一种基于紫外线的ChIRP方法，用于可验证直接与LncRNA相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

摘要

一种基于紫外线的ChIRP方法用于识别直接的lncRNA-蛋白质相互作用。

摘要

长非编码RNA（lncRNA）已成为多种生物过程的重要调控因子。然而，大多数lncRNA功能背后的分子机制仍然了解不足。识别相互作用蛋白，特别是RNA结合蛋白（RBPs），是阐明lncRNA功能的关键策略。在现有方法中，结合质谱的全面RNA结合蛋白鉴定（ChIRP）因其探针设计简单和工作流程简便而被广泛应用。传统ChIRP依赖对甲醛（PFA）交联，该交联既捕捉直接的RNA-蛋白质接触，也通过桥接因子介导的间接相互作用。相比之下，紫外交联结合严格洗涤条件优先保留直接的RNA-蛋白质相互作用。以lncRNA Tug1 为模型，在ChIRP框架下比较了培养细胞中的紫外线交联和PFA交联，证明基于紫外线的ChIRP能促进lncRNA与蛋白质的直接相互作用。这种基于紫外线的工作流程随后扩展到小鼠睾丸，在紫外交联前将组织解离为单细胞悬浮液，从而在原生组织环境中识别 Tug1结合蛋白。与细胞系衍生的相互作用组比较显示了共享和组织特异性相互作用体。通过增强交联免疫沉淀（eCLIP）独立验证了两种共享的直接相互作用。这种基于紫外线的ChIRP方法被称为cPDiRT（直接捕捉与RNA靶点相互作用的蛋白质）。cPDiRT共同使得在培养细胞和原生组织中识别lncRNA结合蛋白成为可能。组织解离与紫外交联的结合，为研究不同器官系统中直接的lncRNA-蛋白质相互作用提供了广泛适用的策略。

引言

最近的高通量转录组研究揭示了数千种参与多种生物过程的长非编码RNA（lncRNA），从染色质组织到细胞^{信号传导1,2}。尽管表达广泛且功能重要，大多数lncRNA的分子机制仍不明确。一个主要障碍是识别它们的物理蛋白伙伴，特别是RNA结合蛋白（^RBPs）3,4,5。

目前以RNA为中心的方法主要依赖化学交联，该技术既捕捉直接又间接的RNA-蛋白质相互作用。因此，这些方法更适合全球相互作用组映射，而非识别真实的直接^接触6。综合鉴定RNA结合蛋白并进行质谱（ChIRP-MS）是一种广泛使用的lncRNA-RBP相互作用图谱技术，因其探针设计简便且工作流程高效，^7,8。传统ChIRP-MS使用对甲醛（PFA）交联，捕捉直接的RNA-蛋白接触及桥^接因子介导的间接结合^9,10。

相比之下，254纳米的紫外交联具有关键优势。它仅在RNA和蛋白质处于近零距离接触（通常为<1 ^Å）时才实现共价连接。该过程将氢键转化为稳定的共价键，并实现严格的高盐洗涤条件，去除非共价结合的间接相互作用物。因此，基于紫外线的方法比化学交联方法在直接RNA-蛋白质相互作用方面提供了更高的特异性（^12,13）。然而，基于紫外线的方法在组织来源的lncRNA相互作用组研究中仍然未被充分利用，主要原因是对交联效率的担忧和紫外线穿透力有限。

为了在生理学相关背景下研究lncRNA与蛋白质的直接相互作用，选择了lncRNA Tug1 作为模型系统。由于其严重的敲除表型和睾丸高富集性， Tug1 代表了验证组织兼容直接交互工作流程的理想基准。 Tug1 的基因消融导致男性完全不育、精子生成受损及精子形态异常¹⁴。此外， Tug1 还支持高脂饮食小鼠的Sertoli细胞功能和睾丸屏障完整性¹⁵。尽管这些表型已被充分确立，但介导睾丸中 Tug1 功能的直接蛋白质伙伴仍然未知——睾丸是表达大量RBPs的器官，最近实验分析出¹⁶种RBP。这一知识空白很大程度上反映了大多数lncRNA-蛋白质相互作用定位方法已开发于培养细胞系统。

