急性白血病可测性残留病评估的标准化多色流式细胞术方案

摘要

本方案描述了一种用于急性白血病可测量残留病评估的标准化多色流式细胞术工作流程，通过整合受控的样本处理、统一的采集参数、顺序设门策略以及分母校正的解释方法，以提高常规临床实验室中的分析可重复性。

摘要

可测量残留病（MRD）是急性白血病管理中重要的预后指标。然而，常规多色流式细胞术（MFC）检测仍易受到分析前和分析中变异的影响，包括血液稀释、采集深度不一致以及主观判读。本文介绍了一种用于B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和急性髓系白血病（AML）常规MRD评估的标准化操作流程。该方案纳入严格的样本接收标准，并整合血液稀释评估，采用全量红细胞裂解法处理骨髓和外周血样本。分析过程的标准化通过疾病特异性的双管八色抗体组合、统一的采集目标（至少获取50万个CD45阳性事件）以及固定的顺序设门策略实现。此外，该流程采用基于分母校正的检测下限（LOD）和定量下限（LOQ），支持客观的三级报告系统。在197例临床样本中的验证结果显示良好的重复性、稳健的稀释线性关系以及与配对的正交分子检测方法高度一致。综上所述，该方案通过整合受控的分析前处理和统一的分析参数，为常规临床实验室提供了标准化MRD监测的实用框架。

引言

即使在达到形态学缓解后，急性白血病患者仍需持续监测可测量残留病（MRD），以准确评估复发风险。传统的形态学和细胞病理学检查缺乏检测低水平残留白血病细胞群所需的敏感性。因此，MRD评估已成为急性髓系白血病（AML）和B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）疾病监测中的关键组成部分。欧洲白血病网近期发布的指南强调，在AML中可靠的MRD评估依赖于技术标准化和观察者间的一致性，而不仅仅是检测方法的可及性^1,2。在B-ALL中，对于缺乏稳定分子靶点的患者，多色流式细胞术（MFC）尤为重要。既往研究表明，采用结构化抗体组合设计的标准化多色流式细胞术方法可实现可重复且高敏感性的残留病检测³。由于其广泛的适用性、快速的检测周期和较高的成本效益，流式细胞术被广泛应用。然而，检测性能高度依赖于标准化的样本制备、采集参数和数据分析⁴。

在流式细胞术MRD检测中，一个主要的技术挑战是稀有事件的检测，这在很大程度上受到采集深度和总事件数的影响。即使使用相同的抗体组合，若样本的分母规模不一致，也可能导致分析灵敏度不同⁵。因此，标准化不仅限于抗体的选择，还需要在样本处理、大量红细胞裂解、仪器补偿、采集目标以及设门策略方面实现统一。在骨髓样本中，血液稀释也是一个重要的分析前变量，因为外周血污染可能人为地降低表观残留白血病负荷^6,7。此外，对低频事件的解读需要根据样本特异性的采集深度明确定义报告阈值。近期研究强调了基于分母校正的检测限（LOD）和定量限（LOQ）在提高流式细胞术MRD结果解读一致性方面的重要性⁸。

本方案的总体目标是为基于多色流式细胞术（MFC）的B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和急性髓系白血病（AML）微小残留病（MRD）常规检测提供标准化的工作流程。该方案将样本接收标准、血液稀释评估、疾病特异性抗体组合设计、全血裂解样本制备、统一的采集目标、固定的顺序设门策略以及经分母校正的报告标准整合到一个统一的操作框架中^9,10。通过结合标准化的分析前和分析中操作流程，该方法为临床实验室常规开展MRD监测提供了实用且可重复的技术路径。图1展示了本研究中实施的整体标准化分析前与分析中工作流程。表1总结了在验证期间不同预设监测时间点（诱导治疗结束、巩固治疗阶段及造血干细胞移植前）纳入的B-ALL和AML患者的队列特征及样本特征。

