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在老年C57BL/6J小鼠中进行L5腰椎板切除术以建立术后认知功能障碍模型

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DOI：

10.3791/71733

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2026年9月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种在老年C57BL/6J小鼠中进行标准化L5腰椎板切除术的方法，旨在建立术后认知功能障碍模型，同时最大限度地减少运动功能损伤，从而支持围手术期神经认知障碍的行为学、组织学及机制研究。

摘要

术后认知功能障碍（POCD）是手术和麻醉后常见的神经系统并发症，尤其多见于老年患者，与恢复延迟、住院时间延长以及生活质量下降相关。骨科和脊柱手术与较高的POCD风险相关；然而，目前仍缺乏能够紧密模拟脊柱手术围手术期特征的临床前模型。常用的模型，如剖腹手术和胫骨骨折模型，可能引起持续的运动功能障碍和长期的外周炎症，从而干扰对认知行为结果的解读。本文所述方案介绍了一种标准化、低成本的POCD建模方法，即在18月龄雄性C57BL/6J小鼠中，采用七氟烷麻醉下行L5腰椎椎板切除术。该手术使用常规外科器械完成，可在最小化持续性运动功能缺陷的同时，产生可控的手术损伤。认知功能通过新物体识别实验、新臂Y迷宫和Barnes迷宫进行评估，而海马区神经元损伤和神经炎症变化则分别通过尼氏染色和Iba1免疫荧光染色进行检测。代表性结果表明，术后小鼠运动活动保持正常，但认知表现受损，海马神经元完整性降低，且海马神经炎症增强。这一标准化且易于实施的模型为研究脊柱手术相关认知功能障碍的机制以及评估潜在的围手术期神经保护干预措施提供了具有临床相关性的研究平台。

引言

术后认知功能障碍（POCD）是指在麻醉和手术后出现的学习与记忆、注意力、处理速度以及执行功能的下降1，主要影响老年患者，其报告发生率因手术类型和患者人群不同而有所差异2,3。据报道，接受择期骨科手术的老年患者中，POCD 发生较为频繁4。临床上，POCD 可在术后持续数周至数月，并与住院时间延长及死亡率升高相关5,6,7。随着全球人口老龄化持续加剧以及手术量不断上升，POCD 已成为一个重要的公共卫生和围手术期管理问题。

从病理生理学角度来看，术后认知功能障碍（POCD）被认为是一种由手术创伤和麻醉暴露引发的多因素综合征，其神经功能障碍的潜在机制可能包括神经炎症、氧化应激、自噬调节紊乱以及突触功能障碍，这些机制在海马等与认知相关脑区中尤为显著8。为了深入解析这些机制并评估潜在干预措施，研究人员已开发出多种临床前POCD研究模型。这些临床前模型包括仅使用麻醉的模型、基于腹部手术的模型，以及基于骨科损伤的模型（如胫骨骨折模型）9。尽管这些模型推动了该领域的发展，但它们可能无法完全模拟脊柱手术相关的围手术期特征；此外，其中一些模型可能引入了持续性运动功能障碍和长期组织炎症等混杂因素，从而影响认知评估结果的解读及对潜在机制的分析。

在现有的外科手术策略中，我们选择L5腰椎椎板切除模型，以在标准化且与脊柱相关的手术背景下研究术后早期认知功能障碍。该手术在吸入麻醉下提供可控的局部手术损伤，可在不引起明显运动功能障碍的情况下，用于研究术后神经炎症反应及认知功能障碍。通过对关键手术步骤的优化，本方案为研究脊柱手术相关认知功能障碍以及评估围手术期神经保护策略提供了一种标准化、实用且经济有效的方法。

