本方案描述了建立卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘（AA）小鼠模型，用于通过降钙素基因相关肽（CGRP）/受体活性修饰蛋白1（RAMP1）通路调控肺部2型固有淋巴细胞（ILC2s），评估克喘定穴位贴敷疗法（KAST）对2型气道炎症的治疗机制。
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研究文章
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本方案描述了建立卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘（AA）小鼠模型，用于通过降钙素基因相关肽（CGRP）/受体活性修饰蛋白1（RAMP1）通路调控肺部2型固有淋巴细胞（ILC2s），评估克喘定穴位贴敷疗法（KAST）对2型气道炎症的治疗机制。
穴位贴敷疗法（KAST）已被证明能有效改善过敏性哮喘（AA）患者的气道炎症；然而，其潜在的作用机制尚不明确。本研究旨在从神经-免疫角度探讨KAST在过敏性哮喘小鼠模型中的治疗机制。建立卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠模型，并对小鼠实施KAST治疗。通过流式细胞术、苏木精-伊红（HE）染色和免疫组化方法评估KAST对肺组织2型固有淋巴细胞（ILC2s）及2型气道炎症的影响。采用蛋白印迹法（WB）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测肺组织中降钙素基因相关肽（CGRP）蛋白水平。在过敏性哮喘小鼠中经鼻给予CGRP或CGRP受体抑制剂BIBN-4096，以探究CGRP/受体活性修饰蛋白1（RAMP1）通路对ILC2s及2型气道炎症的调控作用。结果显示，KAST减少了ILC2s数量并缓解了2型气道炎症，同时伴随肺组织中CGRP表达降低。经鼻给予CGRP可增加肺内RAMP1+ILC2s和总ILC2s数量，并加重2型气道炎症；相反，经鼻给予BIBN-4096则减少肺ILC2s并减轻2型气道炎症。KAST通过下调CGRP/RAMP1通路进而抑制肺ILC2s，从而减轻过敏性哮喘的气道炎症，药理学抑制实验进一步支持了这一机制。
变应性哮喘（AA）是哮喘最常见的表型，在中国占所有哮喘病例的60%–80%1。其特点是患病率高且疾病控制不理想，严重影响患者的生活质量，并带来显著的经济负担2,3,4,5。尽管吸入性糖皮质激素（ICS）仍是临床治疗的主要手段6，但部分患者对其反应有限，且长期使用常伴随不良反应，并无法阻止疾病进展7。因此，开发安全有效的新型治疗策略仍是临床和科研领域的重点方向。克喘汀穴位贴敷疗法（KAST）是一种中医外治法，可通过透皮递送活性成分，潜在避免肝脏首过效应，并减少全身性不良反应8,9。临床研究表明，KAST可缓解哮喘症状，部分恢复肺功能，并提高患者的生活质量10,11,12。同时，血清代谢组学、网络药理学以及采用哮喘动物模型的研究提示，KAS....
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所有动物实验均按照美国国家科学院出版的《实验动物护理和使用指南》进行。本方案已获得南京中医药大学附属医院动物伦理委员会批准（批准号：2023DW-059-01）。本研究中使用的所有材料、试剂、工具和软件的完整清单详见材料表。
实验动物与分组
从南京中医药大学实验动物中心（许可证号：SYXK (苏) 2018-0049）获取健康的雌性BALB/c小鼠（SPF级，8–10周龄）。动物在标准条件下饲养，光照/黑暗周期为12小时，温度保持在24–26 °C。提供无菌食物和水，自由摄取，定期更换垫料，并常规清洁笼具。经过7天适应期后，将小鼠随机分为六组（每组n = 7）：正常组、模型组、CGRP组、BIBN-4096组、KAST组和KAST + CGRP组。采用计算机生成的随机数字表对动物进行随机分组，分组信息在干预措施分配前对研究人员设盲。为优化组织利用，将随机分组后的肺组织样本（每组n = 7）系统分配至不同的处理流程中，各特定组织学和分子检测所分析的实际样本量（n = 5、4或3）在相应图注中明确标示。所有数据均纳入分析，无剔除数据。
KAST 制剂的制备
该制剂由南京中医药大学附属医院药学部制备
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KAST 减少肺部 ILC2 细胞并缓解 2 型气道炎症
为研究KAST的治疗效果，建立了OVA诱导的AA小鼠模型，并在肺俞（BL13）、膈俞（BL17）、脾俞（BL20）和肾俞（BL23）穴位贴敷药 patch 进行治疗（图1A建模后，AA小鼠体重下降，而与模型组相比，KAST小鼠体重显著增加（图1B）。肺系数作为肺部炎症的指标，在AA小鼠中升高，但在给予KAST后显著降低（图1C）。行为学评估显示，AA小鼠鼻部抓挠和打喷嚏行为增加，KAST可显著缓解这些症状图1D–E）。全身体积描记法显示，AA小鼠的Penh值（提示气道高反应性）升高，但在治疗后降低，表明肺功能改善（图1F）。苏木精-伊红染色的组织病理学分析显示，与.......
