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方法文章

利用人牙本质圆盘构建垂直堆叠的牙本质-牙髓复合体类器官芯片装置

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DOI：

10.3791/71713

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2026年8月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

本文内容

摘要

介绍一种垂直堆叠式牙本质-牙髓复合体器官芯片装置的制备与组装方法，该装置包含人牙本质圆片和通过光刻技术制备的微通道，随后进行牙髓干细胞的接种与培养。

摘要

牙科研究中常用的临床前模型，包括动物模型和静态细胞培养，存在重要局限性，难以重现牙本质-牙髓界面的生理条件，也无法准确预测人体对牙科生物材料的生物学反应。器官芯片（Organ-on-a-chip, OoC）技术通过在可控的微流控系统中重建组织特异性微环境，提供了一种替代方案。本文描述了一种逐步操作的实验方案，用于构建和组装一种包含人牙本质圆片的牙本质-牙髓复合体OoC装置，该装置集成于三层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控平台中。该方案包括牙本质圆片制备、利用光刻技术制备微结构模具、PDMS浇铸与固化、等离子体辅助层键合、装置组装、泄漏测试，以及在静态培养条件下接种牙髓干细胞。文中讨论了影响装置性能的关键制备参数，包括PDMS层厚度的控制、等离子体表面处理，以及牙本质圆片在装置内的整合以最大限度减少泄漏。通过扫描电子显微镜和共聚焦活/死细胞染色法评估了装置内细胞的黏附性和活力。代表性结果表明，牙本质圆片成功整合至微流控装置中，能够维持无泄漏状态，并且活的牙髓干细胞可黏附于牙本质表面。本方案为构建牙本质-牙髓复合体OoC平台提供了一种可重复的方法，有望支持未来关于细胞对牙科生物材料及微环境刺激反应的研究。

引言

动物实验长期以来在增进对病理和生理过程的理解方面发挥了重要作用，并在药物研发的早期阶段占据核心地位1。在20世纪期间，人类预期寿命显著提高，尽管无法精确量化这一改善在多大程度上完全归功于动物研究，但普遍认为，许多现代医学治疗方法的开发或验证都依赖于动物模型2。显著的例子包括针对脊髓灰质炎、麻疹和乙型肝炎的疫苗研发，青霉素安全性和有效性的评估，以及胰岛素的生产。在牙科和生物材料研究领域，这些模型对于探索龋病过程、牙本质-牙髓复合体的生物学与再生，以及牙周组织的生理病理学具有关键意义3,4。

尽管这些方法被广泛使用，当前的药物研发流程仍表现出较高的失败率，许多候选药物在临床前实验室环境和动物模型中显示出有效性和安全性，却在临床试验阶段失败5。这种差异与物种间的差异有关，由于不同物种之间在解剖结构、遗传和生理方面的差异，可能限制了动物模型在转化预测方面的可靠性6。此外，新治疗手段的开发仍然耗时且成本高昂7。同时，传统的体外模型主要采用在非生理性的塑料基质上建立的简单二维（2D）单层细胞培养，无法重现人类口腔中存在的生化与物理信号、细胞间相互作用以及细胞外基质（ECM）信号传导8,9.。尽管二维模型具有一定的实验优势，但其本质上无法模拟多种组分之间同时发生的复杂相互作用，例如生物膜、生物材料、牙本质和牙髓细胞之间的相互作用10。因此，人们日益关注能够更准确地再现人类生物学反应的替代性实验平台的开发。2022年，美国《现代化法案2.0》取消了药物审批过程中强制进行动物实验的要求，并认可包括器官芯片（organ-on-a-chip, OoC）技术在内的替代平台在临床前研究中的潜在应用11。

