S100P 作为炎症性肠病、结直肠癌和胰腺导管腺癌的共有生物标志物：一项整合性转录组学分析

摘要

本方案整合公共转录组学数据集与结肠上皮细胞验证，以确定 S100P 是与炎症性肠病、结直肠癌和胰腺腺癌相关的共有生物标志物。

摘要

炎症性肠病（IBD）与结直肠癌（CRC）及胰腺导管腺癌（PAAD）的风险增加相关，然而这些疾病之间共享的分子特征尚未完全阐明。本研究旨在通过整合转录组分析和实验验证，鉴定与IBD、CRC和PAAD相关的共有基因及生物学通路。IBD、CRC和PAAD的基因表达数据集来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）。采用加权基因共表达网络分析和差异表达分析来识别与疾病相关及共有的基因。利用基因本体（Gene Ontology）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析探索富集的生物学功能和通路。使用RNA转录本相对亚群估计法（Cell-type Identification by Estimating Relative Subsets of RNA Transcripts）评估免疫细胞浸润情况。通过受试者工作特征曲线分析评估共有基因的诊断效能。进行单细胞RNA测序分析以检测S100P的细胞分布。此外，在脂多糖（LPS）刺激的结肠上皮细胞中评估了S100P下调的影响。共鉴定出162个疾病相关基因和4个共有基因。功能富集分析显示，包括白细胞介素-17信号通路在内的免疫和炎症相关通路显著富集。免疫浸润分析揭示了IBD、CRC和PAAD中多种免疫细胞群体具有相似的变化趋势。单细胞分析显示，三种疾病来源的上皮细胞中S100P表达均升高。下调S100P可恢复LPS刺激下结肠上皮细胞的增殖能力，并降低炎症细胞因子的表达水平。整合转录组分析鉴定出S100P是与IBD、CRC和PAAD相关的生物标志物，并揭示了这些疾病之间共享的免疫相关特征。

引言

炎症性肠病（IBD）是一组影响胃肠道的免疫相关性疾病的统称，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病¹。IBD 的病因极为复杂，涉及黏膜免疫异常、菌群失调以及遗传易感性²。IBD 是一项全球性的公共卫生问题，其发病率不断上升，带来沉重的经济负担，日益增长的患病率已引起广泛关注¹。尤为重要的是，IBD 患者发生结直肠癌（CRC）³ 和胰腺导管腺癌（PAAD）⁴ 的风险显著增加。尽管这种关联已有充分记录，但 IBD、CRC 与 PAAD 之间的遗传交互作用仍尚未完全阐明。

既往研究强烈提示，炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PAAD）存在共同的致病过程；然而，目前仍缺乏特异且敏感的诊断生物标志物，且这些疾病共有的致病机制尚未被充分阐明。幸运的是，随着高通量测序技术的快速发展和广泛应用，目前已公开大量来自IBD、CRC和PAAD患者的转录组数据集，使得系统性探究这些疾病之间的分子关联成为可能^2,5,6。

本研究利用炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PAAD）患者的高通量测序数据，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和差异表达分析，鉴定与疾病相关及共有的基因。进一步分析这些基因，以确定IBD、CRC和PAAD之间潜在的共有信号通路。此外，我们评估了这些共有基因的诊断价值。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析显示，关键基因S100P主要在上皮细胞中表达。最后，我们探讨了S100P在IBD中的生物学作用。

综上所述，本研究旨在鉴定与炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PAAD）相关的常见诊断生物标志物及生物学通路，从而为这些疾病的共同预防和治疗提供有价值的临床见解。

方案

本研究使用了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）的公开、去标识化数据集，以及成熟的商业化细胞系。研究未涉及新招募的人类受试者、可识别的患者信息或患者来源样本。所有分析均遵循相关机构指南及公共数据库的使用条款。因此，本研究无需额外的机构伦理审批和知情同意。

