本方案描述了建立卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘（AA）小鼠模型，用于通过降钙素基因相关肽（CGRP）/受体活性修饰蛋白1（RAMP1）通路调控肺部2型固有淋巴细胞（ILC2s），评估克喘定穴位贴敷疗法（KAST）对2型气道炎症的治疗机制。
研究文章
穴位贴敷疗法通过调节ILC2细胞数量缓解过敏性哮喘小鼠的2型气道炎症
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
穴位贴敷疗法（KAST）已被证明能有效改善过敏性哮喘（AA）患者的气道炎症；然而，其潜在的作用机制尚不明确。本研究旨在从神经-免疫角度探讨KAST在过敏性哮喘小鼠模型中的治疗机制。建立卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠模型，并对小鼠实施KAST治疗。通过流式细胞术、苏木精-伊红（HE）染色和免疫组化方法评估KAST对肺组织2型固有淋巴细胞（ILC2s）及2型气道炎症的影响。采用蛋白印迹法（WB）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测肺组织中降钙素基因相关肽（CGRP）蛋白水平。在过敏性哮喘小鼠中经鼻给予CGRP或CGRP受体抑制剂BIBN-4096，以探究CGRP/受体活性修饰蛋白1（RAMP1）通路对ILC2s及2型气道炎症的调控作用。结果显示，KAST减少了ILC2s数量并缓解了2型气道炎症，同时伴随肺组织中CGRP表达降低。经鼻给予CGRP可增加肺内RAMP1+ILC2s和总ILC2s数量，并加重2型气道炎症；相反，经鼻给予BIBN-4096则减少肺ILC2s并减轻2型气道炎症。KAST通过下调CGRP/RAMP1通路进而抑制肺ILC2s，从而减轻过敏性哮喘的气道炎症，药理学抑制实验进一步支持了这一机制。
引言
变应性哮喘（AA）是哮喘最常见的表型，在中国占所有哮喘病例的60%–80%1。其特点是患病率高且疾病控制不理想，严重影响患者的生活质量，并带来显著的经济负担2,3,4,5。尽管吸入性糖皮质激素（ICS）仍是临床治疗的主要手段6，但部分患者对其反应有限，且长期使用常伴随不良反应，并无法阻止疾病进展7。因此，开发安全有效的新型治疗策略仍是临床和科研领域的重点方向。克喘汀穴位贴敷疗法（KAST）是一种中医外治法，可通过透皮递送活性成分，潜在避免肝脏首过效应，并减少全身性不良反应8,9。临床研究表明，KAST可缓解哮喘症状，部分恢复肺功能，并提高患者的生活质量10,11,12。同时，血清代谢组学、网络药理学以及采用哮喘动物模型的研究提示，KAST可通过降低血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症介质水平来减轻气道炎症，包括下调IgE、IL-4和IL-13的表达9,13,14。综上，这些发现为KAST在哮喘治疗中的疗效提供了支持性证据。然而，其确切的作用机制仍不明确。
驱动变应性哮喘（AA）复发的一个核心病理机制是2型气道炎症，其中2型固有淋巴细胞（ILC2s）发挥关键作用15。在过敏原刺激下，ILC2s分泌IL-5和IL-13等细胞因子，从而促进气道炎症16,17。研究表明，在哮喘小鼠模型中耗竭ILC2s可显著减轻气道炎症，凸显其在疾病进展中的核心地位18。值得注意的是，ILC2s的活化与功能受到多种机制的严密调控，近年来神经-免疫相互作用受到越来越多的关注。新兴证据表明，降钙素基因相关肽（CGRP）可结合于ILC2s表面的受体活性修饰蛋白1（RAMP1），诱导其活化并继而释放2型细胞因子，从而加重AA中的气道炎症19,20,21。在本研究中，我们通过高通量RNA测序（RNA-seq）筛选发现，CGRP是一种对KAST干预高度响应的关键神经肽。因此，本研究聚焦于CGRP/RAMP1信号通路，采用KAST对AA小鼠进行干预，以探究其在调控ILC2活性及缓解2型气道炎症中的潜在机制。
方案
所有动物实验均按照美国国家科学院出版的《实验动物护理和使用指南》进行。本方案已获得南京中医药大学附属医院动物伦理委员会批准（批准号：2023DW-059-01）。本研究中使用的所有材料、试剂、工具和软件的完整清单详见材料表。
实验动物与分组
从南京中医药大学实验动物中心（许可证号：SYXK (苏) 2018-0049）获取健康的雌性BALB/c小鼠（SPF级，8–10周龄）。动物在标准条件下饲养，光照/黑暗周期为12小时，温度保持在24–26 °C。提供无菌食物和水，自由摄取，定期更换垫料，并常规清洁笼具。经过7天适应期后，将小鼠随机分为六组（每组n = 7）：正常组、模型组、CGRP组、BIBN-4096组、KAST组和KAST + CGRP组。采用计算机生成的随机数字表对动物进行随机分组，分组信息在干预措施分配前对研究人员设盲。为优化组织利用，将随机分组后的肺组织样本（每组n = 7）系统分配至不同的处理流程中，各特定组织学和分子检测所分析的实际样本量（n = 5、4或3）在相应图注中明确标示。所有数据均纳入分析，无剔除数据。
KAST 制剂的制备
该制剂由南京中医药大学附属医院药学部制备22。共使用九味中药：炒芥子（2份）、延胡索（2份）、醋制甘遂（1份）、细辛（1份）、麻黄（1份）、葶苈子（1份）、丁香（1份）、肉桂（1份）和皂荚（1份）。各药材粉碎成细粉，过80目筛。每100 g混合药粉加入70 mL新鲜姜汁和30 mL液体石蜡，充分混匀后制备成每片重0.3 g ± 5%、直径为0.5 cm的药贴。所有中药材及新鲜生姜均由主任药师Zhao Lin-gang鉴定，并在使用前于4 °C避光干燥环境中保存9。为确保干预措施的可重复性及批间稳定性，采用本团队建立的UPLC-Q-TOF-MS和HPLC方法实施严格的质量控制标准，确认主要活性标志物如硫氰酸芥子碱的含量一致23。实际操作中，采用2.5 cm × 5.5 cm医用透气低敏胶带固定0.5 cm药贴，以确保最佳透皮给药效果。
建立AA小鼠模型
采用文献中已建立的OVA致敏和鼻内激发方案诱导AA模型24。除正常组外，所有小鼠于第0天和第12天通过腹腔注射200 µL含100 µg OVA和2 mg氢氧化铝的生理盐水进行致敏。从第18天到第23天，小鼠每日一次经鼻内激发50 µL生理盐水中含50 µg OVA。从第24天到第53天，每隔一天经鼻内给予OVA。第54天，在称量小鼠体重后，通过颈椎脱位法实施安乐死并采集组织。随后，通过将肺脏总重量除以体重计算肺系数。