为解决这一限制，ChIRP框架被修改，将PFA交联替换为紫外交联，以捕获直接与 Tug1相互作用的蛋白质。候选者相互作用通过增强交联免疫沉淀后进行深度测序（eCLIP-seq）¹⁷独立验证。该工作流程进一步扩展至组织应用，将新鲜小鼠睾丸组织解离为单细胞，再进行紫外交联。这种优化方法被称为cPDiRT（直接捕捉与RNA靶点相互作用的蛋白质）。

在小鼠睾丸中将cPDiRT应用于 Tug1 ，实现了在原生组织环境中的直接相互作用定位。在培养细胞中的平行实验提供了基于PFA和紫外线的相互作用谱的并排比较。结合独立的eCLIP验证，该方法生成了一组高置信度的分子伙伴，可能在精子生成过程中参与 Tug1 功能。本研究方案能够捕获直接与目标lncRNA相互作用的蛋白质，既可在培养细胞内，也在本地组织中。通过定义睾丸中 Tug1 的直接相互作用组，该方法推动了对生育必需lncRNA的机理性研究，并为研究生殖及其他复杂组织中lncRNA与蛋白质相互作用提供了可推广的平台。

方案

所有溶液均使用无核酸酶、无蛋白酶的超纯水和试剂制备。所有试剂和设备均列于 材料表中。

所有动物实验均经南京医科大学动物伦理委员会批准（批准号：IACUC-1812003-4），并依据《 实验动物护理与使用指南 》（国家研究委员会第八版）进行。养育雄性C57BL/6只4周大的小鼠，实行12小时光照/12小时黑暗周期，并可自由获取食物和水。通过使用最少动物数量来减少动物痛苦，以实现统计显著性。按照批准的机构规范，先吸入二氧化碳后进行宫颈脱位安乐死小鼠。

1. 准备缓冲区

1. 准备细胞裂解缓冲液
   1. 制备含有50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、10 mM EDTA和1% SDS的细胞裂解缓冲液。
   2. 使用前立即加入1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂组合和专用RNase抑制剂。
      注意： SDS是一种皮肤和眼睛刺激物。避免吸入灰尘或气溶胶。PMSF毒性极高，具有胆碱酯酶抑制作用，且在水溶液中不稳定。使用前请立即准备PMSF。操作这些试剂时请戴手套和安全眼镜。在化学排气柜中处理PMSF。
2. 准备杂交缓冲液
   1. 制备含750 mM NaCl、1% SDS、50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、1 mM EDTA 和15%甲酰胺的杂交缓冲液。
   2. 使用前立即加入1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂组合和专用RNase抑制剂。
      注意： 甲酰胺储存在4°C，避免光照。
      注意： 甲酰胺是一种致畸性和生殖危害。在化学排气柜内佩戴手套、实验服和安全眼镜时，使用甲酰胺。避免吸入和皮肤接触。
3. 准备洗涤缓冲剂
   1. 准备含有50 mM三盐酸盐（pH 7.0）、1 M NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40、0.1% SDS 和 0.5% 脱氧胆酸钠的洗涤缓冲液。
   2. 储存时要保护洗涤缓冲液免受光照。
4. 制备蛋白酶K（PK）缓冲液
   1. 制备含有100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl（pH 7.0）、1 mM EDTA和0.5% SDS的PK缓冲液。
   2. 使用前立即将蛋白酶K加入最终5%浓度。

2. 设计和准备探测器

1. 设计反义探针
   1. 使用 singlemoleculefish.com¹⁸号提供的在线探针设计器设计反义寡核苷酸探针。
2. 获取生物素化探针
   1. 订购含有3'-生物素TEG修饰的反义DNA探针。
3. 准备探测池
   1. 将每个探针单独稀释至100微米。
   2. 将所有探针的体积等量混合生成探针池。保持最终联合寡核苷酸浓度为100微米。
   3. 探针池储存在-20°C。
      注意： 推荐的探针设计参数如下：（i）每100碱基对靶RNA一个探针，（ii）目标GC含量为45%，（iii）探针长度为20 nt，（iv）探针间距为60–80 nt。
      注意： 如果RNA超过探针设计者接受的尺寸限制，设计前将序列分割成更小的段。排除重复区域和具有广泛序列同调的区域。

