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光激活与X射线激活脂质体用于可控基因编辑与药物递送

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DOI：

10.3791/71788

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2026年8月14日

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1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

本文内容

摘要

本方案描述了制备整合维替泊芬的脂质纳米颗粒的方法，该纳米颗粒可被可见光或X射线辐射激活，用于时空可控地递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物及化疗药物，在眼科和肿瘤学应用中具有潜在的转化价值。

摘要

光动力疗法（PDT）利用光敏剂的激活来产生活性氧（ROS），主要是单线态氧。除了直接的细胞毒性作用外，这种光化学反应还可被重新用于按需从脂质纳米载体系统中释放载荷，从而实现对治疗递送的时空控制，这是传统脂质纳米颗粒无法实现的。本方案介绍了两种整合了维替泊芬（VP）的脂质纳米颗粒制剂的制备与表征方法：（1）由DOTAP、DOPE、胆固醇和VP组成的光触发脂质体，用于递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物；（2）由DOTAP、DOPC、VP和金纳米颗粒组成的X射线触发脂质体，用于可控释放化疗药物。在690 nm（可见光）或临床X射线辐射（6 MeV）激活下，VP产生单线态氧，氧化不饱和脂质组分，破坏纳米颗粒膜的稳定性，从而释放包封的载荷。本方案提供了通过薄膜水化与膜挤出法制备脂质体、理化表征、光和X射线触发载荷释放评估、人源细胞体外基因敲除，以及利用定量斑马鱼视觉报告系统和小鼠异种移植肿瘤模型进行的体内验证等实验流程。代表性结果表明，通过光激活可在每条斑马鱼胚胎中实现约326根慢肌纤维的基因敲除，而通过X射线触发阿霉素释放可显著抑制肿瘤生长。临床上已在眼部使用689–690 nm波长激活维替泊芬，这为评估该平台用于眼科给药提供了依据，但其在视网膜的生物分布、药代动力学及大动物安全性仍有待进一步验证。这些方法为实现外部控制的治疗性载荷释放提供了一种具有转化潜力的实验策略。 

引言

脂质纳米颗粒（LNPs）已成为临床验证最充分的非病毒核酸治疗递送平台，这一点在 COVID-19 mRNA 疫苗中的应用已得到证实1。然而，传统 LNPs 在细胞通过内体逃逸摄取后即释放其载荷，无法对外部控制释放的时间、位置或程度进行调控2。这种缺乏时空控制的能力限制了其在需要精确、按需释放的治疗场景中的应用，例如位点特异性基因编辑、异质性肿瘤中的靶向化疗，以及对眼等解剖位置可及器官中的基因沉默进行剂量滴定3,4。

光动力疗法（PDT）为外部触发的生物学效应提供了一种成熟的作用机制。在特定波长激活后，光敏剂可产生活性单线态氧（1O2）及其他活性氧（ROS），从而氧化邻近的生物分子5。维替泊芬（VP）是一种苯并卟啉衍生物，已作为维速达尔（Visudyne）被临床批准用于治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）中的中心凹下脉络膜新生血管，尤其适合作为纳米颗粒光敏剂的组分6。在眼科光动力治疗中，VP的临床激活波长为689 nm，已有成熟的经眼递送光能的先例6,7,8。在组织穿透性波长下，VP的光动力活性约为第一代血卟啉衍生物的四倍6。

这种双重功能使得VP既能作为临床批准的光敏剂，又能作为纳米颗粒载荷释放的光响应触发因子，构成了本文所述方案的机制基础。当以较低摩尔比整合入脂质双分子层时，VP在光照下产生1O2，根据已有文献报道，该活性氧可氧化不饱和磷脂的酰基链，从而破坏膜稳定性并释放包封的载荷9。由于1O2的扩散半径较短（在生物环境中约为20 nm），膜的去稳定作用被限制在光敏剂附近的局部区域，可在有效破坏双分子层的同时最大限度减少对载荷的损伤9,10。此外，X射线激活模式克服了可见光组织穿透深度有限的问题。当金纳米颗粒（3–5 nm）共同嵌入脂质双分子层时，临床X射线辐照（6 MeV）可通过俄歇电子介导的能量转移增强VP的激活，从而将该技术的应用扩展至深部肿瘤11,12。利用单线态氧传感器绿（Singlet Oxygen Sensor Green, SOSG）进行的直接单线态氧检测证实，1O2的生成量随X射线剂量增加而上升，且与单独使用VP相比，共载金纳米颗粒时其生成量约增强1.4倍11。