干预措施
从第40天到第53天，KAST组和KAST + CGRP组小鼠在背部3 cm × 6 cm区域进行剃毛处理。将药贴分别贴敷于双侧肺俞（BL13）、膈俞（BL17）、脾俞（BL20）和肾俞（BL23）穴位，每日一次，每次用胶带固定1.5小时，连续14天。CGRP组和KAST + CGRP组小鼠从第40天至第53天每隔一天接受一次10 µL降钙素/CALCA溶液（1 pg/µL）的鼻内给药。BIBN-4096组小鼠每隔一天接受一次10 µL BIBN-4096溶液（0.3 mg/mL，CGRP受体拮抗剂）的鼻内给药。正常组和模型组小鼠正常饲养，不进行任何干预。KAST干预从第40天开始，持续至第53天，此时过敏性气道炎症模型已经建立（模型从第40天开始，即在第18天首次OVA激发后22天）。因此，本研究中的KAST干预属于治疗性干预，而非预防性干预。
皮肤准备时，使用电动剪刀去除指定背部区域的毛发。穴位定位严格遵循中国针灸学会发布的《实验动物穴位名称与定位 第3部分：小鼠》（T/CAAM 0002-2020）标准。双侧背部四对穴位位置被精确定位并定义如下：肺俞（BL13：第3胸椎棘突下缘肋间隙处，距后正中线3 mm）、膈俞（BL17：第7胸椎棘突下缘，距正中线3 mm）、脾俞（BL20：第12胸椎棘突下缘，距正中线3 mm）和肾俞（BL23：第2腰椎棘突下缘，距正中线3 mm）。使用3M胶带紧密缠绕以实现牢固粘附，确保在1.5 h留置期间无贴片移位或继发性皮肤糜烂。
CGRP/CALCA（1 pg/µL，每只小鼠10 µL）和 BIBN-4096（0.3 mg/mL，每只小鼠10 µL）的给药剂量是基于已发表的研究25确定的。具体而言，在进行CGRP干预时，通过将1 mg BSA溶解于1 mL ddH2O中制备0.1% BSA溶液，并涡旋混匀以获得终浓度为1 mg/mL的溶液。在重组冻干的降钙素/CALCA蛋白粉末前，先在4 °C下以12,000 × g离心30秒。随后加入20 µL上述制备的0.1% BSA溶液，得到1 µg/µL的储存液。将瓶体轻轻翻转数次（不进行涡旋），短暂离心数秒，并在室温下静置数分钟，以确保蛋白完全溶解。为了在不产生难以操作的单步稀释体积的情况下制备1 pg/µL的工作液，采用标准的两步连续稀释法：首先将1 µL的1 µg/µL储存液加入999 µL无菌生理盐水中，配制成1 ng/µL的中间溶液；然后取1 µL该中间溶液再与另外999 µL无菌生理盐水混合，最终获得1 pg/µL的工作液。工作液保存于4 °C，其余分装样品则储存于-20 °C，可保存2–3个月。对于BIBN-4096组，将1 mg BIBN-4096粉末溶解于333 µL ddH2O中，配制成3 mg/mL的储存液，分装为每管50 µL，并储存在-80 °C。为制备0.3 mg/mL的工作液，将每份50 µL储存液与450 µL无菌生理盐水充分混合。从第40天至第53天，每隔一天在不使用麻醉且轻柔固定的情况下，对每只小鼠进行10 µL的1 pg/µL CGRP溶液或0.3 mg/mL BIBN-4096溶液鼻内给药。
结局指标与检测方法
行为学测试
在第53天，最后一次鼻内攻击后，使用数字视频系统监测并记录持续10分钟的鼻部搔抓和打喷嚏发作频率。视频中的行为频率由两名研究人员以双盲方式独立计数。当两者计数存在显著差异时，由第三名研究人员重新评估视频，并最终选择一致性最高的数据用于统计分析。
支气管激发试验
末次激发后24小时内，使用雾化乙酰胆碱（ACh）在0、5、10、20和40 mg/mL浓度下（每个浓度300 µL，雾化1分钟）评估气道反应性。每次雾化后，采用无创性全身体积描记法记录5分钟增强呼气暂停（Penh）值；Penh为无量纲指数，用于经验性指示气道收缩并评估气道高反应性（AHR）。小鼠在记录前于检测舱内适应10分钟。根据平衡呼气/吸气时间与峰流速的经验公式，由集成的手动存储/流式系统软件自动计算Penh值。
组织病理学（HE染色）
用4%多聚甲醛固定的肺组织通过梯度酒精系列脱水，二甲苯透明，然后使用自动组织处理机包埋于石蜡块中。将组织块切成4 µm厚度的切片，在42 °C水浴中展片后贴附于载玻片上。切片在80 °C烘烤2小时，随后室温下过夜干燥。染色时，切片经二甲苯I和II（各20分钟）脱蜡，再通过梯度乙醇系列（100% I/II和75%，各5分钟）复水，并用自来水冲洗。切片用苏木精染色3–5分钟，1%酸性乙醇分化，蓝化液返蓝。洗涤后，切片经85%和95%乙醇（各5分钟）脱水，伊红复染5分钟。最后，切片在无水乙醇I、II和III（各5分钟）中进一步脱水，二甲苯I和II（各5分钟）透明，中性树胶封片，空气干燥。使用光学显微镜结合CaseViewer系统，在200×放大倍数下随机选取视野拍摄图像。肺部炎症和上皮增厚程度采用0–4分制进行盲法评分：0分，无炎症；1分，偶见炎性细胞；2分，少量（<3个）炎性病灶；3分，多个（≥3个）炎性病灶；4分，全肺弥漫性浸润。上皮增厚评分标准为：0分，正常；1分，可见增厚；2分，部分气道壁增厚；3分，接近完全阻塞；4分，正常结构消失。每个实验组共采集并评估20个随机显微视野，获得原始组织病理学评分。每四个视野的数据取平均值作为一个独立数据点，最终每组得到n = 5个生物学重复用于统计分析。所有评分均以盲法方式进行。
RNA测序
从小鼠肺组织中提取总RNA，使用TRIzol试剂并按照制造商的说明书进行操作。采用分光光度计和基于微流控技术的平台评估RNA的纯度、浓度和完整性。使用商用文库构建试剂盒构建转录组文库，并在高通量测序平台上进行测序，以生成150 bp的双端测序读段。使用适当的过滤软件对原始数据进行质量控制，以获得干净读段，随后利用可识别剪接的比对工具将这些读段比对至参考基因组。基因表达水平以FPKM表示，并通过读段计数工具汇总读段数量。使用专业的统计分析软件包进行差异表达分析，设定筛选阈值为|log2 Fold Change| > 1且调整后P值 < 0.05。差异表达基因的功能富集分析采用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析工具进行。, 总RNA提取, TRIzol试剂, 转录组测序, 差异表达分析, FPKM, 高通量测序, 基因本体论分析, KEGG通路分析, 小鼠肺组织 ≥ 1 且经调整 p < 0.05.
酶联免疫吸附测定