3. 进行细胞采集、组织解离和紫外交联

1. 准备无紫外线控制
   1. 对照样品与实验样品并行制备。
   2. 对照样品中省略紫外交联步骤。
   3. 所有后续操作，包括超声波、RNA-蛋白质拉下、RNA提取和蛋白质提取，均对两组进行相同操作。
      注意： 利用无紫外控制区分紫外线依赖的RNA-蛋白质相互作用与非特异性背景结合。
2. 采集细胞并进行紫外交联
   1. 洗涤培养细胞
      1. 用PBS清洗细胞三次以去除残留培养基。
   2. 交联细胞
      1. 均匀地将3毫升PBS均匀分布在15厘米的培养皿上。
      2. 以4000 mJ/cm²剂量照射254纳米紫外交联剂中的细胞。
   3. 收集交联细胞
      1. 在交联后采集PBS中的细胞。
      2. 离心分离悬浮液，丢弃上清液。
      3. 称重颗粒，确认每个样品的最低颗粒质量为500毫克。
3. 解离睾丸组织并进行紫外交联
   1. 准备睾丸
      1. 取出睾丸胶囊。
      2. 用DMEM洗纸巾两次。
   2. 进行胶原酶消化
      1. 在37°C下，将含有1 mg/mL胶原酶IV的DMEM组织培养5–15分钟。
      2. 继续消化直到释放出细管。
         注意： 消化时间不要超过15分钟。
   3. 清洗细管
      1. 在1000 ×克 下离心，4°C离心1分钟。
      2. 去除上清液。
      3. 用5–10毫升DMEM清洗沉淀。
      4. 在同样条件下再次离心。
   4. 进行胰蛋白酶消化
      1. 将沉淀重新悬浮在含1 mg/mL DNase I的0.25%胰蛋白酶中。
      2. 在37°C下孵育5–15分钟。
         注意： 消化时间不要超过15分钟。
   5. 停止酶促消化
      1. 加入等量的DMEM，并补充10%的FBS。
   6. 生成单电池悬浮液
      1. 将悬浮液过滤过70微米的电池过滤。
   7. 洗涤槽
      1. 离心机电池在2000 ×克 下4°C下5分钟。
      2. 丢弃上清液。
      3. 用5–10毫升PBS清洗沉淀。
      4. 在同样条件下再次离心。
   8. 交联睾丸细胞
      1. 在PBS中重新悬浮单细胞悬浮液。
      2. 将悬浮液均匀分布在15厘米的培养皿上。
      3. 以4000 mJ/cm²剂量照射254纳米紫外交联剂中的细胞。
   9. 收集交联细胞
      1. 对于无紫外线控制，省略辐照。
      2. 在PBS中收集细胞。
      3. 离心分离悬浮液，丢弃上清液。
      4. 称重颗粒，确认每个样品的最低颗粒质量为500毫克。
         注意： 获得约500毫克细胞沉淀所需的小鼠数量取决于年龄和组织产量。本研究使用了约10至12只四周龄的小鼠。

4. 进行超声波处理

1. 制备裂解液
   1. 将细胞沉淀液以100毫克沉淀剂兑1毫升缓冲液的比例重新悬浮于细胞裂解缓冲液中。
   2. 充分混合以获得均匀的悬浮液。
2. 超声盐样品
   1. 通过水浴超声波器或聚焦超声波器进行超声代谢液裂解。
   2. 继续超声波，直到裂解液变得清晰。
      注意： 通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA片段。继续超声波，直到大多数DNA片段在1 kb到2 kb之间。