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AA 的治疗面临多种局限性，包括长期用药相关的副作用、症状控制不完全以及频繁复发。尽管传统药物治疗有效，但常伴随不良后果，例如对糖皮质激素的依赖26,27。相比之下，KAST 为 AA 的管理提供了一种安全、经济且便捷的替代方案。临床证据表明，KAST 可通过调节肺部免疫功能有效缓解哮喘症状28。在本研究中，我们进一步证实，KAST 通过抑制 CGRP/RAMP1 通路并减少 ILC2s 数量，从而减轻 AA 小鼠的 2 型气道炎症。
固有免疫，特别是2型固有淋巴细胞（ILC2s），在过敏性哮喘（AA）中2型气道炎症的启动、放大和维持过程中发挥着不可或缺的作用29。在过敏原暴露后，ILC2s迅速响应上皮细胞来源的警报素，数小时内即大量分泌IL-5和IL-13，从而触发2型炎症反应30,
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作者声明无利益冲突。
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82274632）、江苏省中医药领军人才培育项目（编号：SLJ0309）、江苏省自然科学基金（编号：BK20231381）、江苏省中医药科技发展计划项目（编号：ZT202205）以及南京中医药大学教育部针灸与医学研究重点实验室（编号：AML202304）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3M 医用透气胶带 | 3M, USA | 1530C | 贴片固定 |
| 乙酰胆碱氯化物 | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | 支气管激发 |
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies, USA | G2939BA | RNA 质量与完整性评估 |
| Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific, USA | (custom order) | 免疫荧光（二抗） |
| 氢氧化铝 | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | 佐剂 |
| 抗 CGRP 抗体（兔） | Abcam, UK | ab81887 | Western blot / IF |
| BALB/c 小鼠（雌性，SPF 级，8–10 周龄，18–22 g） | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | 动物模型 |
| BB700 大鼠抗小鼠 CD90.2（克隆 53-2.1） | BD Biosciences, USA | 566465 | 流式细胞术 |
| BD FACSCanto II 流式细胞仪 | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | 流式细胞术 |
| BIBN-4096（Olcegepant 盐酸盐） | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | CGRP 受体拮抗剂 |
| 生物素-谱系抗体混合物 | BD Biosciences, USA | (Customized, clones as described) | 流式细胞术 |
| Brilliant Violet 605 链霉亲和素 | BD Biosciences, USA | 563260 | 流式细胞术 |
| BSA 白蛋白 V 型 | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Germany | 4240GR100 | 封闭 |
| 降钙素/CALCA 蛋白 | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | CGRP 干预 |
| CD11c/ITGAX 抗体（兔） | Abmart, Shanghai, China | MU115408S | 免疫荧光 |
| 柠檬酸抗原修复缓冲液 | Boster, China | AR0024 | 免疫组织化学 |
| DAPI 染色液 | Beyotime, Shanghai, China | C1006 | 细胞核染色 |
| ddH2O（双蒸水） | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | 蛋白复性与粉末溶解 |
| DESeq2 | Bioconductor (R package) | Version 1.42.0 | 差异表达分析软件 |
| DNase I | Roche Diagnostics, Germany | 10104159001 | 肺组织消化 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 555） | Abcam, UK | ab150106 | 免疫荧光（二抗） |
| ECL 底物（超灵敏） | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Western blot 化学发光 |
| 增强型 BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime, Shanghai, China | P0010 | 蛋白定量 |
| 伊红 Y 染色液 | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | 组织学（HE 染色） |
| 乙醇（无水，分析纯） | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | 组织脱水与组织学 |
| F4/80 抗体（小鼠，克隆 C-7） | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | 免疫荧光 |
| fastp | 开源（GitHub） | Version 0.23.4 | RNA-seq 原始数据质控软件 |
| FITC 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11） | BD Biosciences, USA | 553080 | 流式细胞术 |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | 流式细胞术分析 |
| GAPDH 单克隆抗体（小鼠） | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Western blot |
| GATA3 抗体（小鼠，克隆 L50-823） | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | 免疫荧光 |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | 死细胞排除 |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗 | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | 免疫荧光（二抗） |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | 统计分析 |