将新鲜的小鼠肺组织精确称重后，按每20 mg组织加入200 µL PBS缓冲液的严格比例进行匀浆。匀浆液在4 °C条件下以约13,400 × g 离心10分钟，收集蛋白上清。为实现标准化，采用BCA法测定上清液中的原始蛋白含量并进行校准。ELISA实验按照试剂盒生产商提供的操作说明，每样本设三个技术重复。简言之，将50 µL标准品稀释液或50 µL预稀释样本（10 µL蛋白样本与40 µL样本稀释液混合，最终稀释倍数为5倍）加入抗体包被的96孔板中。密封后于37 °C孵育30分钟。用1:30稀释的洗涤缓冲液洗涤5次后，除空白孔外，每孔加入50 µL酶标结合物试剂，于37 °C孵育30分钟。再次洗涤5次后，每孔加入显色液A 50 µL和显色液B 50 µL，避光于37 °C孵育10分钟。加入50 µL终止液终止反应，溶液颜色由蓝色变为黄色。在15分钟内使用酶标仪于450 nm波长测定各孔的吸光度（OD值）。采用四参数逻辑函数或线性回归模型绘制标准曲线（确保R2 > 0.99），并据此计算肺组织匀浆中目标蛋白的浓度。
流式细胞术
取出肺组织，剪碎后加入含有10%胎牛血清（FBS）、50 µL Liberase TM 和 5 µL DNase I 的 5 mL RPMI-1640 培养基中，在 37 °C、80 rpm 振荡条件下消化 45 分钟。消化后的悬液经 400 目细胞筛过滤，随后在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。沉淀物用 2 mL 红细胞裂解缓冲液在室温避光条件下重悬并孵育 10 分钟。洗涤后，细胞在 4 °C 避光条件下用 Ghost Dye Red 780（每样本 1.25 µL）染色 20 分钟，以排除死细胞。再次洗涤后，细胞在 4 °C 条件下用 10 µL FcR 封闭试剂封闭 10 分钟。随后，细胞在 4 °C 条件下用以下荧光素偶联抗体进行表面染色 30 分钟：FITC 标记的抗小鼠 CD45 抗体（0.5 µL）、PE 标记的抗小鼠/人 KLRG1 抗体（1.25 µL）、BB700 标记的抗大鼠小鼠 CD90.2 抗体（0.5 µL），以及包含以下生物素标记谱系抗体的混合液（各 0.5 µL）：抗小鼠 CD3ε、CD4、CD8a、CD11b、CD11c、CD49b、TER-119、Ly-6G/Ly-6C（Gr-1），以及抗小鼠 CD19 抗体（2 µL）。洗涤后，细胞在 4 °C 条件下与 Brilliant Violet 605 标记的链霉亲和素（2 µL）孵育 30 分钟。数据在 BD 流式细胞仪平台上采集，并使用 FlowJo 软件进行分析。荧光溢出补偿矩阵由仪器校准后的采集软件自动监测并调整。肺内固有淋巴细胞 2 型（ILC2s）的分层设门策略依次如下：首先根据前向散射/侧向散射（FSC-A/SSC-A）形态特征圈出全部淋巴细胞，再通过单细胞设门（FSC-H/FSC-A）排除双联体。随后通过死细胞排除（Ghost Dye-）确定活细胞，然后逐步应用标准设门策略筛选 CD45+ 和 Lineage- 细胞群。在活细胞中 CD45+ Lineage- 的设门范围内，肺 ILC2s 根据后续连续阳性的 CD90.2+ 和 KLRG1+ 簇群进行明确定义与定量分析。
免疫荧光（IF）
冷冻肺组织切片在室温下解冻15–30分钟，随后用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）洗涤3次，每次6分钟，以去除OCT包埋剂。吸去多余液体后，使用免疫组化笔在组织周围绘制疏水屏障。切片在含0.3% Triton X-100和5% goat serum的封闭与通透缓冲液中孵育 37 °C 100 分钟，随后在 4 °C 与一抗孵育。次日，切片于室温平衡30分钟，用PBST洗涤三次，随后与相应种属匹配的荧光标记二抗孵育 37 °C 在黑暗条件下孵育60–90分钟。再经三次PBST洗涤后，用DAPI（以PBS稀释1:1或2:1）在室温避光条件下对细胞核进行复染，染色时间为8分钟。完成最后一轮PBST洗涤（3次） × 6 分钟），切片用抗荧光淬灭封片剂封固，密封以防止气泡产生，并置于避光处保存。使用共聚焦显微镜在 400 倍下采集图像× 放大倍数。使用 Leica LAS X 软件手动计数每个视野中的阳性细胞数量。每个实验组共采集15个随机显微视野以获得原始细胞计数数据。每三个视野的数据取平均值，得到一个独立的数据点，最终每组获得 n = 5 个生物学重复用于统计分析。细胞计数过程采用盲法进行。
免疫组织化学（IHC）
石蜡切片依次在三次二甲苯中脱蜡（每次15分钟），经梯度乙醇溶液复水（100% 两次、85%、75%；每次5分钟），并用蒸馏水冲洗。抗原修复在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行，使用压力锅加热（煮沸后高压3分钟），随后冷却，并用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤三次，每次5分钟。内源性过氧化物酶用3% H₂O₂2O2 在室温避光条件下孵育15分钟。洗涤后，用疏水性笔围绕组织切片划圈，并加入3%的羊血清封闭30分钟。随后，切片在4℃过夜孵育 4 °C 用 PBS 稀释的一抗孵育：抗 IL-4（1:400）、抗 IL-5（1:300）或抗 IL-13（1:150）。次日，切片经洗涤后，室温下与 HRP 标记的二抗（IL-4 使用抗小鼠抗体；IL-5 和 IL-13 使用抗兔抗体）孵育 50 分钟。在显微镜下控制下使用新鲜配制的 DAB 溶液显色，并用自来水终止反应。最后，切片经苏木精复染、分化、蓝化，梯度乙醇和二甲苯脱水，中性树胶封片，用于显微镜观察。采用图像分析软件平台在 200 倍镜下定量平均光密度（IOD/Area）× 放大倍数。每个实验组共采集15个随机显微视野的图像以获得原始数据。每三个视野的数据取平均值，得到一个独立数据点，最终每组样本量为n = 5个重复，用于统计分析。评分由两名不知分组情况的观察者完成。
蛋白质印迹（WB）