该平台在眼科基因治疗领域具有特殊的转化意义。目前针对新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的抗VEGF治疗需要频繁进行玻璃体内注射，而在实际临床应用中，因长期治疗不足导致疗效下降13,14；尽管新兴的AAV基因疗法可减轻治疗负担，但其抗VEGF表达为持续性15,16，因此无法进行剂量调整或中止治疗。考虑到持续抑制VEGF与地图样萎缩、视网膜缺血及纤维化之间的关联，这一局限性值得关注17,18。采用VP脂质体的光触发CRISPR方法则可实现由临床医生控制的、空间受限的VEGF-A基因敲除，在保留基因编辑持久性的同时，提供对初始编辑事件在时间和空间上的临床可控性。相同的触发释放机制还可拓展应用于Stargardt病（ABCA4）19,20等大基因视网膜营养不良疾病以及葡萄膜黑色素瘤，其中VP的汇聚作用机制与肿瘤生物学特性高度匹配21,22。

本实验方案的总体目标是提供一套全面且可重复的方法，用于制备集成钒酞菁（VP）的脂质纳米颗粒，采用两种不同的配方，一种由可见光（690 nm）激活，另一种由X射线辐射激活，并在体外和体内模型系统中评估其递送效率。由于这两种配方在脂质组成、载药策略和激活方式上存在差异，因此分别作为独立的实验方案进行介绍。本方案适用于研究触发释放型纳米颗粒平台、基于光动力疗法（PDT）的递送策略、时空可控的基因编辑，或光激活眼科及肿瘤药物递送的研究人员。

方案

所有涉及斑马鱼的动物实验均在麦考瑞大学动物研究伦理委员会批准的方案（ARA：2015-034）下，按照标准条件进行。小鼠异种移植实验均符合麦考瑞大学动物伦理委员会的规定（批准号：2017/001）。所有操作均遵守1985年《动物研究法》和2010年《动物研究条例》。

第一部分A：光触发VP脂质体用于CRISPR-Cas9递送（基于Aksoy等人的研究9）

1. 制备光触发的包裹CRISPR-Cas9 RNP的VP脂质体

  1. 在圆底玻璃烧瓶中，将DOTAP、DOPE、胆固醇（Chol）和VP以1:0.94:1:0.06的摩尔比溶于500 µL氯仿中9。
    警告：氯仿具有毒性和挥发性。所有涉及氯仿的操作均须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备，包括丁腈手套和护目镜。
  2. 在氩气流下蒸发氯仿，直至烧瓶壁上形成一层薄脂膜。
  3. 将烧瓶置于真空环境中（例如连接真空泵的冻干机或干燥器）过夜（≥12 h），以彻底去除残留溶剂。
  4. 在500 µL无核酸酶水中加入sgRNA（终浓度0.01 µM）和Cas9蛋白（终浓度0.1 mg/mL）配制水合溶液9。在水合前，于室温预孵育sgRNA与Cas9 5分钟，以促进核糖核蛋白（RNP）复合物的形成。
    注意：RNP复合物在水合步骤中加载，而非在脂质体形成后添加。此方法可确保RNP被包封于脂质体的水相核心中。
  5. 将500 µL RNP溶液直接加入干燥脂膜中进行水合，并混匀至悬浮液均匀。将水合后的脂质悬浮液在室温下静置2小时，以确保脂质充分水合。
  6. 使用微型挤出器将所得的多层脂质体悬浮液通过200 nm聚碳酸酯膜挤出11次，以制备粒径均一的单层脂质体9。
    注意：本配方采用挤出法而非超声法进行粒径减小。应以奇数次（11次）通过膜，以确保最终产物位于膜与起始材料相对的一侧，从而减少未挤出囊泡的污染。
  7. VP-脂质体于4°C避光保存。为获得最佳活性，应在制备后48小时内使用。该48小时使用期限较为保守：在含10%胎牛血清（FBS）条件下，96小时内VP释放量仍低于3%9。
    注意：用于体外和体内实验时，应采用标准无菌技术制备和处理脂质体，并在使用前通过0.22 µm滤膜过滤以实现终产物的无菌化。

