于牙本质-牙髓复合体界面体外研究的牙芯片平台提供可重复的操作流程。建立此类标准化流程具有重要意义，因为我们在近期的一项系统综述中指出，牙本质-牙髓复合体的微流控模型领域仍处于发展阶段，不同研究在装置结构和材料方面存在高度的方法学异质性，严重限制了当前牙芯片模型的可重复性和标准化程度³⁴。通过提供详细且可重复的实验流程，本研究弥补了这些不足，推动了更为明确的生物模型的发展。在器官芯片技术应用于口腔生物学的更广泛背景下，França 等人¹⁵率先开发了一种整合牙本质圆片和成牙本质样细胞的微流控牙芯片模型，证明了在动态微流控环境中重建牙本质-牙髓界面的可行性，并评估了牙科材料引起的细胞毒性反应。自这一开创性工作以来，文献中已陆续报道了越来越多的口腔器官芯片平台³⁴，涵盖牙体组织生物学、生物材料相互作用以及口腔微生物学等多个方面，确立了该技术作为活跃且快速发展的研究领域。本研究通过提供一种结构明确、可重复制造的垂直堆叠式牙芯片平台操作流程，为该领域的发展做出了贡献，且该流程适用于具备常规微流控技术能力的研究团队。

该方案中有多个步骤对于设备的成功制备和性能至关重要。特别是，将PDMS浇注到模具上时需要仔细控制，以获得均匀的层厚并形成正确的微通道结构。PDMS层的厚度应根据预期的下游应用进行选择。例如，共聚焦显微镜要求PDMS层足够薄，以便能够光学观察黏附在牙本质表面的细胞。然而，过薄的PDMS层可能在制备和组装过程中更难操作。因此，PDMS厚度的优化需要在成像可及性与设备制备过程中的实际操作性之间取得重要平衡。此外，在本研究中，由于覆盖在细胞上方的PDMS层厚度为0.4 mm，超过了现有共聚焦显微镜的穿透深度（0.2 mm），因此无法对完整设备进行共聚焦显微成像。为此，共聚焦成像在拆解设备并直接暴露牙本质表面后进行。另外，由于牙本质本身不透明，阻碍了对黏附在其表面的细胞进行直接光学观察，因此该设备中无法应用荧光显微镜成像。

这一限制在垂直堆叠的器官芯片（OoC）构型中尤为突出，其中含有细胞的微通道位于牙本质圆盘下方，导致光学通路同时受到上方聚二甲基硅氧烷（PDMS）层和牙本质自身不透明性的阻碍。而在水平堆叠的芯片设计中则不存在此问题，因为微通道与牙本质并列横向延伸，从而可直接对接种细胞的表面进行光学观察，不受牙本质不透明性或PDMS厚度的干扰。因此，在选择垂直或水平堆叠构型时，应综合考虑实验室可用的成像方式，而不仅仅是流体和生物学需求。在OoC系统中，器件设计起着关键作用，且微环境必须尽可能接近体内条件。与大多数组织类似，牙齿会受到机械刺激，并表现出各向异性行为³⁵，即其性质随施加刺激的方向不同而变化。此外，牙本质–牙髓复合体的冠部区域与侧部区域之间存在组织学差异：在冠部区域，牙本质与成牙本质细胞呈垂直排列；而在侧部区域，成牙本质细胞紧邻牙本质分布，两者在细胞数量、排列方式以及牙本质小管方向上均有显著差异。因此，垂直堆叠的芯片设计能更真实地模拟影响牙本质–牙髓复合体冠部区域的龋损及修复材料的解剖结构。

精确的等离子体表面处理对于成功组装器件至关重要，也是芯片生产中的主要挑战之一³⁶。在本研究中，20%的制备器件出现了分层现象。这一结果并不意外，因为本研究所使用的手持式等离子笔实现的PDMS–PDMS键合，其产生的活性氧物种浓度低于基于真空的等离子腔系统；后者允许氧气浓度高于大气水平，从而产生更多可用于键合的共价表面基团³⁶。因此，使用等离子笔所获得的键合强度本质上较低且重复性较差，这可能是导致观察到的分层率较高的原因。牙本质整合策略的优化也需经过多次制备迭代，以实现牙本质圆片与中间PDMS层之间的紧密贴合，同时尽量减少泄漏。最初的方法是在中间层中制备一个预定义的凹槽用于放置牙本质；然而，人工切削凹槽导致牙本质圆片与PDMS边缘之间无法一致贴合，在培养基注射过程中出现泄漏，最终整体制备成功率约为50%。

随后评估了一种义齿粘合剂以改善牙本质与聚二甲基硅氧烷（PDMS）界面的密封性，但扫描电子显微镜结果显示其干扰了细胞黏附，并降低了牙本质表面细胞的可视性。因此，最终方案通过在浇注PDMS前将牙本质圆片直接置于模具内进行优化，从而提高了牙本质圆片在装置中的整合性，并减少了对额外密封材料的需求。该方法通过确保牙本质圆片边缘与周围PDMS之间紧密且贴合的接触，有效消除了牙本质–PDMS界面的渗漏，避免使用可能干扰细胞在牙本质表面黏附的二次密封剂。此外，也应考虑本方法存在的一些局限性。微流控装置的制备仍部分依赖于人工操作步骤，这可能在不同装置和操作者之间引入变异。尽管光刻技术可为微通道结构的制备提供高精度和良好的可重复性，但该过程可能需要专用设备和技术专长。其他替代性制备方法，包括三维打印技术，可能有助于部分实验室更便捷地进行装置原型开发和获取；然而，打印分辨率、残留单体以及材料生物相容性等因素仍需仔细优化³⁷。