样本制备时，将小鼠肺组织（约 30 mg）精细剪碎，并在 300 µL 预冷的含 1% 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的 RIPA 裂解缓冲液中匀浆。使用组织匀浆器以 60 Hz 进行四次循环（每循环 60 秒）的匀浆处理。裂解物随后在 4 °C 条件下以约 13,400 × g 离心 15 分钟，收集上清液。总蛋白浓度通过标准 BCA 蛋白检测试剂盒测定。随后将样品归一化，按 4:1 的体积比与 5x 上样缓冲液混合，并在 95 °C 下变性 7 分钟。进行 SDS-PAGE 时，每泳道上样 20 µg 蛋白样品，并同时加入预染蛋白分子量标记物，先以恒定电压 80 V 电泳 20 分钟，随后调整至 120 V 继续电泳 70 分钟。蛋白质随后在冰浴中以恒定电流 300 mA 湿转至 0.22 µm PVDF 膜，持续 120 分钟。膜在室温下用含 5% BSA 的 TBST 封闭 1 小时，随后在 4 °C 与抗 CGRP（1:500）和 GAPDH（1:2000）的一抗孵育过夜（最长 18 小时）。用 TBST 洗涤三次（每次 10 分钟）后，膜在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗（1:10000）孵育 1–2 小时。再次洗涤三次后，使用 VILBER Fusion FX 成像系统中的增强化学发光（ECL）底物显影蛋白条带。采用 ImageJ 1.8 软件对条带强度进行定量，并将目标蛋白表达水平相对于 GAPDH 内参进行归一化处理。
统计学分析
所有实验数据均以均值表示 ± 标准差（SD）。数据分析与统计绘图使用专业的统计软件平台完成。组间比较前，数据集均系统地进行了正态性检验。对于符合正态分布且方差齐性的数据，采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey法、Šídák法、Holm-Šídák法或Fisher最小显著性差异（LSD）事后检验，用于多重两两比较。当多个组与单一对照组比较时，采用Dunnett检验。对于方差不齐的数据集，采用Brown-Forsythe方差分析，随后进行Dunnett's T3事后检验。对于不符合正态分布的数据集，采用非参数Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn事后检验进行多重比较。P值 < 0.05 被视为具有统计学显著性差异的阈值。不同的显著性水平以 * 动态标注p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001，以及****p < 0.0001。所有实验结果评估，包括组织学评分、流式细胞术分析和图像定量，均以严格盲法方式进行。
结果
KAST 减少肺部 ILC2 细胞并缓解 2 型气道炎症
为探究KAST的治疗效果，建立了OVA诱导的哮喘小鼠模型，并在肺俞（BL13）、膈俞（BL17）、脾俞（BL20）和肾俞（BL23）穴位贴敷给药图1A建模后，AA 小鼠表现出体重下降，而与模型组相比，KAST 小鼠体重显著增加（图1B）。肺系数是肺部炎症的指标，在AA小鼠中升高，但在接受KAST治疗后显著降低图1C）。行为学评估显示，AA小鼠鼻部搔抓和打喷嚏行为增加，KAST可显著缓解这些症状图1D–E）。全身体积描记法显示，AA小鼠的Penh值（提示气道高反应性）升高，但经治疗后降低，表明肺功能改善（图1F）。苏木精-伊红染色的组织病理学分析显示，与正常对照组相比，模型组出现支气管周围和肺泡周围炎性细胞浸润。相比之下，KAST组的炎性细胞浸润减轻图 2A–B）。免疫组织化学显示，IL-4、IL-5 和 IL-13 主要定位于浸润性炎性细胞及部分上皮细胞的细胞质中，并可能在间质区域有聚集。与正常对照组相比，模型组的阳性信号及平均光密度值显著升高，而 KAST 组则明显降低（图 2C–H）。流式细胞术进一步显示，与正常对照组相比，AA 小鼠肺组织中 ILC2 数量显著增加，而 KAST 显著降低了 ILC2 的数量（图 2I–J).
KAST 通过抑制 CGRP/RAMP1 轴缓解 2 型气道炎症
ILC2的过度活化受多种因素调控。RNA测序分析显示，在AA小鼠中，CGRP表达显著上调，而KAST明显降低了肺部CGRP水平（图3A）。Western blot和ELISA证实，与对照组相比，模型组CGRP蛋白水平升高，而KAST可降低该水平（图3B–D）。这些结果表明，KAST可减弱AA小鼠肺组织中CGRP的表达，从而调节ILC2的免疫反应。综上，高通量测序与蛋白筛查结果的变化提示，KAST干预与AA小鼠肺部CGRP水平的下调之间存在密切关联。
为进一步探讨降钙素基因相关肽（CGRP）的作用，对AA小鼠分别给予外源性CGRP、CGRP受体拮抗剂BIBN-4096，或KAST联合CGRP处理。ELISA结果显示，与单独使用KAST相比，KAST组和BIBN-4096组中CGRP蛋白水平显著降低，CGRP组水平升高，而KAST + CGRP组的CGRP水平高于单独KAST组（图4A）。流式细胞术分析显示，与模型组相比，KAST组和BIBN-4096组中2型固有淋巴细胞（ILC2）数量减少，而CGRP组和KAST + CGRP组中ILC2数量增加（图4B–C）。苏木精-伊红（HE）染色显示，KAST组和BIBN-4096组小鼠气道及肺泡周围的炎性细胞浸润减少，而CGRP组和KAST + CGRP组炎性细胞浸润加重（图4D–E）。ELISA进一步证实，KAST组和BIBN-4096组中IL-4、IL-5和IL-13水平降低，而CGRP组和KAST + CGRP组中这些细胞因子水平升高（图4F–H）。
通过多色免疫荧光染色评估了不同组别间肺组织中RAMP1+ILC2s的数量。结果显示，与正常对照组相比，模型组肺组织中总的RAMP1+ILC2s数量显著增加。与模型组相比，CGRP组肺组织中RAMP1+ILC2s数量进一步显著升高，而在BIBN-4096组和KAST组中则显著减少。值得注意的是，与KAST组相比，KAST + CGRP组肺组织中RAMP1+ILC2s的数量显著升高，表明外源性CGRP补充成功逆转了KAST对总RAMP1+ILC2s群体的抑制作用（图5A–B）。
数据可用性：
本研究期间生成并分析的全部原始数据集已存入公开可访问的存储库。具体而言，这些完整的资料包括蛋白质印迹（WB）实验的全部完整原始膜扫描图像、组织学（HE 和 IHC）及免疫荧光（IF）实验的全部完整原始高分辨率显微图像，以及独立的重复实验数据集和定量分析 Excel 表格。所有原始数据均可通过以下持久性 DOI 公开获取：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065。流式细胞术的设门顺序见补充图 1。两张完整的印迹图像作为补充图 2–3提交，定量数据则提交于补充表 1中。