图 1：常规多色流式细胞术微小残留病（MRD）检测的标准化工作流程。（A）分析前工作流程，显示在预定义的监测时间点进行的样本筛选和质量评估。（B）分析工作流程，从全血红细胞裂解和抗体染色，到逐级设门、基于分母校正的结果判读，以及最终的MRD报告。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：汇总的患者人口统计学特征、临床标本特征及常规检测指标。 本修订后的单表总结了纳入队列中B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和急性髓系白血病（AML）病例的基本临床特征，并整合了患者层面的人口统计学数据与标本层面的特征、治疗监测时间点、细胞活力、血液稀释评分、检测深度以及经分母校正后的可测量残留病（MRD）分类。请点击此处下载该表格。

方案

所有涉及人体标本的操作均按照机构指南进行，并经内江市第二人民医院伦理委员会批准（批准号：PXTS887192）。本研究使用常规诊断检测后剩余的去标识化临床标本。由于本研究不影响患者的诊疗、治疗分配或标本采集流程，因此豁免了知情同意。本方案中使用的化学品、试剂和设备列于材料表中。

1. 标本采集与分析前评估

1. 采集骨髓穿刺液作为可测量残留病（MRD）评估的首选标本类型。仅在临床上禁忌进行骨髓穿刺时，或在特定的监测和对照分析中，才使用外周血标本。
2. 尽可能在首次抽吸时采集骨髓标本。避免后续多次抽吸，以尽量减少外周血污染及对低水平残留病的低估。
3. 采集后应立即将标本转移至含二钾乙二胺四乙酸（K2-EDTA）或肝素钠抗凝剂的试管中。标本储存和运输期间应保持室温（18–25 °C），并避免直接暴露于阳光下。
   注意：切勿将标本冷藏。
4. 所有标本应在采集后24小时内完成处理。对于稳定性研究，应在24小时和48小时保留等分试样用于重复分析，同时维持室温储存条件。
5. 收到标本后，应核对患者标识符、抗凝剂类型、标本完整性及采集时间。若标本出现明显凝块、严重溶血或显著细胞退变，则应拒收。
6. 在最终解读前，应对骨髓标本进行血液稀释评估。计算一个介于0.00至1.00之间的半定量血液稀释评分，以估计外周血污染程度。
7. 该评分通过将成熟淋巴细胞比例除以CD34阳性祖细胞、未成熟粒细胞与成熟淋巴细胞三者之和得到，商值越高，表明稀释效应越显著。
   注：使用以下公式计算评分：
    
   其中评分越高，表示外周血污染越严重。
8. 血液稀释评分分类如下：＜0.20，可接受；0.20–0.39，轻度稀释；≥0.40，显著稀释。
   注：对于显著稀释的标本，除非确认有足够的分母细胞数量且骨髓前体细胞结构保存良好，否则不应作出明确的MRD阴性判断。

2. 疾病特异性抗体 panel 的制备

1. 为B-ALL和AML分析制备标准化的疾病特异性双管八色抗体组合。通过在所有管中严格采用固定的骨干标记物，实现组合的标准化，以确保细胞群设门的稳定性。
2. 对相应的谱系抗原使用一致的荧光素偶联物，并严格遵循制造商推荐的滴定体积，以最小化不同批次间的荧光变异。
3. 有关标记物组合、荧光素分配、抗体克隆、染色体积和采集参数，请参见补充表1。
4. 在B-ALL评估中，两管均使用CD19、CD45、CD34、CD10和CD20作为骨干标记物，以定义前体细胞群及成熟模式。在第1管中添加CD38、CD58和CD81。
5. 根据基线评估时确立的诊断性白血病相关免疫表型，在第2管中添加CD66c、CD123以及CD73或CD304之一。
6. 在AML评估中，两管均使用CD45、CD34、CD117、CD13、CD33和HLA-DR作为骨干标记物，以定义原始细胞及未成熟髓系细胞群。
7. 在第1管中添加CD7和CD56，以评估跨谱系抗原表达；在第2管中添加CD11b和CD15，以评估髓系成熟异常。