5. 进行RNA-蛋白质拉下

1. 收集输入样本
   1. 去除裂解液的分割度以进行输入控制。
   2. 预留约10微升用于RNA分析，10微升用于蛋白质分析。
   3. 在杂交和洗涤过程中，保持输入样品温度在37°C。
2. 预清除裂解物
   1. 每个样品中加入30微升预洗磁珠。
   2. 在37°C下将样品培养30分钟，并用杂交炉轻柔混合。
      注意： 使用前要清洗磁性珠。将珠子分量放在磁性支架上，放置1分钟或直到溶液变透明。完全去除储存液。用500微升细胞裂解液洗涤两次。
3. 去除预清理珠
   1. 将样本放在磁性支架上。
   2. 将上清液转移到新的管子上。
   3. 重复转移一次以确保完全去除残留的珠子。
4. 杂交探针
   1. 每个样品加入两体积的杂交缓冲液。
   2. 以1微升100微米探针库存与1毫升裂解液的比例加入探针（补充表1）。
5. 培养杂交反应
   1. 在37°C下，采用端对端轮换方式在杂交箱中孵育12–16小时。
6. 准备捕捉珠
   1. 在杂交结束前，用细胞裂解缓冲液洗涤100微升磁珠三次。
   2. 洗完后清除所有残留缓冲液。
7. 捕获探针束缚复形
   1. 简要的离心机杂交反应。
   2. 将洗净后的珠子重新悬浮在1毫升杂交样品中。
8. 将络合物绑定到珠子上
   1. 把珠子悬挂器放回原管。
   2. 在37°C下培养并混合30–40分钟。
9. 回收珠子
   1. 简要用离心机取样。
   2. 将管子放在磁性支架上，放置1–2分钟，或直到溶液变透明。
   3. 丢弃上清液。
   4. 用移液器吸头去除残留液体。
      注意： 在取液过程中避免扰动磁珠颗粒。
10. 洗涤捕获复形
    1. 加入1毫升洗涤液。
    2. 在37°C下清洗珠子，连续搅拌5分钟。
    3. 重复洗涤程序五次。
       注意： 洗涤缓冲液含有1 M NaCl，能破坏非共价蛋白-蛋白和蛋白-RNA的相互作用，同时保留共价紫外线诱导的交联。这些严格条件去除了间接相互作用者和非特异性背景，从而富集了直接的蛋白质伙伴¹⁹。
11. RNA分析储备材料
    1. 将1%–10%的洗净珠转移到新管中进行RNA分析。
    2. 剩余的珠子应立即用于蛋白质提取，或保存至-80°C。
       注意： 如有必要，请在此暂停该程序。将珠样保存在-80°C，直到蛋白质提取完成。
12. 游出蛋白
    1. 在珠子上加入SDS样本缓冲液。
    2. 在95°C下煮样品30分钟，以洗脱蛋白质并反向交联。
    3. 进行质谱分析。

6. 提取RNA

1. 消化蛋白
   1. 将珠结合RNA样本重新悬浮于100微升的PK缓冲液中。
   2. 使用PK缓冲液将RNA输入样品调整至最终体积为100微升。
2. 与蛋白酶K一起孵育
   1. 在50°C下培养样本45分钟，并进行连续混合。
3. 失活蛋白酶K
   1. 在95°C下加热样品10分钟。
4. 加入TRIzol试剂
   1. 每个样品中加入500微升TRIzol试剂。
   2. 彻底地漩涡。
   3. 在室温下孵育5分钟。
      注意： TRIzol试剂含有酚和硫氰酸胍。在化学熏风罩中佩戴手套、实验服和安全眼镜时，接触试剂。避免吸入和皮肤接触。如果发生皮肤接触，立即用肥皂和水清洗。
5. 进行相分离
   1. 向每个样品加入100微升氯仿。
   2. 彻底地漩涡。
   3. 在室温下孵育5分钟。
6. 恢复水相
   1. 离心机在4°C下取样15分钟。
   2. 将上层水相转移到新的管子中。
7. 将RNA结合到纯化柱上
   1. 向水相中加入等量的100%乙醇。
   2. 充分搅拌。
   3. 将样本装入RNA纯化柱上。
8. 纯化RNA
   1. 按照制造商的说明进行RNA清理。
   2. 在30微升无核酸酶水中洗脱RN。
9. 通过qRT-PCR验证RNA富集
   1. 每次反应使用1微升洗脱RNA，进行定量逆转录PCR（qRT-PCR）。
   2. 评估目标RNA富集相对于对照组的表现。

