本方案描述了一种用于急性白血病可测量残留病评估的标准化多色流式细胞术工作流程，通过整合受控的样本处理、统一的采集参数、顺序设门策略以及分母校正的解释方法，以提高常规临床实验室中的分析可重复性。
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本方案描述了一种用于急性白血病可测量残留病评估的标准化多色流式细胞术工作流程，通过整合受控的样本处理、统一的采集参数、顺序设门策略以及分母校正的解释方法，以提高常规临床实验室中的分析可重复性。
可测量残留病（MRD）是急性白血病管理中重要的预后指标。然而，常规多色流式细胞术（MFC）检测仍易受到分析前和分析中变异的影响，包括血液稀释、采集深度不一致以及主观判读。本文介绍了一种用于B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和急性髓系白血病（AML）常规MRD评估的标准化操作流程。该方案纳入严格的样本接收标准，并整合血液稀释评估，采用全量红细胞裂解法处理骨髓和外周血样本。分析过程的标准化通过疾病特异性的双管八色抗体组合、统一的采集目标（至少获取50万个CD45阳性事件）以及固定的顺序设门策略实现。此外，该流程采用基于分母校正的检测下限（LOD）和定量下限（LOQ），支持客观的三级报告系统。在197例临床样本中的验证结果显示良好的重复性、稳健的稀释线性关系以及与配对的正交分子检测方法高度一致。综上所述，该方案通过整合受控的分析前处理和统一的分析参数，为常规临床实验室提供了标准化MRD监测的实用框架。
即使在达到形态学缓解后，急性白血病患者仍需持续监测可测量残留病灶（MRD），以准确评估复发风险。传统的形态学和细胞病理学检查缺乏检测低水平残留白血病细胞群所需的灵敏度。因此，MRD评估已成为急性髓系白血病（AML）和B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）疾病监测中的关键组成部分。欧洲白血病网（European LeukemiaNet）最近的建议强调，AML中可靠的MRD评估依赖于技术标准化和观察者间的一致性，而不仅仅是检测方法的可及性1,2。在B-ALL中，对于缺乏稳定分子靶点的患者，多色流式细胞术（MFC）尤为重要。既往研究表明，采用结构化抗体组合设计的标准化多色流式细胞术方法可实现可重复且高灵敏度的残留病灶检测3。流式细胞术因其广泛的适用性、快速的检测周期和较高的成本效益而被广泛应用。然而，检测性能在很大程度上依赖于标准化的样本制备、采集参数和数据分析4。
流式细胞术微小残留病（MRD）检测面临的主要技术挑战之一是稀有事件的检测，其检测效果在很大程度上受采集深度和总事件数的影响。即使使用相同的抗体组合，若样本采集时的分母规模不一致，也可能导致不同的分析灵敏度5。因此，标准化不仅限于抗体的选择，还需要在样本处理、大量....
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所有涉及人体样本的操作均按照机构指南进行，并经内江市第二人民医院伦理委员会批准（批准号：PXTS887192）。本研究使用常规诊断检测后剩余的去标识化临床样本。由于本研究不影响患者的医疗、治疗分配或样本采集流程，因此免除了知情同意要求。材料表中列出了本方案所用的化学品、试剂和设备。
1. 标本采集与分析前评估
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常规实施数据集的特征
在研究期间，共有197例连续样本通过了入组资格筛选和分析前质量评估，并进入可报告的检测流程。研究队列包括98例患者，其中62例（63.3%）为B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），36例（36.7%）为急性髓系白血病（AML）。队列中男性64例（65.3%），女性34例（34.7%），中位年龄为32岁（四分位间距[IQR]，13–49岁；范围，2–73岁）。基线中位原始细胞比例为67.2%（IQR，56.9% – 80.2%）。
大多数分析样本为骨髓穿刺物（174/197，88.3%），而外周血样本占23/197（11.7%）。根据预设的监测时间点，86份样本（43.7%）在诱导治疗结束时采集，65份（33.0%）在巩固治疗期间采集，46份（23.4%）在造血干细胞移植（HSCT）前采集（表1）。
样本的中位存活率为88.3%（四分位距，84.4%–92.6%）。在数据清洗前，采集.......