| 苏木精溶液（Harris） | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | 组织学（HE 染色） |
| HISAT2 | 约翰霍普金斯大学（开源） | Version 2.2.1 | RNA-seq 参考基因组比对软件 |
| HRP 标记山羊抗小鼠 IgG（H+L） | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | Western blot（二抗） |
| HRP 标记山羊抗兔 IgG（H+L） | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Western blot（二抗） |
| HTSeq-count | EMBL（Python 工具） | Version 2.0.3 | RNA-seq 基因组特征读数计数工具 |
| 过氧化氢（H2O2，3% 溶液） | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | 内源性过氧化物酶封闭 |
| iFluor™ 488 标记山羊抗兔 IgG 抗体 | Huabio, China | HA1121 | 免疫荧光（二抗） |
| IL-4 单克隆抗体 | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Western blot |
| IL13 抗体 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Western blot |
| IL5 抗体 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | – | RNA 测序 |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Western blot 定量 |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Version 6.0 | 图像光密度定量 |
| KAST 中药复方制剂 | 南京中医药大学附属医院药剂科 | – | 干预 |
| KLRG1 单克隆抗体（2F1） | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | 免疫荧光 |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Germany | 4.5 | 免疫荧光定量 |
| Leica STELLARIS 8 DIVE 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems, Germany | STELLARIS 8 | 免疫荧光成像 |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Germany | 5401119001 | 肺组织消化 |
| 蛋白 Marker（预染蛋白 Ladder） | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Western blot |
| 小鼠 CGRP ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ELISA |
| 小鼠 IL-13 ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ELISA |
| 小鼠 IL-4 ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ELISA |
| 小鼠 IL-5 ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ELISA |
| 中性树胶封片剂 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | 组织切片封片 |
| 正常山羊血清（用于封闭） | Abcam, UK | ab7481 | 免疫组织化学/IF 封闭 |
| OCT 包埋剂 | Sakura, USA | 4583 | 冷冻切片包埋 |
| 一步法 PAGE 凝胶快速制备试剂盒 | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | SDS-PAGE 凝胶制备 |
| 卵清蛋白（OVA） | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | 致敏/激发 |
| 多聚甲醛（4% PBS 溶液） | Biosharp, China | BL539A | 组织固定 |
| PE 抗小鼠/人 KLRG1（克隆 2F1） | BD Biosciences, USA | 564022 | 流式细胞术 |
| 磷酸酶抑制剂混合物（50×） | Beyotime, Shanghai, China | P1092 | 蛋白提取 |
| 多聚赖氨酸溶液 | Boster, China | AR0003 | 组织切片涂层 |
| 蛋白酶与磷酸酶抑制剂 | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | 蛋白提取 |
| PVDF 膜（0.22 μm） | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Western blot |
| RAMP1 多克隆抗体（兔） | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | 免疫荧光 |
| 红细胞（RBC）裂解缓冲液 | Beyotime, Shanghai, China | C3702 | 流式细胞术样本制备 |
| RIPA 裂解缓冲液（强） | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | 蛋白提取 |
| RPMI-1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | 组织细胞消化基础培养基 |
| SuperKine™ 增强型抗荧光淬灭封片液 | 武汉雅科因生物科技有限公司 | BMU104 | 免疫荧光封片 |
| 曲拉通 X-100（去垢剂） | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | 免疫荧光通透 |
| TRIzol 试剂 | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | RNA 提取 |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq 文库构建试剂盒 | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | RNA-seq 文库构建 |
| 全身体积描记系统 | 广元达，北京，中国 | WBP-4 | 肺功能（Penh） |
| 二甲苯（分析纯） | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | 脱蜡与透明 |
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