7. 进行LC-MS/MS分析

1. 通过SDS-PAGE分离蛋白
   1. 将 步骤5.12 中获得的蛋白质与4×LDS样本缓冲液混合。
   2. 在4%–12%的Bis-Tris凝胶上分离蛋白。
   3. 用银色染色套装给凝胶染色。
   4. 把整个蛋白质通道作为一条单独的条去切除。
2. 消费税凝胶碎片
   1. 用干净的手术刀切除蛋白带。
   2. 尽量减少多余的凝胶。
   3. 将凝胶切成大约^1毫米， 每块3块。
   4. 将凝胶片段转移到0.5毫升的管子中。
3. 去渍凝胶片
   1. 加入100微升的染色溶液。
   2. 漩涡持续10分钟。
   3. 离心机在14,000 ×克 下运行1分钟。
   4. 去除上清液。
   5. 重复染色过程，直到凝胶片变得透明。
4. 还原蛋白
   1. 加入100微升还原溶液。
   2. 在56°C下孵育30分钟。
   3. 将样品冷却至室温。
   4. 短暂离心并去除上清液。
5. 烷基酸蛋白
   1. 加入100微升烷基化溶液。
   2. 在室温下黑暗孵育20分钟。
   3. 去除上清液。
   4. 用100微升消化缓冲液清洗凝胶块5分钟。
6. 消化蛋白
   1. 加入足够的胰蛋白酶溶液，完全覆盖凝胶碎片。
   2. 在37°C下孵育16–18小时。
7. 提取物肽
   1. 加入30微升萃取液。
   2. 用超声疗剂15分钟，或者用Vortex吸30分钟。
   3. 离心机在14,000 ×克 下运行1分钟。
   4. 将上清液转移到新的管子上。
   5. 重复拔出程序两次。
   6. 汇集所有提取物。
   7. 将浓缩的提取物在真空浓缩器中干燥约1小时。
8. 用StageTip清洁肽
   1. 将干燥肽重新悬浮于20微升0.1%甲酸（FA）中。
   2. 将样本加载到C18 StageTip上。
   3. 离心机在1000 克× 克下循环2分钟。
   4. 用20微升0.1% FA液清洗StageTip。
   5. 将20微升60%乙酰腈/0.1%脂肪酸洗脱肽洗脱到LC-MS小瓶中。
   6. 把洗出液晾干。
   7. 将肽类重悬于10微升，含0.1% FA。
      注意： 如有必要，请在此暂停该程序。在进行LC-MS/MS分析前，将纯化肽储存在-80°C。
9. 获取LC-MS/MS数据
   1. 在0.1%的甲酸中重构肽。
   2. 分离肽段置于75微米×250毫米C18分析柱上，流量为300 nL/min。
   3. 施加以下溶剂B梯度（0.1%甲酸在乙腈中）：
      0–40分钟内B含量2%–25%
      40至48分钟内B为25%–40%
      50–57分钟内B组40%–99%
      保持99%B状态3分钟
   4. 将质谱仪以数据依赖采集模式操作。
   5. 获取350–1200米区间的全扫描MS光谱，分辨率为70,000。
   6. 获取十五次连续高能碰撞解离（HCD）MS/MS扫描，分辨率为17,500。
   7. 每次扫描记录一次显微扫描。
   8. 将动态排除设置为30秒。
10. 过程质谱数据
    1. 使用MaxQuant（v2.1.0.0）处理原始数据。
    2. 搜索从UniProt下载的小鼠蛋白序列的光谱。
    3. 指定胰蛋白酶作为消化酶。
    4. 允许最多两次未被切割。
    5. 将甲硫氨酸氧化指定为可变修饰。
    6. 指定半半胱氨酸氨基甲基化为固定修饰。
    7. 前驱体和片段质量容忍度分别设为15 ppm和20 ppm。
    8. 在肽和蛋白质水平上控制假发现率，均为1%。
    9. 利用基于iBAQ的无标记定量估计蛋白质丰度。

8. 进行基因本体富集分析

1. 分析功能富集
   1. 使用 clusterProfiler R 软件包（v4.6.0）进行基因本体（GO）富集分析。
   2. 使用GO数据库（v2024-09-20）作为参考注释源。
   3. 对多重检测应用本杰米尼-霍赫伯格修正。
   4. 将统计显著性定义为调整后的P值（FDR）<0.05。