器官芯片（OoC）是一种微流控装置，旨在模拟特定器官或组织组分的结构、功能及其微环境12。这些装置中培养有活细胞和组织，位于经过工程化设计的微通道内，可重现细胞在体内自然暴露的关键生理微环境特征。除了结构上的模拟外，微通道还能实现对细胞环境的时空精确控制，并支持组织特异性功能的维持，从而提供比传统培养系统更接近体内生理状态的实验条件12。尤为重要的是，OoC装置中的微通道可实现培养基的可控流动，从而对驻留细胞施加剪切应力13。这些机械刺激会影响细胞的多种响应，包括黏附、增殖、迁移、基因表达以及细胞间相互作用14,15。此外，持续的培养基流动通过提供营养物质并清除代谢废物，有助于维持稳定的微环境16。进一步研究表明，与传统的二维（2D）培养相比，某些OoC平台在三维（3D）芯片模型中能够更好地调控与氧化应激相关的检测指标，如细胞内活性氧水平和细胞活力17。因此，OoC系统已成为在受控实验条件下研究组织生理、生物材料相互作用及疾病过程的有前景平台18。在牙科研究中，OoC技术已逐步应用于构建日益复杂的口腔组织界面模型19。早期的“牙芯片”平台模拟了生物材料–牙本质–牙髓界面20，而更先进的版本则进一步整合了血管系统和三叉神经支配，以更真实地再现牙髓-牙本质复合体的结构与功能复杂性21。在牙髓之外，针对未成熟根管的三维模型已被用于评估根管冲洗剂以及对来自根尖乳头的干细胞的促血管生成出芽效应22,23。在牙周层面，“牙龈芯片”平台已被用于研究宿主-微生物相互作用，并评估益生菌作为治疗剂的免疫调节潜力24；而“牙周韧带芯片”装置则揭示了间质液流动如何调控血管网络形成以及牙周韧带干细胞球体的成骨分化过程25,26。作为上述模型的补充，特化的“口腔黏膜芯片”和“牙种植体芯片”系统进一步拓展了牙科微流控研究的范围，可在生理相关条件下表征宿主-材料相互作用以及牙科单体的细胞毒性27,28。

尽管器官芯片（OoC）系统在牙科、口腔及颅面研究中的应用日益广泛，但持续推进制造流程的标准化与可重复性仍至关重要。已有若干“牙芯片”模型见于文献报道20,29,30,31，展示了不同的装置构型与实验应用。然而，装置结构、制造方法、牙本质的引入方式以及实验参数报告方面的差异，可能限制研究间的可重复性与直接比较。特别是微通道几何形状、牙本质整合策略及制造方法的差异，可能影响装置内的生物学与机械微环境。部分已报道的模型引入牙本质以模拟牙本质-牙髓界面的某些特征20,29,30，而其他模型则采用替代构型31。此外，光刻、激光切割、微铣削和3D打印等制造方法各自具有特定的优势与局限性，具体取决于预期的装置设计与应用。进一步地，装置的结构取向是决定其生物学适用性的关键因素，尤其是通道与牙本质切片呈水平或垂直排列19,32。在水平堆叠构型中，相邻排列的腔室有利于横向区室化及细胞的实时观察，因此特别适用于建模具有固有横向空间组织的组织，如牙周复合体24,32。然而，这种设计在重建垂直生物学界面（如生物材料-牙本质-牙髓复合体）方面存在固有局限，因为腔室的横向排列无法真实再现牙本质屏障在体内从龋洞至牙髓的垂直取向20,32。垂直堆叠构型通过沿y轴叠加两个腔室，并以天然牙本质切片分隔，克服了这些局限，可同时量化分子在完整牙本质中的跨膜运输，并通过出口介质实时监测牙髓细胞反应30。然而，该取向的一个公认局限在于牙本质-细胞界面的横截面成像，因为在同一焦平面内获取牙本质-细胞界面的横截面图像在技术上比水平堆叠构型更具挑战性，后者中细胞与细胞外基质呈横向排列。尽管已有多种牙本质-牙髓复合体芯片模型见于文献报道，但大多数采用水平堆叠构型，其中腔室在同一平面内并排排列10,20,21,29，而将天然牙本质切片整合于垂直堆叠构型的研究相对较少30。尽管如此，这些模型在制造方法与参数报告方面的差异仍持续限制着可重复性与跨研究比较33。本论文旨在通过提供一种垂直堆叠式牙芯片装置的详细制造方案，提升方法学的可重复性，从而促进该平台在牙科研究领域的更广泛应用。