3. 大量裂解制备与染色

1. 将2.0 mL充分混匀的骨髓或外周血样本转移至15 mL聚丙烯管中。若样本体积有限，最少可使用1.0 mL作为起始体积。
2. 向样本中加入10 mL预热的氯化铵裂解缓冲液，在室温下孵育10分钟，以裂解红细胞。
3. 以500 × g 离心5分钟。小心弃去上清液，避免扰动有核细胞沉淀。
4. 用含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀。若仍可见残留血红蛋白污染，可重复洗涤一次。
5. 使用自动化血液分析仪或台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板测定有核细胞浓度。建议将最低有核细胞浓度5 × 10⁶ 个/mL作为标准检测的最佳条件。
   注意：若细胞得率低于此阈值，可通过再次以500 × g 离心5分钟浓缩样本，并谨慎减少重悬缓冲液体积，以最大化细胞密度。
6. 常规染色时，每管分装5 × 10⁶ 个有核细胞。当样本回收量允许时，高灵敏度分析可将每管输入量增至最高1 × 10⁷ 个细胞^6,7。
7. 根据材料表中指定的抗体混合物和可固定活力染料，按照已验证的染色方案向各管加入经单独滴定的抗体组合。常规验证方案中，每种荧光素偶联抗体使用5 µL，除非制造商推荐的滴定结果表明需使用特定抗体的不同体积。
8. 确保最终染色反应体系严格控制在每检测样本100 µL，以维持最佳的抗体-抗原化学计量比。将样本在避光条件下室温孵育15分钟。
9. 使用洗涤缓冲液对染色后的细胞进行一次洗涤，并将最终沉淀重悬于500 µL上机缓冲液中。
10. 在样本上机检测当天，使用补偿微珠制备单染补偿对照。

4. 仪器设置与数据采集

1. 在采集患者样本前，对流式细胞仪执行每日启动质量控制。使用校准微球，按照制造商说明书验证流路系统、激光校准、检测器性能和荧光目标值。
2. 使用抗体组合中包含的相同荧光染料制备单染补偿对照。在采集患者样本前调整补偿矩阵，并确认骨干标记物的荧光信号仍处于预设的荧光目标范围内。
3. 在验证期间分析所有样本时，应使用相同的采集模板、检测器设置、补偿策略和设门层级。
   注意：通过使用专用校准微球为所有检测器建立标准化的目标中位荧光强度值，确保不同仪器间的良好一致性，并在临床数据采集前确认相同样本在不同平台上的荧光谱型具有可比性。
4. 以低至中等流速采集数据，以减少同时事件（重叠事件）并保持对稀有事件检测的准确性。在采集过程中持续监测事件速率。
5. 每项可报告的微小残留病（MRD）结果应至少采集50万个多形核白细胞抗原CD45阳性的有核细胞事件。当样本质量和事件稳定性允许时，尤其怀疑存在低水平残留病时，应将采集总数延长至100万至150万个总事件。
6. 若出现流路不稳定、样本堵塞、事件率突然变化或散射光质量明显下降等情况，应暂停或停止采集。必要时重新过滤或混匀样本，仅在恢复稳定流速后重新进行样本采集。

5. 顺序设门与分母校正解释

1. 使用经过验证的流式细胞术分析软件分析流式细胞术数据。对所有样本采用相同的顺序设门策略，以减少操作者间的差异性。
2. 通过独立获取并分析至少20份正常或再生骨髓样本的参考数据库，建立正常与再生状态下的成熟模式，作为基准表达模板。
3. 使用前向散射和侧向散射参数排除碎片。通过前向散射-面积参数分离单个细胞 与 前向散射-高度门控
4. 使用材料表中列出的活率染料门控排除非活细胞。常规清除这些非活细胞，因为它们会表现出非特异性抗体结合，可能人为增加背景噪声或模拟稀有异常细胞群。
   注意： 要求细胞活性不低于75%以确保后续分析的可靠性，低于此阈值的样本在解释潜在罕见事件假象时需谨慎。通过圈选具有适当侧向散射特性的活细胞CD45阳性事件来确定白细胞分母。
5. 对于B-ALL样本，将分析限定于CD19阳性前体细胞群。对于接受抗CD19靶向治疗的患者，采用替代的设门分析策略。
6. 将主要评估转向 CD22、CD24 或 CD34 阳性细胞群，以独立于 CD19 表达来捕获白血病细胞群体。评估 CD34、CD10 和 CD20 的成熟模式，并通过 CD38、CD58、CD81、CD66c、CD123 和 CD73 或 CD304 的表达模式识别异常细胞群。
7. 对于急性髓系白血病（AML）样本，使用CD45、侧向散射、CD34和CD117的表达来界定原始细胞或前体细胞区域。
8. 评估髓系及跨谱系标志物（包括 CD13、CD33、HLA-DR、CD7、CD56、CD11b 和 CD15）的异常或不同步表达。
9. 使用所获得的有活力的 CD45 阳性事件总数作为分母，计算标本特异性的检测下限（LOD）和定量下限（LOQ）： 
    