方案

所有动物实验均按照《实验动物护理与使用指南》进行，并经浙江大学动物护理与使用委员会批准（伦理批准编号：ZJU20260153）。

1. 术前准备

  1. 实验动物、分组、镇痛与盲法
    1. 使用18月龄雄性C57BL/6J小鼠，体重30–34 g。将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄食和饮水。
    2. 手术前让小鼠在饲养环境中适应至少7天。适应期结束后，将小鼠随机分配至L5椎板切除组或对照组。
    3. 在实验操作前为每只小鼠分配一个编码识别号。保留分组编码信息，以便在不知分组情况的条件下进行行为学评估。
    4. L5椎板切除组小鼠接受七氟烷麻醉，随后进行L5腰椎椎板切除术。对照组小鼠不接受七氟烷麻醉、手术区域准备或任何外科干预。
    5. 两组小鼠均皮下注射美洛昔康，剂量为2 mg/kg。L5椎板切除组在麻醉诱导后给予首次给药，对照组在与手术结束时间点相对应的时间给予首次给药。
    6. 两组小鼠均在首次给药后，每隔24 h皮下注射美洛昔康（2 mg/kg），持续48 h。实验期间，两组小鼠均在相同条件下饲养、操作和监测。
    7. 两组小鼠的行为学评估均按照相同的实验时间表进行。确保执行行为学评估的研究人员对分组情况保持盲态。
  2. 对所有外科器械进行灭菌，并对外科操作区域进行消毒。预先加热保温垫以维持麻醉期间的体温。准备用于围手术期给药的美洛昔康。
  3. 打开气体麻醉机，将小鼠放入诱导室。以1 L/min的氧气流速，使用3–5%七氟烷诱导全身麻醉，持续3–5分钟。
  4. 将麻醉后的小鼠转移至手术平台。通过麻醉面罩以0.5–0.8 L/min的氧气流速维持1.5–3%七氟烷麻醉。皮下注射美洛昔康，剂量为2 mg/kg。从七氟烷诱导开始计算，总麻醉时间约为4 h。根据需要调整七氟烷浓度，以维持稳定的外科麻醉深度。
  5. 将小鼠置于俯卧位，腰椎朝上。用胶带轻轻固定前肢以稳定动物体位，并确保L5手术区域无障碍暴露。
  6. 通过确认足底回缩反射消失来判断麻醉深度是否足够。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
  7. 使用小型动物毛发修剪器去除腰椎中线区域（约L3–S1）的毛发。先用75%乙醇对暴露的皮肤进行消毒，再用聚维酮碘消毒，重复2–3次以确保无菌条件。

2. L5 腰椎椎板切除术

注意：在本方案中，所有手术步骤均在直接可视化下进行，未使用体视显微镜或放大手术放大镜。

  1. 将麻醉后的小鼠俯卧位置于预热的手术平台上。用胶带固定前肢以稳定身体，并充分暴露腰部区域（图1）。
  2. 利用体表标志确定L5椎体水平。触诊双侧髂嵴，并画一条连接其最高点的假想横线。
  3. 以该横线作为L5–L6椎间隙的大致定位标志。将计划的皮肤切口中心略偏向该线头侧，以对准L5椎板。
  4. 消毒手术区域。在预定的L5水平做一条长约1.5–2.0 cm的正中纵向皮肤切口，暴露L4–L6节段。
  5. 用无菌镊子牵开皮肤切口边缘。暴露背侧筋膜并识别正中筋膜裂线。
  6. 暴露脊柱后确认椎体水平。识别腰骶交界处及最尾端的腰椎椎体。
  7. 因C57BL/6小鼠通常具有六个腰椎椎体，故L5为位于L6头侧紧邻的椎体。从腰骶交界处向头侧数两个椎体以确认该水平。
  8. 沿正中筋膜裂线做一小切口。在直视下将椎旁肌向两侧牵开。
  9. 分离L5棘突 周围的肌肉，暴露其下方的椎板。 将暴露范围向头侧延伸至L4棘突，向尾侧延伸至L6棘突，直至三个棘突均清晰可见。
  10. 主要使用棉签或精细镊子进行钝性、贴近骨面的解剖。仅在必要时采用锐性解剖以松解筋膜粘连，并尽量减少出血。
  11. 用 棉签维持侧向牵拉，充分暴露L5椎板及L5–L6椎板间隙。在继续操作前再次确认椎体水平。
  12. 用镊子轻轻夹住L5棘突，将棘突及相邻腰椎抬起至与手术台成约30°角，以扩大L5–L6椎板间隙。
  13. 在直视下将眼科剪闭合的尖端插入L5–L6椎板间隙。沿L5椎板尾缘下方的浅层平面推进剪刀。
  14. 轻微张开剪刀以形成初始骨性开口。通过沿椎板边缘逐次去除小骨片来扩大椎板切除窗。骨质去除范围应限于L5背侧椎板，避免向两侧关节突关节方向扩大骨窗。
  15. 避免插入过深或施加过大的剪切力，以防损伤硬脑膜。
  16. 逐步去除椎板，直至通过骨窗清晰可见硬脑膜。
  17. 仔细检查手术区域。确认无活动性出血，并核实硬脑膜保持完整。
  18. 用温热的无菌生理盐水冲洗手术区域。通过轻柔压迫实现止血。
  19. 逐层缝合伤口。使用6-0尼龙缝线缝合皮肤，并对切口部位进行消毒。
  20. 伤口缝合后，继续维持七氟烷麻醉，直至总麻醉时间达到约4 h。随后停止七氟烷给药，转入术后护理阶段。