数据来源
炎症性肠病（IBD）队列（GSE179285；平台：GPL6480 和 GSE24287；平台：GPL6480）、结直肠癌（CRC）队列（TCGA-CRC；平台：Illumina HiSeq 2000 和 GSE87211；平台：GPL13497）以及胰腺癌（PAAD）队列（GSE128735；平台：GPL20301 和 GSE62452；平台：GPL6244）的 RNA-seq 数据均从 TCGA 和 GEO 下载。所有数据集均于 2025 年 12 月 5 日访问获取。

对于每个数据集，样本被严格分为两个亚组，其中疾病病变组织/肿瘤组织作为病例组，相应的非病变正常组织作为对照组。具体而言，炎症性肠病（IBD）队列包含来自IBD患者的297份肠黏膜样本和来自健康个体的56份正常肠黏膜样本；结直肠癌（CRC）队列包括841份原发性结直肠肿瘤组织和211份匹配的相邻正常结直肠上皮组织；胰腺导管腺癌（PAAD）队列由114份PAAD肿瘤组织和106份正常胰腺实质组织组成。

同一疾病类别内的所有数据集均进行了统一整合。采用limma软件包中的normalizeBetweenArrays函数进行跨样本的分位数标准化，有效消除不同平台间的批次效应，并对不同数据集的基因表达值进行标准化，以用于后续的差异表达分析。

炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PAAD）相关基因及共有基因的筛选
首先，使用 limma 软件包从 IBD、CRC 和 PAAD 队列中筛选差异表达基因（DEGs），并采用 Benjamini-Hochberg 错误发现率（FDR）方法对原始 P 值进行校正。在 IBD、CRC 和 PAAD 队列中，筛选标准设定为 |logFC| > 0.4 且 P < 0.05。此外，对所有基因进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），模块最小基因数阈值设为 100（软阈值幂次 = 0.90；网络类型 = 有符号）。由此，识别出三个队列中的共有差异表达基因和模块基因。两种方法均一致识别出的基因被定义为共有基因，其余基因则归类为相关基因。

蛋白质-蛋白质相互作用与功能富集分析
这些分析基于与疾病相关的基因进行。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析使用 STRING 数据库完成（相互作用评分 > 0.40）。功能富集分析包括基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，采用 clusterProfiler、enrichplot 和 org.Hs.eg.db 软件包进行（P < 0.05，且经 FDR 调整的 q 值 [Benjamini–Hochberg 方法] < 0.05）。

免疫微环境分析
CIBERSORT 是一种可靠的算法，可利用默认的 LM22 特征矩阵，基于基因表达数据估算免疫细胞浸润水平⁷。在本研究中，采用 CIBERSORT 算法评估炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PAAD）队列样本中免疫细胞的浸润程度，以探索这三种疾病在免疫微环境方面的共性特征。分析过程中设置 1,000 次置换以计算每个样本的 P 值，并对混合表达文件应用了分位数标准化（QN = TRUE）。仅保留 CIBERSORT P 值 < 0.05 的样本用于后续分析，以确保去卷积结果的可靠性。

常见基因诊断价值的评估
采用 R 语言中的 pROC 软件包进行受试者工作特征（ROC）分析，评估常见基因在 IBD、CRC 和 PAAD 队列中的诊断价值。通过 ROC 曲线可视化灵敏度与特异性之间的最佳权衡。

qRT-PCR、细胞转染和克隆形成实验
qRT-PCR 和细胞转染实验参照既往研究方法进行^8,9,10。使用 jetPRIME 转染试剂（Polyplus，中国）按照生产商说明书进行瞬时转染。细胞与转染混合物共孵育 6 h 后，更换为完全 DMEM 培养基。转染后 48 h 进行后续实验。

简而言之，使用TRIzol试剂提取总细胞RNA。利用PrimeScript RT Master Mix将RNA反转录为cDNA。采用TB Green qPCR进行定量PCR检测。β-actin作为内参基因用于表达量的标准化。生物学实验均重复三次。引物序列及siS100P序列可参见先前的研究¹¹。