    
10. 将最终的MRD结果判读分为以下三类之一：MRD阳性、低于检出下限（LOD）或分析受限。
    1. 当出现明显且连续的异常事件簇，其数量超过标本特异的检出限（LOD），并表现出与正常或再生造血细胞群体不同的内部一致的免疫表型时，判定结果为微小残留病阳性（MRD-positive）。
       注意： 切勿将分散的、非成簇事件归类为微小残留病阳性。应采用整合分析方法，结合从基线诊断样本追踪的白血病相关免疫表型（LAIP）以及异于正常（DfN）的模式识别策略。
    2. 当存在罕见可疑事件但未达到标本特异性的可报告阈值时，将结果判定为以下 LOD。
    3. 当样本量不足、溶血严重、标本质量差，或分析前及分析过程中的局限性导致无法对阴性结果做出可靠判断时，应将结果判定为分析受限。
11. 由第二位合格的分析人员独立复核所有MRD阳性及临界低水平病例。
12. 在审查配对的分子比较数据（包括定量聚合酶链式反应或下一代测序结果）之前，先完成流式细胞术结果的判读。  

6. 分析验证方法

1. 通过从同一裂解后细胞悬液制备两份平行等分试样，评估分析的重复性。独立获取并分析至少30对配对样本。
2. 在预期的低负荷范围内，制备六个稀释水平的系列稀释样本，以评估稀释线性。比较稀释系列中观察到的微小残留病（MRD）值与预期MRD值。
3. 通过在多名合格操作人员和经过标准化的流式细胞仪之间分析参考样本，评估操作者间和仪器间的重现性。
4. 在进行统计学比较前，对流式细胞术和配对分子检测所得的MRD百分比数据进行log10转换。采用相关性分析和Bland-Altman分析评估定量一致性。

结果

常规实施数据集的特征

在研究期间，共有197例连续样本通过了合格性筛选和分析前质量评估，并进入可报告的工作流程。研究队列包括98例患者，其中62例（63.3%）为B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），36例（36.7%）为急性髓系白血病（AML）。队列中男性64例（65.3%），女性34例（34.7%），中位年龄为32岁（四分位距[IQR]，13–49岁；范围，2–73岁）。基线中位原始细胞百分比为67.2%（IQR，56.9% – 80.2%）。

大多数分析样本为骨髓穿刺物（174/197，88.3%），而外周血样本占23/197（11.7%）。根据预设的监测时间点，86份样本（43.7%）在诱导治疗结束时采集，65份（33.0%）在巩固治疗期间采集，46份（23.4%）在造血干细胞移植（HSCT）前采集（表1）。

标本的中位存活率为88.3%（四分位距，84.4%–92.6%）。在数据清洗前，采集流程获得的总事件数中位数为1,116,901（四分位距，908,521–1,258,946）。经过依次排除碎片、重叠双联体及非活细胞后，设门策略最终获得中位数为907,325个活单CD45阳性目标事件（四分位距，690,112–1,095,836），中位采集时间为11.9分钟。中位血液稀释评分为0.20（四分位距，0.14–0.28）。根据经分母校正后的结果解读，41份标本（20.8%）被判定为微小残留病（MRD）阳性，156份标本（79.2%）低于个体化标本的检测下限（LOD）（表1）。