本文描述了一种垂直堆叠的牙本质-牙髓复合类器官芯片装置的逐步制备与组装方案，该装置在由光刻法制备的模具加工而成的三层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控平台中整合了人牙本质圆片。该方案还描述了在静态条件下将牙髓干细胞接种并培养于该装置内的方法。

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方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并已获得拉弗龙特拉大学伦理委员会批准，适用于涉及人类样本的研究。

1. 牙本质圆盘的获取

注意：在开始实验方案之前，先准备好装置设计（图 1A–1C）。

  1. 牙齿的采集与保存
    1. 在获得患者知情同意后，采集健康的成人磨牙或前磨牙。
    2. 将所有样本保存在0.5%氯胺溶液中，4°C条件下防止牙本质脱水和蛋白质变性。
    3. 储存期间每周更换一次氯胺溶液。
  2. 牙本质圆片的制备
    1. 使用转速为350,000 rpm的高速手机，配备圆柱形金刚砂车针（直径1 mm，粒径100–150 µm），在牙冠中1/3处水平截取牙齿。
    2. 切割过程中持续以约50 mL/min的水流冲洗降温。
    3. 将切片位置定于牙冠中1/3处，以避开髓腔以及咬合面沟窝处的釉质，从而获得主要由牙本质组织构成的圆片。
      注意：牙齿切割时必须持续进行水冷冲洗，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、口罩和护目镜。
  3. 牙本质圆片的修整
    1. 使用粒径逐级减小的抛光盘对牙本质圆片进行抛光处理。
    2. 持续抛光至最终牙本质厚度约为0.8 mm（±± 0.3 mm），侧向尺寸约为5 mm × 5 mm（±± 0.3 mm）（图1D）。
  4. 牙本质圆片的保存
    1. 将制备好的牙本质圆片置于0.5%氯胺溶液中，4°C保存，直至用于OoC装置组装。

微流控装置组装示意图；使用镊子、打孔工具和液体通道的制造阶段。
图1：牙本质–牙髓复合体类器官芯片（OoC）装置的设计与制造流程。（A）装置的三维设计图，显示三层结构。（B）装置设计的俯视图，标注主要尺寸。（C）三层装置结构的侧视图。（D）制备的代表性牙本质圆片，厚度约为0.8 mm，横向尺寸约为5 mm × 5 mm。（E）通过光刻技术制备的硅制主模具，用于浇铸上下两层聚二甲基硅氧烷（PDMS）层。（F）热聚合后，将固化的PDMS层从硅模具中取出。（G）在层间键合前对PDMS表面进行等离子体处理。（H）通过等离子体键合组装完成的三层牙本质–牙髓复合体OoC装置，并整合了牙本质界面。（I）组装好的装置连接管路，用于渗漏测试及微流控实验前的准备。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 牙本质-牙髓复合体类器官芯片装置的制备