持续供应的培养基为细胞提供了稳定的环境，防止代谢废物积聚或钙/磷酸盐失衡¹⁶。多项研究表明，由恒定流体流动引起的剪切应力可模拟类似于体内信号传导的机械转导过程，这些过程是细胞行为的关键决定因素^38,39，有助于细胞分化与成熟，并诱导细胞形态、基因表达和功能发生显著变化³⁹。本研究报道了该装置的制备及其初步验证，结果表明在静态培养条件下培养24小时后细胞能够黏附并保持活性；因此，尚未评估动态流动的影响。实施动态流动条件是未来研究的重要方向，将在后续研究中加以探讨。本实验方案提供了一种可重复的工作流程，用于制备一种垂直堆叠的含牙本质三明治结构牙髓-牙本质复合类器官芯片装置，该装置将牙本质整合到三层PDMS微流控平台中。该模型的潜在应用包括牙本质-生物材料相互作用的研究、细胞对牙科材料的反应分析，以及在可控实验条件下对牙本质-牙髓界面进行体外评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>生物与化学材料
丙酮	专家问答	SOLV 8	硅片清洗
α-MEM 培养基	Cytiva	SH30265.02	牙髓干细胞培养基
氯胺（0.5%）	默克	7080-50-4	牙本质圆片保存液
牙髓干细胞	不适用	不适用	原代细胞培养。参见步骤 3.2.1 和 3.2.2
EDTA（10%）	温克勒	N2222158E	去除玷污层
基于环氧的负性光刻胶	Gersteltec	GM1060	光刻模具制备
0.1 M 索伦森液中的戊二醛（2.5%）’磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	210908-06	扫描电镜固定
健康的恒牙（磨牙或前磨牙）	不适用	不适用	人类样本
异丙醇	专家问答	SOLV 16	晶圆清洗、显影终止及PDMS清洗
LIVE/DEAD 活性检测试剂盒	Sigma-Aldrich	451	荧光活力染色
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	康宁	46-013-CM	清洗与泄漏测试
PDMS 基底和固化剂（聚二甲基硅氧烷）	道	Sylgard 184	设备制备
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	光刻胶显影
台盼蓝	Sigma Aldrich	T8154-100ml	细胞活力评估
胰蛋白酶	康宁	25-053-CI	细胞解离
超纯水	Cytiva	SH30529.01	洗涤液
<强>耗材与实验器具
19G 注射器针头	Vmatic	VCB19050	连接带有微泵或注射器的装置
活检穿孔器（直径：1 mm）	Harris Unicore	WHAWB100073	进样口和出样口的制备
切割垫	Nicecool	不适用	打孔过程中的表面保护
牙科抛光盘（例如 Sof-Lex）	3M	Sof-Lex	牙本质抛光
女性鲁尔接头转凸形接头适配器	Runze Fluidics	RH-M016	管路连接
玻璃或塑料搅拌棒	杜兰	不适用	PDMS混合
皮下注射器	蔓越莓	pc-12246	细胞接种与渗漏检测
无尘无菌纱布	Linderson	不适用	清除打孔碎屑
雄性鲁尔接头	Runze Fluidics	RH-G016	管路连接
混合容器	Duran	不适用	PDMS 制备
培养皿（140 mm） × 20 mm	Deltalab	2000219	细胞培养/孵育
聚四氟乙烯基底	CCTVal	不适用	中层牙本质制备
硅片	焦作商业FineWin	不适用	模具制备
硅胶管	Runze Fluidics	96421	流体连接
T75 培养瓶	康宁	353136	牙髓干细胞扩增
培养板	SPL Life Sciences	30006	共聚焦染色与成像样品制备
<强>设备与仪器
空气干燥器	METALPLAN	TITAN-040	压缩空气干燥
压缩空气源	SCHULZ	CSD-18.1	霉菌与表面清洁
共聚焦显微镜	Olympus	不适用	型号：FV1000
直接激光光刻系统	海德堡	uPG 101	光刻胶曝光
环境扫描电子显微镜	日立	不适用	型号：Quanta 400
高速手机	Nakanishi	不适用	型号：Pana-max2
热板	LabTech	EH20A Plus	晶圆烘烤与光刻胶烘烤
层流柜	BioBase	BBS8V1708313D	设备灭菌
微流控泵	新时代	不适用	型号：1002X-ES。在10处进行泄漏测试 µL/min
微结构模具（通过光刻技术制备）	CCTVal	不适用	参见第2.2步了解模具制造规格
烘箱或培养箱	Memmert	UN110	PDMS 在 50 ℃ 下固化°C 和 75 下的键合固化°C
真空等离子清洗腔室	法里血浆	GD-5	晶圆等离子体活化
手持式电晕等离子体	Aurora Pro 科学仪器	APS-CD-20AC	PDMS 等离子体活化
超声波破碎仪	Elma Sonic	S 10 (H)	晶圆清洗
真空室或干燥器（250 mm）	Winglass	不适用	PDMS 脱气
真空泵	ROCKER	300	PDMS 脱气