NCM460、FHC、HCT116、SW116、PANC1 和 BXPC2 细胞系的来源见 材料表。所有细胞系均经过细胞鉴定和支原体检测。

实验过程中，所有细胞传代3–5代。所有细胞均在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的完全DMEM培养基中培养。

集落形成实验按照先前研究中所述方法进行¹²。简言之，每孔接种1,000个细胞至6孔板中，培养10天后终止实验。细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，使用ImageJ软件计数集落。

基于单细胞RNA测序数据的常见基因分析
炎症性肠病（IBD）数据集（GSE214695）、结直肠癌（CRC）数据集（GSE166555）和胰腺癌（PAAD）数据集（GSE154778）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据均按照先前研究中所述方法进行预处理^8,13。对于存在重复基因符号的情况，使用limma::avereps函数按平均表达值合并原始计数矩阵。初步过滤保留了在至少三个细胞中被检测到的基因，以及包含至少50个独特转录本的细胞。剔除线粒体转录本比例>5%或检测到的基因数少于50个的细胞。随后以10,000为缩放因子进行对数归一化处理，并进行方差稳定化转换，以鉴定出前1,500个高变基因；这些高变基因在主成分分析（PCA）前进行了Z分数标准化。聚类特征性标记基因的筛选标准为：log₂（倍数变化）>0.5，目标聚类中的检测比例≥0.25，且校正后的P值<0.05。

简而言之，使用 Seurat 软件包进行数据预处理，并利用 SingleR 软件包（版本 2.6.0）进行细胞类型注释。在 Seurat 中，基于主成分分析（PCA）的第 1 至第 20 个维度，通过构建 k-最近邻图和 t-SNE 嵌入实现细胞聚类。随后，分析了不同细胞类型间共有基因的分布及表达水平。

炎症性肠病模型的构建
根据既往研究¹⁴，采用脂多糖（LPS）诱导正常人结肠上皮细胞（FHC 和 NCM460）发生炎症，从而建立模拟炎症性肠病（IBD）的体外模型。所有生物学实验均重复三次。细胞常规置于含5% CO₂、37°C的湿化培养箱中培养。当细胞融合度达到约50%–70%时，更换为新鲜完全培养基，并加入10 ng/mL LPS处理12小时。以等体积无菌磷酸盐缓冲液（PBS）作为溶剂对照。实验使用6孔板，每孔培养体积为2 mL。处理结束后，吸除培养基，用预冷的无菌PBS洗涤细胞两次，随后收集细胞用于后续分析。

统计分析
所有生物信息学分析均使用 R 软件（版本 4.1.2）进行。两组之间的比较采用 Student's t-检验，多组之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA）。相关性分析采用 Spearman 方法。所有细胞实验至少重复三次，数据以均值 ± 标准差（SD）表示。当 P 值或 FDR < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。NS，无显著性；P < 0.05 (*)，P < 0.01 (**)，以及 P < 0.001 (***)。

结果

IBD、CRC 和 PAAD 中的差异表达基因（DEGs）
首先，整合了 IBD 队列（GSE179285 和 GSE24287）、CRC 队列（TCGA-CRC 和 GSE87211）以及 PAAD 队列（GSE128735 和 GSE62452），并使用 PCA 和基因表达密度图对整合效果进行评估。结果表明，整合后不同数据集之间的批次效应被有效消除（图 1A–F）。

图1．炎症性肠病（IBD）、...