  1. 工作区与材料的准备
    1. 准备材料与设备
      1. 在开始器件制备前，准备好材料表中列出的所有材料和设备。
      2. 在器件组装前准备好活检打孔器。
      3. 所有制备操作均需在洁净、无尘的环境中进行。
      4. 在整个器件制备与组装过程中佩戴手套、护目镜及适当的个人防护装备。
        注：在开始本方案前，需预先制备光刻法制备的模具（图1E）。
  2. 微结构模具的制备
    1. 硅片的准备
      1. 在一片4英寸单面抛光硅片（N型，砷掺杂，CZ生长法，<100>晶向，厚度500 ± 25 µm，TTV ≤ 10 µm，BOW ≤ 35 µm，电阻率0.001–0.005 Ω·cm）上制备模具。
      2. 在超声条件下，依次用丙酮、异丙醇和超纯水各清洗10分钟。
      3. 用压缩空气吹干硅片。
      4. 在热板上200°C下烘烤10分钟，以去除残留水分。
      5. 让硅片冷却至室温（RT；20°C–25°C）。
    2. 表面活化与光刻胶涂覆
      1. 使用真空等离子清洗机，在空气等离子模式下（等级7）处理硅片表面120秒，以实现表面活化。
      2. 采用旋涂法以300 rpm转速涂覆GM 1060环氧基负性光刻胶10秒。
      3. 继续以200 rpm/s的加速度，分别在565 rpm下旋涂100秒、965 rpm下旋涂1秒。
      4. 让涂覆后的硅片静置10分钟。
      5. 在65°C下预烘10分钟。
      6. 继续在95°C下预烘1小时。
      7. 让硅片冷却至室温。
    3. 曝光与显影
      1. 使用直写激光光刻系统以1,950 mJ/cm2的剂量对光刻胶进行曝光。
      2. 在65°C下后烘10分钟。
      3. 继续在95°C下后烘30分钟。
      4. 让硅片冷却至室温。
      5. 让硅片静置10分钟。
      6. 在PGMEA中显影4分钟。
      7. 若仍有残留光刻胶，每次延长显影30秒。
      8. 用异丙醇冲洗终止显影过程。
      9. 用压缩空气吹干硅片。
    4. 硬烘
      1. 在135°C下硬烘2小时。
      2. 获得包含微通道的微结构主模具，微通道尺寸为宽1 mm、高50 µm。
  3. PDMS混合物的配制与脱气
    1. PDMS混合物的配制
      1. 按10:1的质量比混合PDMS基体与固化剂。
      2. 在塑料烧杯中用玻璃棒手动搅拌约5分钟。
      3. 混合过程中保持缓慢、连续的圆周运动。
        注：避免在混合过程中引入气泡。
    2. 脱气
      1. 将PDMS混合物置于连接真空泵的真空干燥器中。
      2. 在约700 mmHg真空度下脱气5分钟。
      3. 短暂释放真空，使表面气泡破裂。
      4. 重新施加真空。
      5. 重复该循环，直至无可见气泡。
        注：总脱气时间通常约为30分钟。
  4. 在模具上浇铸PDMS
    1. 模具的准备
      1. 将模具置于平坦表面上。
      2. 用压缩空气清洁模具。
      3. 避免直接接触图案化表面。
      4. 确认模具表面无灰尘和污染物。
    2. PDMS的分配
      1. 在牙本质圆片周围分配约8 g PDMS，用于制备牙本质嵌入层。
      2. 调整PDMS高度，使其与牙本质圆片厚度（0.8 ± 0.3 mm）一致。
      3. 防止PDMS覆盖牙本质表面。
      4. 每个模具单元分配约0.26 g PDMS，用于制备每层微通道。
      5. 轻轻敲击模具或施加振动，以促进微结构的填充。
      6. 让PDMS充分流入最小结构中。
      7. 用盖子或平板覆盖模具，避免接触PDMS表面。
        注：牙本质嵌入层厚度约为0.8 mm，每层微通道层厚度约为0.4 mm，器件总厚度约为1.6 mm。
        注：若计划进行共聚焦成像，应根据共聚焦物镜的工作距离调整各层厚度。
  5. 固化
    1. 将模具置于50°C烘箱中。
    2. 固化PDMS 4小时。
  6. PDMS层的剥离
    1. 剥离固化后的PDMS
      1. 小心地将固化后的PDMS层从模具上剥离（图1F）。
      2. 操作PDMS层时需小心，避免损坏微结构。
  7. PDMS层的键合及进样口与出样口的制备