分析验证：重复性、线性与稳定性

通过重复性、稀释线性及短期稳定性研究评估了标准化流程的分析性能（图2）。由相同大量裂解样本制备的重复分装样本显示出良好的重复性，其重复检测的中位变异系数（CV）为0.101%，第95百分位CV为0.222%。

图2：标准化多色流式细胞术微小残留病（MRD）检测流程的分析验证。(A) 所分析样本中样本活力的分布情况。(B) 对连续稀释实验进行对数分析时，预期值与观测MRD值之间的相关性。(C) 重复性评估中独立重复检测结果之间的一致性。(D) 样本在室温下保存0 h、24 h和48 h后MRD检测结果的稳定性。请点击此处查看该图的放大版本。

为评估低水平检测性能，对预期的最低微小残留病（MRD）范围内包含72个总观测值的12次连续稀释实验进行了分析。在对数分析中，观测到的MRD值与预期值显示出高度一致性（r = 0.999，校正R² = 0.998，斜率 = 1.009，截距 = 0.018），表明在低频事件范围内线性关系保持良好。

短期稳定性检测显示，随着时间的推移，样本活力呈进行性下降，中位活力从0小时的89.1%降至24小时的84.9%和48小时的80.6%。相比之下，微小残留病（MRD）负荷在24小时和48小时的中位绝对相对变化分别仅为6.2%和12.0%，表明在采集后24小时内进行常规处理是可行的。

操作者间和仪器间可重复性

通过多位操作人员和经校准的流式细胞仪对24份参考样本进行分析，共获得96次评估结果，用于评价操作者间和仪器间的重复性。相对于参考值的中位绝对相对偏差为13.7%。这些结果表明，在标准化样本制备、采集参数设置和顺序设门策略后，分析性能保持一致（表2）。

表2：标准化可测量残留病灶检测流程的分析验证与方法学比较性能指标。 本表仅限于验证结果，包括批内重复性、稀释线性、短期稳定性、操作者间和仪器间重现性，以及与正交分子方法比较的指标；不重复表1中已报告的患者人口统计学特征或样本特性。请点击此处下载该表格。

临床应用与正交方法比较

采用117例配对样本进行了正交比较，其中75例通过定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，42例通过下一代测序（NGS）分析。qPCR检测主要监测诊断时确立的疾病特异性融合转录本，包括BCR::ABL1、RUNX1::RUNX1T1和PML::RARA。NGS方法则针对淋巴母细胞白血病评估克隆性免疫球蛋白或T细胞受体基因重排，并利用靶向髓系基因 panel 追踪急性髓系白血病中的复发性体细胞突变。流式细胞术检测的微小残留病（MRD）结果与配对的分子检测结果在可测量的疾病水平上表现出高度相关性（对数分析r = 0.893）。

Bland-Altman 分析显示平均对数差异为 −0.093，一致性界限范围为 −0.848 至 0.663（图 3）。在不一致的病例中，25 份分子检测阳性样本中发现 1 例假阴性结果。该检测流程的阳性符合率为 78.1%，阴性符合率为 97.6%，总体一致性率为 92.3%。

图3：标准化微小残留病灶（MRD）评估的临床应用及正交验证。(A) 不同疾病组别和监测时间点中MRD阳性病例的分布情况。 (B) 流式细胞术检测的MRD数值与配对分子学对照结果在对数分析下的相关性。 (C) Bland-Altman分析比较流式细胞术与配对分子学MRD检测结果，水平线表示在整个分析范围内的一致性平均偏差及95%一致性界限。 (D) 治疗监测各时间点中MRD阳性结果的分布情况。 请点击此处查看该图的放大版本。