图 1：KAST 对过敏性哮喘小鼠症状和肺功能的影响。 （A）使用 OVA 诱导过敏性哮喘的实验方案。（B）各组小鼠的体重统计结果，n = 5。（C）各组小鼠的肺系数，n = 5。（D）末次激发后 10 分钟内的搔鼻次数，n = 5。（E） 末次激发后 10 分钟内的喷嚏频率，n = 5。（F）各组小鼠在不同浓度乙酰胆碱刺激下的 Penh 值，n = 5。数据以均值 ± 标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。统计分析采用单因素方差分析或双因素方差分析，必要时进行事后多重比较检验。n = 生物学重复数。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：KAST 对 AA 小鼠 ILC2 数量及 2 型气道炎症的调控作用。 （A）通过苏木精-伊红（HE）染色观察肺组织的形态学变化。比例尺 = 50 µm。放大倍数：200×。炎症评分采用盲法评估。（B）不同组间炎症评分的统计分析，n = 5。（C–H）不同组小鼠肺组织中 IL-4（C, D）、IL-5（E, F）和 IL-13（G, H）蛋白表达的代表性免疫组化图像及平均光密度值，n = 5。比例尺 = 50 µm。放大倍数：200×。（I）代表性流式细胞术图示，显示正常组、模型组和 KAST 组肺组织 ILC2 的最终设门策略。依次设门筛选单细胞、活细胞中的 CD45+ Lineage-（CD3ε、CD4、CD8a、CD11b、CD11c、CD49b、TER-119、Ly-6G、CD19）细胞，随后为 CD90.2+ 细胞，最终通过 KLRG1+ 的阳性表达确定肺 ILC2。数据在高性能流式细胞仪平台上获取，并使用专业的流式细胞分析软件进行分析。（J）ILC2 的分析结果，以活细胞中 CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ 细胞所占百分比表示，n = 5。数据以均值 ± 标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行适当的事后多重比较检验。n = 生物学重复数。 请点击此处查看该图的高清版本。
图3：KAST抑制AA小鼠肺组织中CGRP的表达。（A）不同组间基因表达的热图，n = 4。（B）各组小鼠肺组织中CGRP（10 kDa）和GAPDH（37 kDa）表达的代表性WB图像。（C）肺组织中CGRP蛋白表达的WB分析，以相对CGRP表达量（CGRP/GAPDH比值）表示，n = 3。（D）肺组织中CGRP蛋白表达的ELISA分析，n = 4。数据以均值 ± 标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。统计学比较采用单因素方差分析，随后进行事后多重比较检验。n = 生物学重复数。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：KAST通过CGRP在AA小鼠中对ILC2数量及2型气道炎症的影响。 （A）不同组别小鼠肺组织中CGRP蛋白表达的ELISA分析，n = 4。（B）各组中ILC2s（CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺）的代表性流式细胞术图谱。（C）ILC2s的分析结果，以活细胞中CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺细胞所占百分比表示，n = 5。 （D）通过HE染色观察肺组织的形态学变化。比例尺 = 50 µm。放大倍数：200×。（E）不同组间炎症评分的统计分析，n = 5。（F–H）不同组别小鼠肺组织中IL-4（F）、IL-5（G）和IL-13（H）蛋白表达的ELISA分析，n = 4。数据以均值 ± 标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。统计学比较采用单因素方差分析，随后进行适当的事后多重比较检验。n = 生物学重复数。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：通过CGRP/RAMP1通路，KAST对肺组织中ILC2数量的影响。 （A）每400×视野下肺组织中RAMP1⁺ ILC2（定义为KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺三重阳性细胞）的细胞计数，n = 5。（B）肺组织代表性荧光染色图像。细胞核用DAPI染色（蓝色），免疫荧光染色标记KLRG1（紫色）、GATA3（红色）和RAMP1（绿色）。比例尺 = 50 µm。定量分析：使用专用图像分析平台，以盲法手动计数RAMP1⁺ ILC2（KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺细胞）。数据以均值 ± 标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。统计学比较采用单因素方差分析，随后进行事后多重比较检验。n = 生物学重复次数。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：代表性流式细胞术图显示肺内ILC2细胞分离的逐级设门策略。 首先，使用前向散射（FSC-A）与侧向散射（SSC-A）对总事件进行设门。通过FSC-A与FSC-H散点图排除双联体，以获得单细胞。活细胞通过Ghost Dye Red 780⁻染色识别，以排除死细胞群体。随后对CD45⁺细胞设门以确定白细胞，接着筛选谱系阴性（Lin⁻）细胞。在CD45⁺ Lin⁻亚群中，进一步对CD90.2⁺细胞设门，最终通过KLRG1阳性表达（KLRG1⁺）定义肺内ILC2细胞。请点击此处下载该文件。
补充图2： 小鼠肺组织样本中内参GAPDH（37 kDa）的代表性Western印迹图像。 使用ImageJ软件对条带积分光密度进行定量，用于后续归一化处理。请点击此处下载该文件。
补充图3：小鼠肺组织样本中靶蛋白CGRP（10 kDa）的代表性Western印迹图像。 CGRP的相对表达量通过将CGRP条带的积分光密度值除以相应GAPDH的积分光密度值得到。请点击此处下载该文件。