3. 术后护理

  1. 在对应腰椎板切除组手术结束时间点时，对对照组小鼠皮下注射美洛昔康，剂量为 2 mg/kg。将每只腰椎板切除组小鼠置于温度可控的加热垫上，并维持体温直至小鼠恢复意识并表现出稳定的自主呼吸和运动活动。
  2. 腰椎板切除组小鼠在完全从麻醉中恢复后，将其放回各自的饲养笼中。此后持续监测动物，直至观察到正常行走能力。对两组小鼠均在术后每 24 小时皮下注射一次美洛昔康（2 mg/kg），共给药 48 小时。
  3. 术后第 3 天内每日检查手术切口及缝线完整性。如发现缝线松动或断裂，必要时重新麻醉小鼠并重新缝合。
  4. 每日检查切口是否存在肿胀、出血、渗出或局部炎症迹象。
  5. 在整个术后期间监测体重、理毛行为、自主活动以及食物和水的摄入情况。
  6. 若小鼠出现以下任一预定义的人道终点标准，应在预定实验终点前实施人道安乐死：术前体重丢失 ≥20%；完全厌食持续 24 小时，或连续 3 天摄食量低于正常量的 50%；从麻醉恢复后持续 24 小时无法站立或不愿接近食物或饮水；或处于濒死状态，表现为明显精神沉郁并伴有体温低于 37 °C。