    1. 进样口与出样口的制备
      1. 使用1 mm活检打孔器在指定的进样口和出样口位置打孔。
      2. 打孔时使微通道侧朝上。
        注：将PDMS层置于切割垫上，以避免结构损伤。
      3. 在顶层打两个孔，对应上层微通道。
    2. PDMS层的清洁
      1. 使用异丙醇或乙醇清洁PDMS层。
      2. 用无菌胶带去除残留的灰尘颗粒。
      3. 在组装前确认所有键合表面无污染物。
    3. PDMS表面的等离子活化
      1. 将顶层和中层PDMS层置于手持式电晕等离子处理仪下进行处理（图1G）。
      2. 使用环境空气作为工作气体，以约25 W功率进行表面活化。
      3. 保持等离子源与PDMS表面之间约1 mm的工作距离。
        警告：应在适当通风条件下进行等离子处理，避免直接暴露于等离子产生的臭氧中。
      4. 启动等离子处理装置，并稳定5秒。
      5. 处理前确认产生均匀的等离子束。
      6. 以约5 mm/s的速度连续往复移动，对顶层PDMS处理10秒。
      7. 以相同运动方式和距离对中层PDMS处理10秒。
      8. 在键合前立即对顶层再进行1秒的额外等离子处理。
    4. 顶层与中层的键合
      1. 等离子处理后立即对齐上层微通道与牙本质圆片。
      2. 将顶层与中层键合在一起。
      3. 将键合后的组件置于75°C烘箱中5分钟。
      4. 在孵育过程中巩固键合。
        注：牙本质圆片与微通道肉眼可见，无需额外对齐工具即可对齐。
    5. 下层微通道孔的制备
      1. 通过已键合的顶层和中层，打两个孔对应下层微通道。
      2. 同时穿透两层打孔，以确保对齐。
        注：此步骤在顶层产生四个孔，在中层产生两个孔。
      3. 打孔前将键合组件置于坚固的切割垫上。
      4. 单次动作施加稳定向下的压力。
        注：避免旋转或侧向力，以最小化分层风险。
      5. 用浸有异丙醇的无绒无菌纱布清除孔位处的碎屑。
      6. 在充足照明下检查孔位及周围键合区域。
      7. 确认无分层、撕裂或未完全打孔后再进行下一步。
    6. 底层的键合
      1. 按步骤2.7.4所述对底层进行等离子处理。
      2. 对齐下层微通道的进样口与出样口与顶层和中层的孔位。
      3. 键合底层以完成器件组装。
        注：在键合前，在底层外表面标记进样口与出样口位置，以方便对齐。
        注：文献报道，等离子腔室可提供比等离子笔更强的键合效果36。
        注：完成的器件为三层微流控平台，包含牙本质界面（图1H）。下层牙本质表面代表模型的牙髓侧，上层牙本质表面代表冠部侧，用于接触牙科生物材料或细菌制剂。
  8. 微流控器件的漏液检测
    1. 组装后器件的检查
      1. 检查组装后的器件是否存在错位。
      2. 检查组装件是否存在键合不完全或可见漏液。
    2. 漏液检测
      1. 将19G鲁尔锁针头连接至进样口（图1E）。
      2. 将针头连接至微流控泵管路。
      3. 轻轻将针头插入打孔的端口，以获得气密性连接。
      4. 以10 µL/min的流速注入无菌PBS或培养基。
      5. 维持液体流动至少5分钟。
      6. 在流动过程中检查所有键合界面、通道边缘及牙本质圆片边界。
      7. 在注射过程中及之后，在充足照明下观察器件。
      8. 确认无液体积聚、湿润或液滴形成。
      9. 若未检测到漏液，则判定器件无漏。
      10. 丢弃出现漏液的器件。
        注：在进行细胞接种或实验使用前，应对每个制备的器件进行漏液检测。
  9. 微流控器件的灭菌与储存
    1. 灭菌
      1. 在超净台内，将组装后器件的顶面暴露于UV光（254 nm）下30分钟。
      2. 将底面再暴露于UV光下30分钟。
      3. 用70%乙醇冲洗微通道20分钟。
      4. 用无菌PBS冲洗微通道三次，以去除残留乙醇。
    2. 储存
      1. 灭菌后立即用于细胞培养实验。
      2. 或可将器件浸没于无菌PBS中，置于无菌容器内于4°C储存，直至使用。
        警告：器件组装后不得使用氯胺或其他消毒溶液，因为PDMS可能吸收这些化合物，从而影响细胞活力。