补充表 1：原始数据值。 用于绘制图表的原始数据值。请点击此处下载该文件。
讨论
AA 的治疗面临多种局限性，包括长期用药相关的副作用、症状控制不完全以及频繁复发。尽管传统药物治疗有效，但常伴随不良后果，例如对糖皮质激素的依赖26,27。相比之下，KAST 为 AA 的管理提供了一种安全、经济且便捷的替代方案。临床证据表明，KAST 可通过调节肺部免疫功能有效缓解哮喘症状28。在本研究中，我们进一步证实，KAST 通过抑制 CGRP/RAMP1 通路并减少 ILC2s 数量，从而减轻 AA 小鼠的 2 型气道炎症。
固有免疫，特别是2型固有淋巴细胞（ILC2s），在过敏性哮喘（AA）中2型气道炎症的启动、放大和维持过程中发挥着不可或缺的作用29。在过敏原暴露后，ILC2s迅速响应上皮细胞来源的警报素，数小时内即大量分泌IL-5和IL-13，从而触发2型炎症反应30,31。此外，ILC2s促进Th2细胞分化和IgE合成，进一步放大适应性免疫应答，加重气道炎症32。研究表明，在AA模型中，ILC2s的基因缺失显著缩短了气道炎症的持续时间，凸显其在维持2型炎症中的核心作用18。ILC2s受到多种细胞因子（如IL-25、IL-33、TSLP）、炎症介质（如白三烯）和神经肽（如CGRP、VIP、NMU）的调控33。其中，神经肽在固有免疫调节中发挥关键作用。神经调节素U（NMU）可直接增强ILC2活性，迅速诱导IL-5和IL-13的释放34。血管活性肠肽（VIP）参与营养摄取和昼夜节律调节，促进ILC2s产生IL-5，并维持嗜酸性粒细胞的稳态33。降钙素基因相关肽（CGRP）显著增强ILC2s释放IL-5，从而促进AA中的气道炎症。值得注意的是，CGRP的受体亚基RAMP1在ILC2s上的表达水平远高于其他神经肽受体，提示CGRP是激活ILC2s效力最强的配体35。本研究中，转录组分析发现CGRP是AA小鼠中差异表达最显著的神经肽之一，蛋白水平检测也证实其在肺组织中表达上调。外源性给予CGRP进一步增加了ILC2s的数量和2型细胞因子的释放，加重了气道炎症。
从机制上讲，CGRP 结合 ILC2 上的 RAMP1，调控其下游免疫应答。尽管部分现有文献将 CGRP 描述为一种负向调节因子，通过限制 ILC2 的扩增以防止过度炎症20,21，但相反的证据表明，CGRP 可与警报素协同作用，在特定病理微环境中强烈激活 2 型固有免疫反应。本研究的实验终点明确指向后一种级联过程，证明在 OVA 诱导的过敏微环境中，CGRP 可驱动肺部 ILC2 浸润的上调。相反，使用受体拮抗剂 BIBN-4096 阻断 CGRP 通路可显著减轻 ILC2 介导的气道炎症。本研究并未提供直接的基因敲除证据，而是通过关联性转录组变化及平行的药理学干预实验（使用外源性 CGRP 和拮抗剂 BIBN-4096），证明 KAST 的治疗保护作用与 ILC2 上 CGRP/RAMP1 信号簇的抑制密切相关。
尽管这些发现颇具前景，但仍需承认若干内在局限性。首先，虽然OVA诱导的小鼠模型可提供有价值的机制性见解，但由于物种间差异，该模型可能无法完全重现人类过敏性哮喘复杂的病理生理学和免疫学特征。其次，某些探索性检测的样本量相对较小，因此需要更大规模的队列研究以实现更广泛的统计学推广。第三，本研究主要聚焦于CGRP/RAMP1/ILC2信号轴，这意味着其他潜在相关的神经-免疫交互通路及重叠的细胞因子网络仍需在未来进行更深入的探索。尤为突出的是，一个主要的技术局限在于缺乏专门的假穴位贴敷对照组，即未使用非药物贴片或非穴位位置进行对照。因此，无法完全排除诸如剃毛造成的机械刺激、实验操作过程中的干扰以及贴片本身黏附刺激等非特异性混杂因素对KAST特异性治疗效应的影响。为解决上述问题，我们未来的研究方案将严格纳入经过严谨设计的假对照组，并开展多通路验证，以进一步巩固这些发现的特异性和可重复性。关于BIBN-4096干预后观察到的CGRP蛋白水平降低现象，必须明确指出：尽管BIBN-4096主要作为靶向RAMP1/CRLR受体复合物的竞争性拮抗剂，而非直接抑制CGRP合成的药物，但其在体内的给药仍可下调局部配体在组织中的积聚。这一继发现象可能通过破坏神经-免疫正反馈环路介导实现。通过阻断ILC2等靶免疫细胞上的RAMP1，BIBN-4096抑制了效应细胞因子的下游释放，从而反过来减弱了感觉神经末梢和肺神经内分泌细胞（PNECs）的逆行性炎症激活，最终间接减轻了CGRP的下游合成及其在组织中的滞留。
综上所述，我们的实证研究结果表明，KAST 通过靶向神经源性 CGRP/RAMP1 轴，有效重塑了肺部固有免疫微环境。尽管我们认识到，由于啮齿类动物与人类之间存在生物学差异，直接进行临床推论仍需谨慎优化，但这些研究终点为传统“肺合皮毛”理论提供了关键且此前缺失的机制基础。本研究通过提出更精细的神经-免疫作用视角，建立了可靠的科学基线，可为未来开展前瞻性、多中心临床研究，推动传统中药穴位贴敷疗法在过敏性哮喘管理中的转化应用提供指导与支持。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82274632）、江苏省中医药领军人才培育项目（编号：SLJ0309）、江苏省自然科学基金（编号：BK20231381）、江苏省中医药科技发展计划项目（编号：ZT202205）以及南京中医药大学教育部针灸与医学研究重点实验室（编号：AML202304）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3M 医用透气胶带 | 3M, USA | 1530C | 贴片固定 |
| 乙酰胆碱氯化物 | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | 支气管激发 |
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies, USA | G2939BA | RNA 质量与完整性评估 |
| Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific, USA | (custom order) | 免疫荧光（二抗） |
| 氢氧化铝 | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | 佐剂 |
| 抗 CGRP 抗体（兔） | Abcam, UK | ab81887 | Western blot / IF |
