孔圣枕中丹在自闭症相关通路中的作用机制：基于网络药理学、分子对接与实验验证的研究

摘要

本研究整合网络药理学、分子对接和分子动力学（MD）模拟，阐明空生镇中丹（KSZZD）在自闭症谱系障碍（ASD）中的核心活性成分和治疗靶点，通过丙氨酸扫描鉴定关键结合残基，并在丙戊酸诱导的ASD大鼠模型中验证其作用效果。

摘要

自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育障碍，其发病机制与慢性神经炎症密切相关。作为经典的中药复方，孔圣枕中丹（KSZZD）因其具有报道的神经保护作用，常用于治疗神经发育障碍和记忆障碍，但其在ASD中的具体分子机制尚不明确。本研究结合网络药理学、分子对接分析和分子动力学（MD）模拟，从系统和原子水平系统阐明KSZZD治疗ASD的核心活性成分及潜在治疗靶点。随后通过丙氨酸柔性扫描鉴定关键结合残基，并利用丙戊酸（VPA）诱导的ASD大鼠模型评估其生物学效应。网络药理学分析表明，KSZZD中的关键成分槲皮素可能通过调控TNF-α介导的炎症信号通路发挥部分作用。分子对接结果显示，KSZZD核心成分与其靶点的结合能均低于-5.0 kcal/mol，其中槲皮素与TNF的结合亲和力最强（-8.52 kcal/mol）。分子动力学模拟提示，槲皮素可在TNF-α的活性口袋中保持稳定的结合状态，丙氨酸扫描进一步鉴定出GLU104和GLN102为维持该复合物结构稳定性的关键氨基酸残基。体内实验表明，槲皮素干预显著改善了VPA诱导的ASD大鼠的运动和探索行为，并有效降低了血清和脑组织中TNF-α的表达水平。这些结果提示，槲皮素可能至少部分通过抑制TNF-α信号通路，参与介导KSZZD的预测疗效。

引言

自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种复杂的神经发育障碍，其特征为社交沟通障碍、兴趣范围狭窄以及重复刻板行为¹。ASD 的病理机制极为复杂，涉及遗传变异、表观遗传调控与环境因素之间的相互作用，最终导致突触可塑性受损和神经环路连接异常^2,3。中枢神经系统（CNS）的慢性炎症在 ASD 的发病机制中起核心作用，针对神经炎症的干预措施已成为有前景的治疗策略。

孔圣枕中丹（KSZZD）是一个经典的中药方剂，首次记载于《备急千金要方》。该方由四种药用植物组成：龟甲、龙骨、远志和石菖蒲。传统上，孔圣枕中丹用于补益心肾、安神定志。临床上，常用于治疗智力发育迟缓和记忆障碍⁴。现代药理学研究表明，孔圣枕中丹及其活性成分具有神经保护、抗炎和抗氧化作用，并可能改善神经发育障碍模型中的学习、记忆及类似焦虑的行为表现⁵。我们的植物化学分析显示，槲皮素及其他黄酮类化合物是该方剂的关键活性成分，能够穿透血脑屏障并表现出显著的抗炎活性⁶。然而，这些活性成分在自闭症谱系障碍（ASD）中介导孔圣枕中丹治疗作用的具体机制仍不清楚。

方案

网络药理学分析

"自闭症"作为关键词用于在 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）中检索与自闭症相关的靶点^12,13,14。从数据库中获取的靶点在去除重复条目后进行合并。对于数据库预测未涵盖的活性成分已知靶点，依据文献报道予以补充¹⁵。疾病相关靶点及药物成分的潜在靶点均通过 UniProt 蛋白质数据库（https://www.uniprot.org/）统一标准化为基因符号，并对这两组靶点进行比对，以确定 KSZZD 治疗自闭症的潜在治疗靶点¹⁶。

基于传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），根据口服生物利用度（OB ≥ 0.30）和类药性指数（DL ≥ 0.18）的标准，筛选出康肾止浊方（KSZZD）中潜在的生物活性成分及其相应作用靶点¹⁷化合物的SMILES标识符从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi....

结果

基于网络药理学研究探讨康寿增智丹治疗自闭症的作用机制分析

从 GeneCards 数据库中检索到共 15,770 个与自闭症相关的靶点。筛选相关性评分 ≥ 4.21 的靶点作为自闭症的潜在靶点，得到 1,014 个疾病靶点。将 KSZZD 的 827 个靶点与 1,014 个自闭症靶点取交集，获得 125 个共同靶点。使用 SRplot 平台³¹（https://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化，并绘制韦恩图，如图 1A所示。这 125 个靶点被认为是 KSZZD 可能发挥自闭症相关作用的潜在作用位点。

将KSZZD丸的活性成分及其作用靶点导入参考软件（见材料表）进行网络可视化分析，并剔除度值为0的活性成分节点。在图1B的全局网络中，菱形节点代表药物，方形节点代表.......