3. 牙髓干细胞黏附性与活力的评估

  1. 牙本质表面预处理
    1. 向装置中注入10% EDTA。
    2. 使EDTA溶液与牙本质表面保持接触15分钟。
    3. 每3分钟注入0.5 mL EDTA，以维持微通道内液体的流动。
    4. 用超纯水将牙本质圆片洗涤三次。
    5. 每次洗涤维持 5 分钟。
      注意：EDTA 处理可去除玷污层并暴露牙本质基质蛋白。
      警告：操作 EDTA 溶液时应佩戴手套和护目镜，以避免刺激皮肤和眼睛。
  2. 牙髓干细胞接种
    1. 牙髓干细胞的扩增
      1. 将种子牙髓干细胞以1 × 10的密度接种至T75培养瓶中6 每瓶细胞数。
      2. 将细胞置于培养箱中孵育 37°C 和5% CO2 直至达到约80%融合度。
      3. 使用胰蛋白酶消化细胞使其脱落。
      4. 使用完全培养基中和胰蛋白酶。
      5. 离心细胞悬液以获得细胞沉淀。
      6. 使用台盼蓝评估细胞活力。
      7. 使用活率≥90%的细胞悬液。
    2. 细胞悬液的制备
      1. 制备预热的细胞悬液 37°C.
      2. 将细胞浓度用完全培养基调整至100,000个细胞/mL。
      3. 制备终体积为1–2 mL的悬浮液。
        注：本研究使用第5代细胞。
    3. 细胞接种
      1. 将细胞悬液注入下层微通道的入口。
      2. 细胞接种后倒置装置
        注意：装置倒置可促进细胞向牙本质表面沉降，并增强细胞黏附。
    4. 孵育
      1. 将倒置的装置放入培养皿中。
      2. 向培养皿中加入 1 mL 培养基以减少蒸发。
      3. 将装置置于培养箱中孵育 37°C 和 5% CO2 24 小时。
      4. 孵育期间保持静态培养条件。
        注意：本研究未进行动态流验证。
        注意：本方案描述了用于初始设备验证和细胞黏附评估的静态培养条件。
    5. 初步设备验证
      1. 使用扫描电子显微镜评估细胞黏附性
      2. 通过拆卸装置在分析前取出牙本质圆盘。
  3. 扫描电子显微镜样品制备
    1. 样本的取出与洗涤
      1. 孵育24小时后拆卸装置。
      2. 取出牙本质圆盘并转移至培养皿或培养板中。
      3. 将接种细胞的牙本质表面朝上放置。
      4. 用 1 mL PBS 清洗牙本质圆片两次。
    2. 固定
      1. 加入2 mL 2.5% 戊二醛（溶于0.1 M Sorensen磷酸盐缓冲液中）。
      2. 在室温下孵育样品 30 分钟。
        警告：戊二醛具有毒性，可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。固定操作应在化学通风橱内进行，并佩戴适当的个人防护装备。
    3. 固定后的洗涤步骤
      1. 去除戊二醛溶液。
      2. 在室温下用超纯蒸馏水清洗牙本质圆片三次。
    4. SEM分析
      1. 使用环境扫描电子显微镜分析样品。
      2. 在低真空条件（25 Pa）下操作显微镜。
      3. 使用10.0 kV的加速电压和7.0 mm的工作距离。
      4. 使用背散射电子三维检测模式（BSE-3D）采集图像。
      5. 以 ×200 放大倍率拍摄图像（图2A).
  4. 通过共聚焦显微镜评估细胞活力
    1. 样品制备
      1. 按照步骤3.2所述接种并培养细胞。
      2. 将装置在 24 h 内孵育 37°C 和 5% CO2.
      3. 拆卸装置并暴露牙本质表面。
      4. 将牙本质圆片转移至含有预热HBSS的孔板中+/+ 添加 Ca2+ 和 Mg2+.
    2. 样品洗涤
      1. 用HBSS清洗牙本质片两次+/+.
      2. 染色前去除残留的血清和酚红。
        注意：残留的血清和酚红可能会增加背景自发荧光。
    3. 活细胞染色
      1. 配制新鲜的Calcein AM工作液 2 µM 在 HBSS 中+/+.
      2. 加入足量染色液以完全覆盖牙本质表面。
      3. 在20分钟内将样品孵育 37°C 在暗处。
      4. 孵育后移除染色液。
    4. 死细胞染色
      1. 加入碘化丙啶工作液（1–2 µg/mL 在 HBSS 中+/+).
      2. 孵育样品 5–8 分钟，温度为 37°C 在暗处。
      3. 孵育时间不得超过10分钟。
      4. 用HBSS洗涤样本两次+/+.
      5. 保持样本在缓冲液中浸没，直至成像。
    5. 共聚焦显微镜图像采集
      1. 染色后30分钟内获取共聚焦图像。
      2. 依次在绿色和红色通道中采集图像。
      3. 使用 λex 490 nm 和 λem 活细胞成像用515 nm。
      4. 使用 λex 535 nm 和 λem 617 nm用于死细胞成像。
        注意：在孵育和成像过程中，需避免荧光染色溶液及染色样本暴露于光线下图2B).