| BALB/c 小鼠（雌性，SPF 级，8–10 周龄，18–22 g） | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | 动物模型 |
| BB700 大鼠抗小鼠 CD90.2（克隆 53-2.1） | BD Biosciences, USA | 566465 | 流式细胞术 |
| BD FACSCanto II 流式细胞仪 | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | 流式细胞术 |
| BIBN-4096（Olcegepant 盐酸盐） | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | CGRP 受体拮抗剂 |
| 生物素-谱系抗体混合物 | BD Biosciences, USA | (Customized, clones as described) | 流式细胞术 |
| Brilliant Violet 605 链霉亲和素 | BD Biosciences, USA | 563260 | 流式细胞术 |
| BSA 白蛋白 V 型 | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Germany | 4240GR100 | 封闭 |
| 降钙素/CALCA 蛋白 | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | CGRP 干预 |
| CD11c/ITGAX 抗体（兔） | Abmart, Shanghai, China | MU115408S | 免疫荧光 |
| 柠檬酸抗原修复缓冲液 | Boster, China | AR0024 | 免疫组织化学 |
| DAPI 染色液 | Beyotime, Shanghai, China | C1006 | 细胞核染色 |
| ddH2O（双蒸水） | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | 蛋白复性与粉末溶解 |
| DESeq2 | Bioconductor (R package) | Version 1.42.0 | 差异表达分析软件 |
| DNase I | Roche Diagnostics, Germany | 10104159001 | 肺组织消化 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 555） | Abcam, UK | ab150106 | 免疫荧光（二抗） |
| ECL 底物（超灵敏） | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Western blot 化学发光 |
| 增强型 BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime, Shanghai, China | P0010 | 蛋白定量 |
| 伊红 Y 染色液 | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | 组织学（HE 染色） |
| 乙醇（无水，分析纯） | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | 组织脱水与组织学 |
| F4/80 抗体（小鼠，克隆 C-7） | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | 免疫荧光 |
| fastp | 开源（GitHub） | Version 0.23.4 | RNA-seq 原始数据质控软件 |
| FITC 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11） | BD Biosciences, USA | 553080 | 流式细胞术 |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | 流式细胞术分析 |
| GAPDH 单克隆抗体（小鼠） | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Western blot |
| GATA3 抗体（小鼠，克隆 L50-823） | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | 免疫荧光 |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | 死细胞排除 |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗 | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | 免疫荧光（二抗） |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | 统计分析 |
| 苏木精溶液（Harris） | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | 组织学（HE 染色） |
| HISAT2 | 约翰霍普金斯大学（开源） | Version 2.2.1 | RNA-seq 参考基因组比对软件 |
| HRP 标记山羊抗小鼠 IgG（H+L） | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | Western blot（二抗） |
| HRP 标记山羊抗兔 IgG（H+L） | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Western blot（二抗） |
| HTSeq-count | EMBL（Python 工具） | Version 2.0.3 | RNA-seq 基因组特征读数计数工具 |
| 过氧化氢（H2O2，3% 溶液） | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | 内源性过氧化物酶封闭 |