9. 执行eCLIP-seq验证

1. 准备eCLIP样本
   1. 如前所述，进行增强型交联免疫沉淀（eCLIP）¹⁷。
   2. 制备紫外交联细胞样本，用于PABPC1和CCT3的免疫沉淀。
   3. 使用eCLIP裂解缓冲液进行裂解样本。
2. 免疫沉淀RNA-蛋白质复合物
   1. 每个样本加入10微克抗体。
   2. 在磁珠上捕捉RNA-蛋白质复合物。
   3. 在免疫沉淀前采集输入样本。
3. 制备RNA文库
   1. 去磷酸化蛋白结合RNA。
   2. 将一个3英尺的RNA适配器与回收的RNA连接。
   3. 在严格条件下洗涤免疫沉淀和输入样本。
   4. 通过煮沸珠子来洗脱络合物。
   5. 样品在4%–12%的Bis-Tris梯度凝胶上分辨。
   6. 将分离的配合物转移到硝化纤维素膜上。
4. 回收RNA
   1. 切除尺寸匹配的膜区域。
   2. 利用尿素和蛋白酶K消化蛋白质。
   3. 从膜中回收RNA。
5. 生成测序库
   1. 逆转录将RNA恢复为cDNA。
   2. 使用外切酶I和虾碱性磷酸酶混合物纯化cDNA。
   3. 用T4 RNA连接酶将DNA转接器连接到cDNA的3'端。
   4. 利用高精度DNA聚合酶扩增文库。
   5. 在3%低熔点琼脂糖凝胶上分离扩增文库。
   6. 使用凝胶提取套件纯化选定的文库。
   7. Illumina平台上的序列库。
6. 分析eCLIP-seq数据
   1. 使用ENCODE eCLIP流水线²⁰分析测序数据。
   2. 使用cutadapt（v1.14）的修饰适配器和3英尺适配器二聚体。
   3. 使用STAR（v2.7.6a）对齐读到UCSC重复元素。
   4. 移除reads映射到重复元素。
   5. 将剩余读段比对到MM10参考基因组（GENCODE vM23）。
   6. 去除PCR重复样本。
   7. 使用CLIPPER识别富集结合位点。
   8. 将显著峰值定义为褶皱富集≥8，调整后P值≤0.001的峰值。
   9. 使用不可重复发现率（IDR）阈值0.01识别可重复峰。

结果

为了鉴定Tug1结合蛋白，紫外交联被纳入ChIRP工作流程，建立了一种称为cPDiRT的方法（见图1）。传统ChIRP最初在GC2细胞中进行，以富集Tug1相互作用蛋白（见图2A，B）。质谱分析鉴定出相对于负对照组富集的190多种蛋白质（图2C;补充表2）。相比之下，在优化的4000 mJ/^cm²紫外线剂量下进行的cPDiRT-MS检测，发现了一组更具选择性的蛋白质（见图2C;补充表2），其中三分之二以上与传统ChIRP-MS检测到的重叠（见图2C）。作为次优结果的例子，紫外交联不足导致RNA富集减少和拉下效率降低。传...

讨论

cPDiRT作为一种改进的ChIRP协议开发，用紫外交联取代了对甲醛（PFA）交联，以选择性捕捉LNCRNA与蛋白质的直接相互作用。通过将新鲜睾丸组织酶解为单细胞，并结合紫外交联，直接相互作用定位从培养细胞系扩展到原生组织。在培养细胞中进行的平行实验使得基于PFA和紫外的方法能够并列比较，并且通过eCLIP-seq独立验证了紫外源的相互作用。这些结果表明，紫外交联可以在保持高特异性的同时成功整合进组织样本的ChIRP工作流程。