4. 术后认知功能障碍的行为学评估

  1. 旷场实验（运动功能控制；术后第3天）
    1. 在光照强度为20 lux的条件下，使用一个45 cm × 45 cm、墙高40 cm的旷场进行实验。将视频摄像机置于旷场正上方中央位置，确保整个测试区域均在视野范围内。
    2. 将小鼠放置于旷场中央，放置后立即开始视频追踪。允许小鼠自由探索5分钟。利用视频追踪系统分析完整的5分钟实验过程，计算总移动距离和平均移动速度。
  2. 步态分析
    1. 在术后第3天使用自动化步态分析系统进行步态分析。
    2. 将每只小鼠置于步道的一端，使其自由穿越步道。利用步态分析系统内置的高速摄像机记录运动过程中的足印。
    3. 为每只小鼠记录步态试验，并收集三次具有连续向前运动的有效运行数据，用于后续分析。
    4. 使用步态分析软件分析记录的足印数据。检查系统自动识别的足印，并在必要时手动校正右前足、左前足、右后足和左后足的分类，再提取步态参数。
    5. 量化步幅长度、支撑时间、摆动速度和足印面积，并根据每只小鼠的三次有效运行数据计算平均值，用于统计分析。
  3. 巴恩斯迷宫（空间学习与记忆；术后第4–6天）
    ​注意：从术后第4天开始，连续三天每天进行一次巴恩斯迷宫测试。每天在相同的时间段内进行测试，以最小化昼夜节律变异。
    1. 将逃生箱置于指定的目标孔下方。在整个实验过程中保持目标位置不变。
    2. 将小鼠置于迷宫中央以开始每次试验。允许小鼠最多用3分钟寻找逃生箱。当小鼠进入逃生箱时，结束该次试验。
    3. 若小鼠在3分钟内未能找到逃生箱，则轻柔引导其至目标孔。允许小鼠在逃生箱中短暂停留，以强化任务学习。
    4. 使用视频追踪系统记录逃逸潜伏期和行进距离。对于未能在3分钟内进入逃生箱的小鼠，逃逸潜伏期记为180秒。统计分析仅包含第3天最后一次测试会话中记录的逃逸潜伏期和行进距离。
  4. 新物体识别（识别记忆；术后第3–4天）
    ​注意：使用与旷场实验相同的实验箱和视频追踪系统。在术后第3天进行旷场实验，使小鼠适应测试环境，再进行新物体识别训练。
    1. 在训练阶段，将两个相同的圆柱形物体对称放置于实验箱内。允许小鼠自由探索5分钟。
    2. 经过1小时的保留间隔后，将一个熟悉的圆柱形物体替换为一个新的立方体形物体。在不同小鼠之间交替新物体的位置，以消除可能的位置偏好。允许小鼠自由探索5分钟。
    3. 使用视频追踪系统记录对熟悉物体和新物体的探索时间。仅将总物体探索时间不少于3秒的小鼠纳入分析。
    4. 计算偏好指数（PI）：
      figure-protocol-1
      定义Tnovel和Tfamiliar分别为测试阶段中探索新物体和熟悉物体所花费的时间。
  5. 新臂Y迷宫（空间识别记忆；术后第5天）
    1. 在由三个相同臂组成、彼此夹角为120°的Y形迷宫中进行测试。随机使用不透明门封闭其中一个臂，并将该臂定义为新臂。
    2. 从两个开放臂中随机选择一个作为起始臂，另一个开放臂定义为熟悉臂。将小鼠置于起始臂末端，允许其自由探索两个可进入的臂，持续5分钟。
    3. 经过1小时的试验间间隔后，移除不透明门，并将小鼠重新置于同一起始臂末端。
    4. 允许小鼠自由探索所有三个臂，持续5分钟。
    5. 定义一次臂进入为追踪到的身体中心从中央区域进入预定义的臂区域。使用视频追踪系统记录进入各臂的次数及在各臂停留的时间。
    6. 计算基于时间的新臂偏好指数：
      figure-protocol-2
      定义Tnovel、Tstart和Tfamiliar分别为在新臂、起始臂和熟悉臂中所花费的时间。
    7. 计算基于进入次数的偏好指数：
      figure-protocol-3
      定义Enovel为进入新臂的次数，Etotal为测试试验期间进入所有三个臂的总次数。