讨论

既往研究已强调炎症性肠病（IBD，一种免疫相关性胃肠道疾病）与多种疾病之间的关联，包括神经退行性疾病¹⁷、多发性硬化¹⁸、肌萎缩侧索硬化¹⁹、子宫内膜异位症²⁰、类风湿性关节炎²、霍奇金淋巴瘤²¹、结直肠癌（CRC）²²和胰腺腺癌（PAAD）²³。通常认为IBD会增加患CRC²⁴和PAAD²³的风险。尽管已有流行病学研究报道了这些疾病之间的关联，但它们共有的分子特征仍尚未完全阐明。在本研究中，我们整合了批量转录组数据集、单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据以及细胞功能实验，以探究IBD、CRC和PAAD之间共有的分子特征。我们的研究结果为进一步理解这些疾病状态...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BXPC2 细胞系	中国科学院细胞库	N/A	人胰腺腺癌细胞系
CIBERSORT	N/A	N/A	免疫细胞浸润分析
clusterProfiler 软件包	Bioconductor	v4.8.0	基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	赛默飞世尔科技	11965092	细胞培养基
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	A5256701	细胞培养添加剂
FHC 细胞系	中国科学院细胞库	N/A	人正常结肠上皮细胞系
GEO 数据集（GSE128735）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	胰腺腺癌公共基因表达数据集
GEO 数据集（GSE154778）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	胰腺腺癌公共单细胞 RNA 测序数据集
GEO 数据集（GSE166555）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	结直肠癌公共单细胞 RNA 测序数据集
GEO 数据集（GSE179285）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	炎症性肠病公共基因表达数据集
GEO 数据集（GSE214695）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	炎症性肠病公共单细胞 RNA 测序数据集
GEO 数据集（GSE24287）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	炎症性肠病公共基因表达数据集
GEO 数据集（GSE62452）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	胰腺腺癌公共基因表达数据集
GEO 数据集（GSE87211）	基因表达综合数据库（GEO）	N/A	结直肠癌公共基因表达数据集
ggplot2 软件包	CRAN	v3.4.2	数据可视化
HCT116 细胞系	中国科学院细胞库	N/A	人结直肠癌细胞系
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	v1.8.0	克隆计数
jetPRIME 转染试剂	Polyplus	101000046	细胞转染
脂多糖（LPS）	碧云天生物技术有限公司	S1735	诱导模拟炎症性肠病的细胞模型
limma 软件包	Bioconductor	v3.54.0	差异表达分析
NCM460 细胞系	中国科学院细胞库	N/A	人正常结肠上皮细胞系
org.Hs.eg.db 软件包	Bioconductor	v3.23.1	富集分析的基因注释
PANC1 细胞系	中国科学院细胞库	N/A	人胰腺腺癌细胞系
青霉素–链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122	细胞培养用抗生素添加剂
pheatmap 软件包	CRAN	v1.0.12	热图可视化
pROC 软件包	CRAN	v1.19.0.1	受试者工作特征（ROC）分析
PrimeScript RT Master Mix	宝生物工程（Takara Bio）	RR036A	RNA 逆转录为 cDNA
qRT-PCR 引物组	青克生物技术有限公司	N/A	引物序列见参考文献 11
R 软件	统计计算 R 基金会	v4.1.2	统计学与生物信息学分析
Seurat 软件包	CRAN	v4.0	单细胞 RNA 测序数据预处理与分析
siS100P	青克生物技术有限公司	N/A	靶向 S100P 的小干扰 RNA
SingleR 软件包	Bioconductor	v2.6.0	单细胞 RNA 测序的细胞类型注释
STRING 数据库	STRING 联盟	N/A	蛋白质-蛋白质相互作用分析
SW1116 细胞系	中国科学院细胞库	N/A	人结直肠癌细胞系
TB Green qPCR Mix	宝生物工程（Takara Bio）	RR430B	实时定量 PCR
TCGA-CRC 数据集	癌症基因组图谱（TCGA）	N/A	结直肠癌公共转录组数据集
TRIzol 试剂	英骏（Invitrogen）	15596-026	总 RNA 提取
WGCNA 软件包	CRAN	v1.73	加权基因共表达网络分析