电子显微镜与荧光显微镜比较，细胞结构分析。
图2：牙髓干细胞在牙本质–牙髓复合体类器官芯片（OoC）装置中黏附性与活力的代表性评估。（A）扫描电子显微镜图像显示，在类器官芯片装置中静态培养24小时后，黏附于牙本质表面的牙髓干细胞（白色星号标记）。培养24小时后，黏附细胞覆盖了暴露于微通道的牙本质表面的54.35 ± 0.92%。在聚二甲基硅氧烷（PDMS）覆盖的牙本质区域未观察到细胞（黑色星号标记），表明装置各层之间实现了有效密封。比例尺 = 200 µm。（B）共聚焦显微镜图像显示，经绿色染色的活牙髓干细胞黏附于牙本质表面（白色箭头），在静态培养24小时后仍保持活力；同时可见经红色染色的非活细胞（蓝色箭头）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

牙芯片装置的成功制备遵循了图1A–1I所示的工作流程，包括牙本质圆片制备（图1D）、基于光刻技术的模具制备（图1E）、固化PDMS层的剥离（图1F）、键合前的等离子活化（图1G）、最终装置的组装（图1H）以及装置与微流控系统的连接（图1I）。所获得的装置由三层PDMS结构组成，其中牙本质圆片完全集成于中间层内，上下微通道分别位于牙本质表面的两侧（图1H）。