5. 组织处理、尼氏染色和免疫荧光染色

  1. 组织处理
    1. 在预定的实验终点，使用以2 L/min氧气流速输送的3%七氟烷深度麻醉小鼠。
    2. 通过脚掌回缩反射消失确认麻醉深度充分。在维持深度麻醉且心脏停搏前，进行经心脏灌注，使用20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）以清除血管内血液。
    3. 立即用20 mL 4%多聚甲醛（PFA）对小鼠进行灌注。
    4. 小心解剖取出全脑。将脑组织置于4% PFA中，于4 °C下后固定24小时。
    5. 将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，直至组织完全沉底。
    6. 将脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。
    7. 迅速冷冻包埋组织，并于−80 °C保存，直至进行冰冻切片。
  2. 尼氏染色
    1. 将16 µm冰冻切片恢复至室温。将载玻片空气干燥20分钟。
    2. 用PBS冲洗载玻片2分钟。
      注意：染色前确保组织切片牢固附着于载玻片上。
    3. 用甲苯胺蓝染色液完全覆盖切片。于55 °C孵育30分钟。
      注意：根据经验优化16 µm切片的染色时间，以避免过度染色。
    4. 用蒸馏水快速冲洗载玻片10–30秒。
    5. 依次用95%、85%和75%乙醇对切片进行分化，每次2分钟。
      注意：如有必要，调整分化时间以优化染色强度。
    6. 用新鲜二甲苯清洗载玻片两次，每次5分钟。
      注意：所有二甲苯操作均应在化学通风橱中进行。
    7. 用中性树胶封片。将盖玻片轻轻覆盖在每张切片上。
    8. 使用配备20×物镜的光学显微镜对染色切片进行成像。根据冠状海马切片中特征性的致密锥体细胞层确定CA1区。对每只小鼠分析一张冠状切片，并从每侧海马的CA1区获取两个无重叠的视野。
    9. 使用图像分析软件中的细胞计数插件手动计数形态完整的尼氏阳性神经元及尼氏体。完整神经元的识别依据为：完整的胞体、圆形细胞核且核仁可见、胞质内富含尼氏物质；尼氏体则表现为神经元胞质内强嗜碱性的颗粒状或团块状结构。
    10. 将所有分析视野获得的数值取平均，生成每只动物的单一数值。确保执行计数的操作者对分组信息保持盲态。
  3. Iba1免疫荧光染色
    1. 染色前使脑切片恢复至室温。
    2. 将载玻片浸入柠檬酸钠抗原修复液中，在80 °C水浴中进行抗原修复25分钟。抗原修复后，让载玻片和修复液自然冷却至室温。
    3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片三次，每次3分钟。
    4. 在室温下用含0.2% Triton X-100的PBS对切片进行通透处理30分钟，随后用PBS洗涤三次，每次3分钟。
    5. 在湿盒中，用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBS于室温孵育切片1小时，以封闭非特异性结合位点。
    6. 用PBS洗涤切片三次，每次3分钟。
    7. 将针对离子化钙结合衔接蛋白分子1（Iba1；1:100）的一抗用封闭液（含3% BSA的PBS）稀释，并在湿盒中于4 °C孵育过夜。
    8. 用PBS洗涤切片三次，每次3分钟。
    9. 在避光条件下，室温孵育切片与488标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1:1000）90分钟。
    10. 在避光条件下，用PBS洗涤切片三次，每次3分钟。
    11. 在避光条件下，用DAPI（1:8000）复染细胞核5分钟。
    12. 在避光条件下，用PBS洗涤切片三次，每次3分钟。
    13. 用抗荧光淬灭封片剂封片，加盖盖玻片，并避光保存直至成像。
    14. 使用配备20×物镜的共聚焦荧光显微镜获取海马CA1区的荧光图像。所有用于定量比较的切片均使用相同的图像采集参数。对每只小鼠分析一张冠状切片，并从每侧海马的CA1区获取两个无重叠的视野。
    15. 在所有图像中使用相同的阈值设定，定量分析海马CA1区Iba1的平均荧光强度。将所有视野的数值取平均，获得每只动物的单一数值。

6. 统计学分析

  1. 使用统计分析软件进行所有统计分析。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。
  2. 使用 Shapiro–Wilk 检验评估数据的正态性。使用 F 检验评估方差齐性。
  3. 当满足方差齐性假设时，采用非配对双尾 Student t 检验比较对照组和 L5 椎板切除组；当不满足方差齐性假设时，采用 Welch t 检验。
  4. 定义 n 为每项分析中包含的动物数量。认为 P 值 < 0.05 具有统计学意义。