讨论

一个关键的问题是，为何选择槲皮素而非其他核心成分进行实验验证，以及它是否能够代表抗癫痫解毒方（KSZZD）的整体效应。这一选择基于以下多方面的证据：（i）在产前VPA诱导的大鼠模型中，槲皮素显著预防了社交互动缺陷和脑部氧化损伤²⁹；（ii）在丙酸诱导的自闭症模型中，口服槲皮素降低了脑内TNF-α水平并改善了类自闭样行为³⁰；（iii）在LPS诱导的神经炎症模型中，槲皮素以剂量依赖的方式缓解了类焦虑行为并减少了炎症性细胞因子²⁸。综上，这些发现支持槲皮素在与自闭症谱系障碍（ASD）相关的模型中具有神经保护和抗炎作用。其次，已有研究表明槲皮素能够穿透血脑屏障³²，这是靶向中枢TNF-α介导的神经炎症的前提条件。第三，从网络药理学的角度来看，独立研究已将槲皮素鉴定为多种经典中药复方中针对神经精神疾病的枢纽核心化合物³³，这支持了优先选择枢纽化合物进行下游实验验证的合理性。综合来看，这些数据表明，作为KSZZ.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 羧甲基纤维素钠生理盐水溶液	文中未说明	未说明	作为空白/模型组及槲皮素混悬液的溶媒。
0.9% 生理盐水	文中未说明	未说明	用于空白对照组母鼠注射的溶媒。
含4% 多聚甲醛的PBS溶液	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK	用于脑组织固定。
75% 酒精	文中未说明	未说明	用于动物间开放场实验装置的清洁。
无水乙醇	文中未说明	未说明	用于包埋前组织脱水。
碱性水	文中未说明	未说明	用于苏木精染色切片的返蓝。
Amber14SB 蛋白力场	文中未说明	不适用	用于分子动力学模拟的蛋白力场。
BATMAN-TCM 数据库	文中未说明	不适用	在线靶点筛选数据库：http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225	用于组织匀浆液的蛋白定量。
返蓝试剂	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7301	苏木精染色后用于细胞核返蓝。
CDOCKER 模块	文中未说明	不适用	用于分子对接的半柔性对接模块。
透明/脱蜡试剂	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	Clear-Rite 3, 6901	可用于组织学流程中的透明和脱蜡步骤。
CytoNCA 插件	文中未说明	不适用	用于度中心性分析的 Cytoscape 插件。
Cytoscape 软件	文中未说明	版本 3.10.0	用于网络可视化和蛋白质-蛋白质相互作用分析。
Discovery Studio 软件	文中未说明	版本 2019 和 2021	用于受体预处理、对接和丙氨酸扫描。
Draw Venn Diagram 在线工具	文中未说明	不适用	用于维恩图的在线工具：http://bioinformatics.psb.ugent.be
伊红-Y（醇溶性）	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7111	用于 H&E 染色中的胞质复染。
全自动脱水机	文中未说明	未说明	用于固定脑组织的梯度脱水。
GeneCards 数据库	文中未说明	不适用	用于获取自闭症相关靶点的在线数据库：https://www.genecards.org/
GraphPad Prism 软件	文中未说明	版本 9.5	用于统计分析和作图。
苏木精染色液	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7211	用于 H&E 染色中的细胞核染色。
HERB 数据库	文中未说明	不适用	用于补充化合物筛选的在线数据库：http://herb.ac.cn
盐酸酒精	文中未说明	未说明	用于 H&E 染色过程中的分化步骤。
Metascape 平台	文中未说明	不适用	用于 GO 和 KEGG 富集分析的在线平台。
酶标仪	Thermo Scientific	Multiskan FC, 51119000	用于在 450 nm 波长下读取吸光度。
显微镜	文中未说明	未说明	用于观察 H&E 染色的脑切片。
Microsoft Excel 软件	Microsoft	未说明	使用 RANDBETWEEN 函数对大鼠进行随机分组。
封片介质	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	4111	用于染色切片的盖玻片封固和永久封片。
开放场实验装置	文中未说明	未说明	50 cm × 50 cm × 30 cm 的箱体，用于行为学测试。
石蜡	文中未说明	未说明	用于脑组织的石蜡包埋。
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Gibco	10010023	用作预冷的组织匀浆缓冲液。
PLIP 相互作用指纹分析	文中未说明	不适用	用于蛋白-配体相互作用指纹分析。
PubChem 数据库	文中未说明	不适用	用于获取 SMILES 标识符的在线数据库：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
槲皮素	文中未说明	未说明	以 100 mg/kg/天的剂量经灌胃给药。
大鼠 TNF-α ELISA 检测试剂盒	Invitrogen	ERA56RB	适用于血清和组织匀浆中 TNF-α 的检测。
冷冻离心机	Thermo Scientific	Sorvall ST 16R, 75004383	用于血清和组织匀浆的离心。
Schrödinger Suite 软件	Schrödinger, LLC	版本 2024	用于构建分子动力学模拟系统。
SPF 级 Sprague-Dawley 大鼠	文中未说明	未说明	使用 3 只雄性和 3 只雌性大鼠建立动物模型。
SPSS 软件	文中未说明	版本 25.0	用于统计分析。
SRplot 平台	文中未说明	不适用	用于可视化的在线平台：https://www.bioinformatics.com.cn/
STRING 数据库	文中未说明	版本 12.0	用于构建蛋白质-蛋白质相互作用网络：https://string-db.org/
SwissTargetPrediction 平台	文中未说明	不适用	用于靶点预测的在线平台：http://swisstargetprediction.ch/
TCMSP 数据库	文中未说明	不适用	用于生物活性化合物筛选的在线平台：http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
TIP3P 水模型	文中未说明	不适用	用于分子动力学模拟的水模型。
UniProt 蛋白质数据库	文中未说明	不适用	用于将靶点名称标准化为基因符号：https://www.uniprot.org/
丙戊酸（VPA）溶液	文中未说明	未说明	在妊娠第12.5天以 600 mg/kg 剂量腹腔注射。
视频记录系统/摄像机	文中未说明	未说明	用于记录大鼠在开放场实验中的运动行为。