此阶段的成功结果表现为无可见气泡或分层现象，并且在通过入口注入 PBS 或培养基后无液体泄漏（

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讨论

本研究描述了一种逐步构建垂直堆叠式牙芯片装置的实验方案，该装置整合了牙本质和牙髓干细胞，并展示了在静态培养条件下装置内细胞黏附和存活的代表性结果。该方案的开发旨在为构建和组装适用于牙本质-牙髓复合体界面体外研究的牙芯片平台提供可重复的操作流程。建立此类标准化流程具有重要意义，因为我们在近期的一项系统综述中指出，牙本质-牙髓复合体的微流控模型领域仍处于发展阶段，不同研究在装置结构和材料方面存在高度的方法学异质性，严重限制了当前牙芯片模型的可重复性和标准化程度34。通过提供详细且可重复的实验流程，本研究弥补了这些不足，推动了更为明确的生物模型的发展。在器官芯片技术应用于口腔生物学的更广泛背景下，França 等人15率先开发了一种整合牙本质圆片和成牙本质样细胞的微流控牙芯片模型，证明了在动态微流控环境中重建牙本质-牙髓界面的可行性，并评估了牙科材料引起的细胞毒性反应。自这一开创性工作以来，文献中已陆续报道了越来越多的口腔器官芯片平台34，涵盖牙体组织生物学、生物材料相互作用以及口腔微生物学等多个方面...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益，且无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由智利前沿大学研究处项目 DIM24-0004 和项目 PP24-0031、FONDECYT 常规项目 No. 1260116 以及智利国家研究与开发署（ANID）FONDECYT 启动项目 No. 11230701 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>生物与化学材料
丙酮专家问答SOLV 8硅片清洗
α-MEM 培养基CytivaSH30265.02牙髓干细胞培养基
氯胺（0.5%）默克7080-50-4牙本质圆片保存液
牙髓干细胞不适用不适用原代细胞培养。参见步骤 3.2.1 和 3.2.2
EDTA（10%）温克勒N2222158E去除玷污层
基于环氧的负性光刻胶GersteltecGM1060光刻模具制备
0.1 M 索伦森液中的戊二醛（2.5%）’磷酸盐缓冲液Sigma-Aldrich210908-06扫描电镜固定
健康的恒牙（磨牙或前磨牙）不适用不适用人类样本
异丙醇专家问答SOLV 16晶圆清洗、显影终止及PDMS清洗
LIVE/DEAD 活性检测试剂盒Sigma-Aldrich451荧光活力染色 
PBS（磷酸盐缓冲盐水）康宁46-013-CM清洗与泄漏测试
PDMS 基底和固化剂（聚二甲基硅氧烷）道Sylgard 184设备制备
PGMEASigma Aldrich484431光刻胶显影
台盼蓝Sigma Aldrich T8154-100ml细胞活力评估
胰蛋白酶康宁25-053-CI细胞解离
超纯水CytivaSH30529.01洗涤液
<强>耗材与实验器具
19G 注射器针头VmaticVCB19050连接带有微泵或注射器的装置
活检穿孔器（直径：1 mm）Harris UnicoreWHAWB100073进样口和出样口的制备
切割垫Nicecool不适用打孔过程中的表面保护
牙科抛光盘（例如 Sof-Lex）3MSof-Lex牙本质抛光
女性鲁尔接头转凸形接头适配器Runze FluidicsRH-M016管路连接
玻璃或塑料搅拌棒杜兰不适用PDMS混合
皮下注射器蔓越莓pc-12246细胞接种与渗漏检测
无尘无菌纱布Linderson不适用清除打孔碎屑
雄性鲁尔接头Runze FluidicsRH-G016管路连接
混合容器Duran不适用PDMS 制备
培养皿（140 mm） × 20 mmDeltalab2000219细胞培养/孵育
聚四氟乙烯基底CCTVal不适用中层牙本质制备
硅片焦作商业FineWin不适用模具制备
硅胶管Runze Fluidics96421流体连接
T75 培养瓶康宁 353136牙髓干细胞扩增
培养板SPL Life Sciences30006共聚焦染色与成像样品制备
<强>设备与仪器
空气干燥器METALPLANTITAN-040压缩空气干燥
压缩空气源SCHULZCSD-18.1霉菌与表面清洁
共聚焦显微镜Olympus不适用型号：FV1000
直接激光光刻系统海德堡uPG 101光刻胶曝光
环境扫描电子显微镜日立不适用型号：Quanta 400 
高速手机Nakanishi不适用型号：Pana-max2
热板LabTechEH20A Plus晶圆烘烤与光刻胶烘烤
层流柜BioBaseBBS8V1708313D设备灭菌
微流控泵新时代不适用型号：1002X-ES。在10处进行泄漏测试 µL/min
微结构模具（通过光刻技术制备）CCTVal不适用参见第2.2步了解模具制造规格
烘箱或培养箱MemmertUN110PDMS 在 50 ℃ 下固化°C 和 75 下的键合固化°C
真空等离子清洗腔室法里血浆GD-5晶圆等离子体活化
手持式电晕等离子体 Aurora Pro 科学仪器APS-CD-20ACPDMS 等离子体活化
超声波破碎仪Elma SonicS 10 (H)晶圆清洗
真空室或干燥器（250 mm）Winglass不适用PDMS 脱气
真空泵ROCKER300PDMS 脱气

参考文献

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