结果

所有小鼠均存活至预定的实验终点，无一达到预设的安乐死终点标准，全部被纳入最终分析。术后第3天通过旷场实验和步态分析评估运动功能。旷场实验中，各组间的总移动距离和平均速度均无差异，表明自发性运动活动能力相当图 2A）。步态分析同样显示，各组之间在步长、站立时长、摆动速度或足印面积方面均无显著差异（图2B这些发现共同表明，L5椎板切除术并未引起明显的运动功能障碍，足以解释后续认知行为表现的差异。

认知功能通过新物体识别（NOR）实验、新臂Y迷宫和巴恩斯迷宫进行评估。在NOR实验中，L5椎板切除组的新物体偏好指数（PI）显著低于对照组（图3A）。在新臂Y迷宫实验中，L5椎板切除组在新臂停留时间和进入新臂数量两个指标上的PI均显著降低（图3B）。在巴恩斯迷宫实验中，L5椎板切除组在第3天的逃避潜伏期更长，移动距离更大（图3C）。综上所述，这些行为学结果表明L5椎板切除术后认知功能受损。

在海马CA1区，L5椎板切除组的尼氏阳性神经元和尼氏体数量均显著少于对照组，表明存在神经元结构损伤（图 4A，B）。此外，L5椎板切除组的小胶质细胞激活标志物Iba1平均荧光强度显著升高，提示小胶质细胞活化增强（图 4C，D）。

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图1：用于小鼠术后认知功能障碍（POCD）建模的L5腰椎椎板切除术。（A）手术靶点位于L5椎板，暴露范围涵盖相邻椎体节段（L4–L6）的示意图。（B）术中图像，展示L5腰椎椎板切除术的关键步骤。（a）剃毛后的腰部区域，已确定脊柱中线；箭头指示计划皮肤切口的方向。（b）腰椎部位的正中皮肤切口。（c）切开筋膜，并逐步分离椎旁肌，以暴露棘突，进一步清除L5棘突及椎板周围的组织，充分暴露L5椎板。（d）切除L5椎板后的L5椎板切除术区域。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 2：L5 腰椎板切除术后运动活动能力与步态评估。（A）旷场实验显示总移动距离和平均速度（n = 10）。（B）步态分析显示步幅长度、站立时间、摆动速度和足印面积（n = 6）。数据以均值 ± 标准差表示。统计学显著性标注为 ns，无显著性差异。缩写：Control = 对照组；Laminectomy = L5 椎板切除组。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：L5腰椎板切除术后认知行为评估。 （A）新物体识别实验（n = 10）。 （B）新臂Y迷宫实验（n = 10）。 （C）Barnes迷宫实验（n = 10）。 数据以均值 ± 标准差表示。 统计学显著性表示为 *P < 0.05，**P < 0.01，以及 ***P < 0.001。 缩写：Control = 对照组；Laminectomy = L5椎板切除组。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：L5 腰椎板切除术后海马 CA1 区域的组织学评估。（A）海马 CA1 区域尼氏染色的代表性图像。（B）尼氏阳性神经元（左）和尼氏小体（右）的定量分析（n = 5）。（C）海马 CA1 区域 Iba1 免疫荧光的代表性图像。比例尺 = 100 µm。 （D）Iba1 平均荧光强度的定量分析（n = 6）。数据以均值 ± 标准差表示。统计学显著性表示为 **P < 0.01 和 ***P < 0.001。缩写：Control = 对照组；Laminectomy = L5 椎板切除组。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

已有报道称，接受脊柱手术的老年患者会出现术后认知功能障碍10。实验证据进一步表明，衰老会增加个体对手术相关认知损害及神经炎症反应的易感性11,12。本实验方案结合约4小时的七氟烷麻醉与老年小鼠L5椎板切除术，以模拟早期术后认知功能障碍。该方案的主要方法学价值在于提供了一种实用且易于实施的操作流程，用于研究脊柱手术后行为学及海马组织病理学的变化。