由于组织穿透困难、分子间交联伪影以及间接关联带来的背景升高，少有研究将基于PFA的RNA中心方法如ChIRP应用于组织样本。这些限制限制了基于组织的lncRNA相互作用组定位的更广泛应用，并促使cPDiRT作为组织级研究更具体替代方案的发展。

cPDiRT的一个关键特性是能够在近生理条件下区分直接与间接相互作用。传统的基于PFA的方法稳定了大型大分子复合物，因此能够捕捉直接和间接的结合。相比之下，紫外交联仅在蛋白质与目标RNA直接物理接...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% Trypsin-EDTA溶液	Gibco	25200056	用于组织解离和单细胞悬液制备
100%乙醇	Sigma-Aldrich	459844	用于RNA清理
AffinityScript逆转录酶	Agilent	600107	用于eCLIP cDNA合成
抗CCT3抗体	Abcam	Ab225878	用于eCLIP的抗体
抗PABPC1抗体	Abcam	Ab312314	用于eCLIP的抗体
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432	用于RNA提取
胶原酶IV型	Sigma-Aldrich	C5138	用于睾丸组织的酶解解离
去磷酸化试剂（T4 PNK）	New England Biolabs	M0201S	用于eCLIP RNA去磷酸化
高葡萄糖DMEM培养基	Gibco	11965092	用于细胞培养和组织解离缓冲液
Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠	Thermo Fisher Scientific	65001	用于捕获生物素化探针-RNA-蛋白质复合物
DynaMag-15磁铁	Thermo Fisher Scientific	12301D	用于磁珠分离
DynaMag-2磁铁	Thermo Fisher Scientific	12321D	用于磁珠分离
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	用于在溶解和洗涤缓冲液中螯合二价阳离子
核酸外切酶I	New England Biolabs	M0293S	用于eCLIP cDNA纯化
胎牛血清（FBS）	Gibco	10099141C	用于终止胰蛋白酶消化
甲酰胺	Thermo Fisher Scientific	AM9342	用于杂交缓冲液制备
杂交炉	TUOHE	LF-I	用于探针杂交和磁珠洗涤
低熔点琼脂	Sigma-Aldrich	A9414	用于eCLIP文库大小选择
MinElute凝胶提取试剂盒	Qiagen	28604	用于eCLIP文库大小选择
miRNeasy微型试剂盒	Qiagen	217004	用于RNA纯化
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	用于制备高盐洗涤缓冲液
硝基纤维素膜	GE Healthcare / Amersham	10600002	用于eCLIP蛋白质印迹转移
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	用于洗涤缓冲液洗涤剂
核酸酶和蛋白酶免费水	Thermo Fisher Scientific	10977035	用于制备无核酸酶的溶液
NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	用于eCLIP大小选择
NuPAGE Bis-Tris预装凝胶	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	用于SDS-PAGE蛋白分离
PBS（pH 7.4）	Thermo Fisher Scientific	10010023	用于细胞洗涤和重悬
苯甲磺酰氟（PMSF）	Sigma-Aldrich	P7626	细胞裂解缓冲液的丝氨酸蛋白酶抑制剂；在使用前新鲜添加
蛋白酶抑制剂鸡尾酒	Roche	4693132001	细胞裂解缓冲液的广谱蛋白酶抑制剂；在使用前新鲜添加
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P4850	用于RNA提取中的蛋白消化
qRT-PCR母液	Thermo Fisher Scientific	11704044	用于定量RT-PCR以确认RNA富集
RNase/蛋白酶免费DNase I溶液	Thermo Fisher Scientific	EN0521	用于组织解离
RNeasy微型试剂盒	Qiagen	74104	用于RNA纯化
SDS-PAGE样品装载缓冲液	Beyotime	P0286	用于蛋白样品制备
虾碱性磷酸酶	New England Biolabs	M0371S	用于eCLIP cDNA纯化
银染试剂盒	Beyotime	P00175	用于SDS-PAGE凝胶中蛋白质可视化
胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750	用于洗涤缓冲液洗涤剂
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	L3771	用于细胞裂解和蛋白变性
Superase-in RNase抑制剂	Thermo Fisher Scientific	AM2694	专用RNase抑制剂；在使用前新鲜添加
T4 RNA连接酶	New England Biolabs	M0204	用于eCLIP适配子连接
Tris-HCl（pH 7.0）	Sigma-Aldrich	T5941	用于制备溶解、杂交和洗涤缓冲液
TRIzol试剂	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	用于RNA提取
超声细胞破碎器	ATPIO	ATPIO-650D	用于细胞裂解和DNA片段化
紫外线交联仪	Analytik Jena	UVP CL-1000	用于RNA-蛋白相互作用的紫外线交联
尿素	Sigma-Aldrich	U5128	用于膜上的eCLIP蛋白质降解