这些研究结果表明，标准化的多色流式细胞术检测流程在常规临床样本中与正交分子微小残留病（MRD）检测方法之间具有高度一致性。

补充表1：标准化多色流式细胞术可测量残留病灶检测流程的全面操作参数。 本统一表格将必要的方法学组成部分划分为不同部分。第A部分详细列出了疾病特异性的抗体组合配置，其中CD73或CD304的选择基于初诊时确定的白血病相关免疫表型。第B部分概述了标准化的分析前样本处理及流式细胞术检测目标。第C部分定义了经分母校正后的报告阈值以及最终解读标准。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究的主要目的是建立一种用于急性白血病可测量残留病（MRD）多色流式细胞术评估的标准化工作流程。可靠的MRD评估不仅依赖于抗体组合的选择，还依赖于标本处理的一致性、采集参数的统一以及数据分析的规范性¹¹。本研究结果表明，在常规临床实验室环境中，通过统一标本处理流程、控制数据采集深度以及采用分母校正的报告标准，可提高分析的可重复性。这些发现与近期致力于在不同机构和操作人员之间实现流式细胞术MRD评估标准化的努力相一致¹²。

该工作流程的一个重要环节是基于氯化铵的大量红细胞裂解步骤。稀有事件微小残留病（MRD）检测需要获取大量的细胞样本，以达到足够的分析灵敏度。标准化的大量裂解制备方法能够稳定地回收足够数量的有核细胞，通常获取的事件数超过100–150万个，同时保持可接受的样本活力。欧洲流式细胞术联盟（EuroFlow Consortium）先前的研究同样强调，高事件数采集对于实现灵敏且可重复的MRD检测至关重要¹³。对于分析灵敏度不理想的样本，故障排查应包括对样本体积、细胞回收率以及采集深度的评估。

本方案还包括在解读微小残留病灶（MRD）阴性低水平结果前进行常规的血液稀释评估。血液稀释仍是基于骨髓的MRD检测中主要的分析前局限性，因为外周血污染可能人为地降低表观白血病负荷。将半定量的血液稀释评分直接纳入报告流程，可额外防止将结果误判为假阴性。既往研究报道，血液稀释显著影响急性髓系白血病流式细胞术MRD分析的可靠性⁷。因此，对于显示明显血液稀释（≥0.40）的标本，应谨慎解读，尤其是在采集深度不足或骨髓前体细胞保存不佳的情况下。

本研究进行的正交比较表明，流式细胞术与分子学MRD检测方法在总体上具有高度一致性。然而，不一致的病例也凸显出流式细胞术与分子检测方法所评估的是残留病的不同生物学特征。既往研究表明，表型漂移、克隆演化以及再生性造血可能造成不同分析平台之间的结果差异¹⁴。在B-ALL中，当疾病负荷较低时，区分残留的白血病前体细胞与正常的造血母细胞尤为困难，需要整合多维免疫表型模式进行综合判读，而非仅依据单一抗原异常¹⁵。因此，本流程中所有临界值和低水平MRD病例均由第二位分析人员独立复核。