术前认知功能障碍（POCD）的临床前模型包括仅麻醉暴露、腹部手术和骨科损伤范式13。仅麻醉范式可在无手术创伤的情况下评估麻醉药物的影响14，但无法模拟麻醉与组织损伤的联合暴露。腹部手术和胫骨骨折模型包含了手术损伤，已被用于研究与手术相关的认知功能障碍15,16。然而，这些模型的手术部位和组织损伤模式与脊柱手术不同。由于手术创伤的类型和强度可能影响术后认知功能及中枢炎症反应9，因此在选择临床前模型时应考虑手术背景。本研究的L5椎板切除术方案因此提供了一种与脊柱手术相关的实验范式，用于研究老年小鼠术后早期认知功能障碍。

本方案中的关键技术难点是在避免损伤硬脊膜的前提下，充分去除L5椎板的骨质以清晰暴露硬脊膜。在直视下行椎板切除术时，必须精确控制器械的插入深度、切割力度以及眼科剪的插入角度。应沿椎板边缘采用小范围、可控的逐次切割方式逐步去除骨质。用镊子夹住L5棘突，并将手术节段腰椎抬高至相对于手术平台约30°的角度，可扩大L5–L6椎板间隙。该操作有助于剪尖以较浅角度插入骨缘下方，从而降低接触硬脊膜的风险。若去骨不充分，可能限制手术暴露；而过度切割或插入过深则可能导致硬脊膜损伤。术中失控性出血可能遮蔽手术视野，影响术后恢复，并增加行为学结果的变异性。当椎板间隙不足以安全插入剪尖时，应重新调整手术节段腰椎的位置和抬高角度，而非增加插入深度。若出血遮蔽手术视野，应暂停去骨操作，待视野恢复清晰后再逐步清除剩余骨质。

椎旁肌分离和L5椎板切除术可能导致短暂的术后疼痛，已有文献报道在小鼠实验性椎板切除术后出现机械性痛觉过敏17。美洛昔康按照预设的镇痛方案给予。据报道，小鼠术后疼痛相关的面部表情可持续约36–48小时18。为期48小时的镇痛方案旨在覆盖这一早期术后阶段，认知行为学测试则在术后第3天、即镇痛方案完成后开始，以减少急性术后疼痛对测试结果的潜在影响。旷场实验已被用于实验性术后认知功能障碍（POCD）研究中，以评估自发性运动活动，并判断运动减少是否可能干扰认知行为表现19,20。因此，旷场实验和步态分析在术后第3天、认知评估之前进行。在旷场运动活动或步态参数方面未观察到组间显著差异，提示后续的认知行为差异不太可能主要由明显的运动功能障碍所致。然而，由于未直接评估自发性术后疼痛和伤口不适，这些因素对行为表现的残余影响尚不能完全排除。未来的研究可纳入对自发性术后疼痛的直接评估。

总体而言，本方案为研究老年小鼠L5椎板切除术后早期认知功能障碍提供了一种切实可行的实验方法。该方法可用于探究脊柱手术相关认知功能障碍的行为学表现及其潜在机制，也可用于评估旨在预防或减轻术后认知功能障碍的干预措施。在更大样本队列及独立实验室中进行验证，将进一步确立该模型的稳定性和可重复性。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢浙江大学医学院公共技术平台的方三花、浙江大学动物中心的陈艳红和张绪亮提供的技术支持。本研究由以下基金资助：国家自然科学基金（编号：82575196、82074535 和 U23A20508）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6J 雄性小鼠苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司SYXK2023-0005动物模型
ANY-maze 视频追踪软件Stoelting Co., USA6000行为学视频追踪与分析
红霉素眼膏北京双鹭药业股份有限公司H11021270预防眼睛干燥
精细镊子NANA夹持皮肤
加热垫NANA温度控制
Iba1/AIF-1 (E4O4W) 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology17198Iba1 免疫荧光染色
吸入麻醉设备瑞沃德生命科学有限公司R581S麻醉
MGT-PR安徽正华生物仪器设备有限公司，中国MJY2025112704步态分析
显微眼科剪NANA骨组织去除
尼氏染色液浩克生物科技有限公司HK2033尼氏染色
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参考文献

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