| iFluor™ 488 标记山羊抗兔 IgG 抗体 | Huabio, China | HA1121 | 免疫荧光（二抗） |
| IL-4 单克隆抗体 | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Western blot |
| IL13 抗体 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Western blot |
| IL5 抗体 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | – | RNA 测序 |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Western blot 定量 |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Version 6.0 | 图像光密度定量 |
| KAST 中药复方制剂 | 南京中医药大学附属医院药剂科 | – | 干预 |
| KLRG1 单克隆抗体（2F1） | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | 免疫荧光 |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Germany | 4.5 | 免疫荧光定量 |
| Leica STELLARIS 8 DIVE 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems, Germany | STELLARIS 8 | 免疫荧光成像 |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Germany | 5401119001 | 肺组织消化 |
| 蛋白 Marker（预染蛋白 Ladder） | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Western blot |
| 小鼠 CGRP ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ELISA |
| 小鼠 IL-13 ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ELISA |
| 小鼠 IL-4 ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ELISA |
| 小鼠 IL-5 ELISA 试剂盒 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ELISA |
| 中性树胶封片剂 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | 组织切片封片 |
| 正常山羊血清（用于封闭） | Abcam, UK | ab7481 | 免疫组织化学/IF 封闭 |
| OCT 包埋剂 | Sakura, USA | 4583 | 冷冻切片包埋 |
| 一步法 PAGE 凝胶快速制备试剂盒 | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | SDS-PAGE 凝胶制备 |
| 卵清蛋白（OVA） | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | 致敏/激发 |
| 多聚甲醛（4% PBS 溶液） | Biosharp, China | BL539A | 组织固定 |
| PE 抗小鼠/人 KLRG1（克隆 2F1） | BD Biosciences, USA | 564022 | 流式细胞术 |
| 磷酸酶抑制剂混合物（50×） | Beyotime, Shanghai, China | P1092 | 蛋白提取 |
| 多聚赖氨酸溶液 | Boster, China | AR0003 | 组织切片涂层 |
| 蛋白酶与磷酸酶抑制剂 | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | 蛋白提取 |
| PVDF 膜（0.22 μm） | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Western blot |
| RAMP1 多克隆抗体（兔） | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | 免疫荧光 |
| 红细胞（RBC）裂解缓冲液 | Beyotime, Shanghai, China | C3702 | 流式细胞术样本制备 |
| RIPA 裂解缓冲液（强） | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | 蛋白提取 |
| RPMI-1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | 组织细胞消化基础培养基 |
| SuperKine™ 增强型抗荧光淬灭封片液 | 武汉雅科因生物科技有限公司 | BMU104 | 免疫荧光封片 |
| 曲拉通 X-100（去垢剂） | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | 免疫荧光通透 |
| TRIzol 试剂 | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | RNA 提取 |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq 文库构建试剂盒 | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | RNA-seq 文库构建 |
| 全身体积描记系统 | 广元达，北京，中国 | WBP-4 | 肺功能（Penh） |
| 二甲苯（分析纯） | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | 脱蜡与透明 |
参考文献
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