本研究存在若干局限性。首先，验证工作仅在单一机构内使用有限数量的标准化仪器完成。其次，外周血样本仅在部分特定临床情况下被纳入，因为在大多数急性白血病的常规治疗后微小残留病（MRD）评估中，其无法替代骨髓样本。此外，尽管已采用标准化操作流程，某些分析参数（包括血液稀释评分和低水平事件的判读）仍需经验丰富的操作人员进行人工审核。尽管如此，该方案为标准化多色流式细胞术MRD检测在临床常规中的应用提供了切实可行的框架^16,17。通过整合分析前质量评估、标准化的数据采集策略以及分母校正的判读标准，该流程有助于在常规实验室实践中实现更具可重复性和临床一致性的MRD报告。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
采集缓冲液	实验室制备的	含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS；最终重悬体积为500 µL	流式细胞术检测前的最终重悬
AML 1号管 CD117-APC 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：104D2；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同	早期髓系/原始细胞鉴定
AML 管 1 anti-CD13-FITC 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：L138；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	髓系谱系锚定
AML试管1抗CD33-PE抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：P67.6；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异	髓系谱系锚定
AML管1抗CD34-PerCP-Cy5.5抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异	未成熟标志物
AML 管 1 anti-CD45-APC-H7 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	白细胞骨架标记物与分母定义
AML试管1抗CD56-V500抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：NCAM16.2；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	异常原始细胞相关表型分析
AML 管 1 CD7-V450 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：M-T701；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异	跨谱系异常检测
AML管1 抗-HLA-DR-PE-Cy7抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：G46-6；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同	成熟与亚型鉴别
AML管2 抗CD117-APC抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：104D2；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同	早期髓系/原始细胞鉴定
AML 管 2 anti-CD11b-V450 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖） / 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：ICRF44；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	成熟度不一致评估
AML管2 抗CD13-FITC抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：L138；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异	髓系谱系锚定
AML管2 CD15-V500抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：HI98；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	异常髓系模式评估
AML试管2 抗CD33-PE抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：P67.6；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	髓系谱系锚定
AML管2 抗-CD34-PerCP-Cy5.5抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	未成熟标志物
AML管2 抗CD45-APC-H7抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	白细胞骨架标记物与分母定义
AML试管2 抗HLA-DR-PE-Cy7抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：G46-6；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	成熟与亚型鉴别
基于氯化铵的红细胞裂解缓冲液	实验室制备 / 商业供应商	基于氯化铵的裂解缓冲液；每检测10 mL；室温下10分钟	大量红细胞裂解
分析软件	贝克曼库尔特（美国加利福尼亚州布雷亚）	Kaluza 2.1	数据分析与连续门控
全自动血液分析仪	商业供应商	用于有核细胞浓度和活力评估的全自动血液分析仪	有核细胞浓度与活力评估
B-ALL 管 1 抗 CD10-PE 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：HI10a；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	前体B细胞定义
B-ALL 第1管 CD19-FITC抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：SJ25C1；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	B系鉴定及进入前体细胞区室
B-ALL 管 1 抗 CD20-APC 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：L27；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异	成熟模式评估
B-ALL 第1管 CD34-PerCP-Cy5.5 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	未成熟标志物
B-ALL 管 1 抗 CD38-PE-Cy7 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：HIT2；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	与再生的正常前体细胞的分离
B-ALL 第1管 CD45-APC-H7 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	白细胞骨架标记物与分母定义
B-ALL 第1管 CD58-V450抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：TS2/9；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	残余白血病前体细胞中的异常检测
B-ALL 第1管 CD81-V500抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：JS-81；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	异常前体识别的支持
B-ALL 第2管 CD10-PE 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：HI10a；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	前体B细胞定义
B-ALL 第2管 CD123-V450抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：9F5；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则进行 L/test	异常前体细胞表型分析
B-ALL 第2管 CD19-FITC抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：SJ25C1；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则进行 L/test	B系鉴定及进入前体细胞区室
B-ALL 第2管 CD20-APC 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：L27；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	成熟模式评估
B-ALL 第2管 CD34-PerCP-Cy5.5 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	未成熟标志物
B-ALL 第2管 CD45-APC-H7 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	白细胞骨架标记物与分母定义
B-ALL 第2管 CD66c-PE-Cy7 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：KOR-SA3544；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test	白血病相关异常支持
B-ALL 第2管 CD73/CD304*-V500 抗体	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	克隆：AD2/AZ1；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同	根据诊断表型进行的额外异常确认
骨髓/外周血标本	第二人民医院’内江市医院	剩余临床样本	微小残留病灶评估
补偿微珠	商业供应商	用于样本采集当天的单染补偿微珠	同日补偿对照制备
可固定活力染料	商业供应商	每支染色管中均含有可固定的活死染色染料	排除非活细胞；活力门控参见方案 3.7 和 5.4
流式细胞仪	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	FACSCanto II / Navios EX	多色流式细胞术数据采集
血细胞计数板	商业供应商	手动血细胞计数板计数	人工有核细胞计数
PBS/BSA/EDTA 洗涤缓冲液	实验室制备的	含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA的磷酸盐缓冲液	细胞洗涤与重悬
台盼蓝溶液	商业供应商	台盼蓝排斥法	台盼蓝染色排除法手动评估细胞活力
经验证的抗体混合物	BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚）	参见下文的抗体特异性行及补充表S1	微小残留病免疫表型检测