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本研究的主要目的是建立一种用于急性白血病可测量残留病（MRD）多色流式细胞术评估的标准化工作流程。可靠的MRD评估不仅依赖于抗体组合的选择，还依赖于标本处理的一致性、采集参数的统一以及数据分析的规范性11。本研究结果表明，在常规临床实验室环境中，通过统一标本处理流程、控制数据采集深度以及采用分母校正的报告标准，可提高分析的可重复性。这些发现与近期致力于在不同机构和操作人员之间实现流式细胞术MRD评估标准化的努力相一致12。
该工作流程的一个重要环节是基于氯化铵的大量红细胞裂解步骤。稀有事件微小残留病（MRD）检测需要获取大量的细胞样本，以达到足够的分析灵敏度。标准化的大量裂解制备方法能够稳定地回收足够数量的有核细胞，通常获取的事件数超过100–150万个，同时保持可接受的样本活力。欧洲流式细胞术联盟（EuroFlow Consortium）先前的研究同样强调，高事件数采集对于实现灵敏且可重复的MRD检测至关重要13。对于分析灵敏度不理想的样.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢内江市第二人民医院临床检验科为本研究提供了实验室设施和技术支持。作者还感谢实验室工作人员和临床医务人员在样本处理与数据收集方面给予的协助。最后，作者感谢那些提供剩余临床样本以支持本项工作的患者。本研究未从公共、商业或非营利性资助机构获得任何特定资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 采集缓冲液 | 实验室制备的 | 含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS；最终重悬体积为500 µL | 流式细胞术检测前的最终重悬 |
| AML 1号管 CD117-APC 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：104D2；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同 | 早期髓系/原始细胞鉴定 |
| AML 管 1 anti-CD13-FITC 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：L138；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 髓系谱系锚定 |
| AML试管1抗CD33-PE抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：P67.6；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异 | 髓系谱系锚定 |
| AML管1抗CD34-PerCP-Cy5.5抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异 | 未成熟标志物 |
| AML 管 1 anti-CD45-APC-H7 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 白细胞骨架标记物与分母定义 |
| AML试管1抗CD56-V500抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：NCAM16.2；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 异常原始细胞相关表型分析 |
| AML 管 1 CD7-V450 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：M-T701；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异 | 跨谱系异常检测 |
| AML管1 抗-HLA-DR-PE-Cy7抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：G46-6；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同 | 成熟与亚型鉴别 |
| AML管2 抗CD117-APC抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：104D2；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同 | 早期髓系/原始细胞鉴定 |
| AML 管 2 anti-CD11b-V450 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖） / 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：ICRF44；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 成熟度不一致评估 |
| AML管2 抗CD13-FITC抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：L138；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异 | 髓系谱系锚定 |
| AML管2 CD15-V500抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：HI98；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 异常髓系模式评估 |
| AML试管2 抗CD33-PE抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：P67.6；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 髓系谱系锚定 |
| AML管2 抗-CD34-PerCP-Cy5.5抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 未成熟标志物 |
| AML管2 抗CD45-APC-H7抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 白细胞骨架标记物与分母定义 |
| AML试管2 抗HLA-DR-PE-Cy7抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：G46-6；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 成熟与亚型鉴别 |
| 基于氯化铵的红细胞裂解缓冲液 | 实验室制备 / 商业供应商 | 基于氯化铵的裂解缓冲液；每检测10 mL；室温下10分钟 | 大量红细胞裂解 |
| 分析软件 | 贝克曼库尔特（美国加利福尼亚州布雷亚） | Kaluza 2.1 | 数据分析与连续门控 |
| 全自动血液分析仪 | 商业供应商 | 用于有核细胞浓度和活力评估的全自动血液分析仪 | 有核细胞浓度与活力评估 |
| B-ALL 管 1 抗 CD10-PE 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：HI10a；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 前体B细胞定义 |
| B-ALL 第1管 CD19-FITC抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：SJ25C1；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | B系鉴定及进入前体细胞区室 |
| B-ALL 管 1 抗 CD20-APC 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：L27；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定存在差异 | 成熟模式评估 |
| B-ALL 第1管 CD34-PerCP-Cy5.5 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 未成熟标志物 |
| B-ALL 管 1 抗 CD38-PE-Cy7 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：HIT2；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 与再生的正常前体细胞的分离 |
| B-ALL 第1管 CD45-APC-H7 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 白细胞骨架标记物与分母定义 |
| B-ALL 第1管 CD58-V450抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：TS2/9；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 残余白血病前体细胞中的异常检测 |
| B-ALL 第1管 CD81-V500抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：JS-81；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 异常前体识别的支持 |
| B-ALL 第2管 CD10-PE 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：HI10a；荧光素：PE；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 前体B细胞定义 |
| B-ALL 第2管 CD123-V450抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：9F5；荧光染料：V450；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则进行 L/test | 异常前体细胞表型分析 |
| B-ALL 第2管 CD19-FITC抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：SJ25C1；荧光素：FITC；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则进行 L/test | B系鉴定及进入前体细胞区室 |
| B-ALL 第2管 CD20-APC 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：L27；荧光素：APC；染色体积：5 µ常规验证面板中除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 成熟模式评估 |
| B-ALL 第2管 CD34-PerCP-Cy5.5 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）／贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：8G12；荧光素：PerCP-Cy5.5；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 未成熟标志物 |
| B-ALL 第2管 CD45-APC-H7 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：2D1；荧光素：APC-H7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 白细胞骨架标记物与分母定义 |
| B-ALL 第2管 CD66c-PE-Cy7 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：KOR-SA3544；荧光素：PE-Cy7；染色体积：5 µ常规验证性检测面板中，除非抗体特异性滴定存在差异，否则使用 L/test | 白血病相关异常支持 |
| B-ALL 第2管 CD73/CD304*-V500 抗体 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 克隆：AD2/AZ1；荧光染料：V500；染色体积：5 µ常规验证面板中的 L/test，除非抗体特异性滴定有所不同 | 根据诊断表型进行的额外异常确认 |
| 骨髓/外周血标本 | 第二人民医院’内江市医院 | 剩余临床样本 | 微小残留病灶评估 |
| 补偿微珠 | 商业供应商 | 用于样本采集当天的单染补偿微珠 | 同日补偿对照制备 |
| 可固定活力染料 | 商业供应商 | 每支染色管中均含有可固定的活死染色染料 | 排除非活细胞；活力门控参见方案 3.7 和 5.4 |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | FACSCanto II / Navios EX | 多色流式细胞术数据采集 |
| 血细胞计数板 | 商业供应商 | 手动血细胞计数板计数 | 人工有核细胞计数 |
| PBS/BSA/EDTA 洗涤缓冲液 | 实验室制备的 | 含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA的磷酸盐缓冲液 | 细胞洗涤与重悬 |
| 台盼蓝溶液 | 商业供应商 | 台盼蓝排斥法 | 台盼蓝染色排除法手动评估细胞活力 |
| 经验证的抗体混合物 | BD 生物科学公司（美国新泽西州富兰克林湖）/ 贝克曼库尔特公司（美国加利福尼亚州布雷亚） | 参见下文的抗体特异性行及补充表S1 | 微小残留病免疫表型检测 |
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