2. VP脂质体的理化表征

  1. 将脂质体悬浮液用无核酸酶水按1:100稀释。通过动态光散射（DLS）测定其流体动力学直径、多分散指数（PDI）和zeta电位。每个样品的DLS测量需进行三次技术重复（n = 3），结果以均值±标准差表示。
    注意：A部分成功配方的预期特征为流体动力学直径167.5 ± 1.9 nm，PDI < 0.3，zeta电位+28 ± 1.1 mV，Cas9包封效率约为75.09%。成功的配方的代表性理化特性总结于表1。9
  2. 进行透射电子显微镜（TEM）观察时，取10 µL稀释后的脂质体悬浮液滴加至覆碳铜网上，用2%醋酸铀染色20秒。在100 kV下成像，每批至少采集10张代表性图像。9
参数第 A 部分：VP-脂质体
（光触发）		第 B 部分：VP/AuNP-脂质体
（X 射线触发）
流体动力学直径167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
多分散指数（PDI）<0.3< 0.3（典型值）
泽塔电位+28 ± 1.1 mV正电性（基于 DOTAP）
包封效率Cas9 RNP：75.09%阿霉素：硫酸铵远程载药法；经 0.1% Triton X-100 裂解后定量测定
金纳米颗粒载量不适用每脂质体 156 ± 24 个 AuNP（ICP-MS 测定）
货物释放稳定性<3% VP 在含 10% FBS 条件下 96 小时内释放在 0%、10%、25% 和 50% FBS 中，以及 pH 7.4、6.0 和 5.0 条件下，48 小时内保持稳定
激活条件690 nm，0.15 mW/cm² LED 照射6 MeV 临床 X 射线照射
主要载荷CRISPR-Cas9 RNP 复合物阿霉素
激活方式可见光X 射线辐射
预期应用触发基因编辑触发化疗药物释放

表1：两种维替泊芬（VP）-脂质体配方的理化表征基准与稳定性特征。 光触发VP-脂质体配方（A部分）和X射线触发VP/AuNP-脂质体配方（B部分）的代表性配方特性、载药参数、稳定性特征及激活条件。这些数值为成功制备和表征配方提供了预期的质量控制基准，可在重复本文所述实验方案时作为参考标准。

3. 光触发的载荷释放与单线态氧检测

  1. 进行光触发释放实验时，使用相同的脂质配方及水合/挤出方案制备 VP-脂质体。将 100 µL 脂质体悬浮液加入 PBS 中，转移至透析装置内，并将装置置于 12 mL 持续搅拌（80 rpm）的 PBS 中。
  2. 使用波长为 690 nm 的 LED 光源，以 0.15 mW/cm2 的光强照射样品指定时间（2、4 和 6 分钟）9。
  3. 在 0、1、3、6 和 24 小时分别取外部透析液样品，通过荧光法测定释放的 VP 含量；使用 0.1% Triton X-100 裂解等量样品，测定总 VP 含量。
  4. 计算 VP 释放率：Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100，其中 Ft、F0 和 Fmax 分别表示时间为 t 时、基线值以及 Triton 裂解后的荧光值（n = 3）。
  5. 通过 DLS 测量照射前后流体动力学直径的变化，以确认膜的去稳定化效应。
    注意：在制备和储存过程中，所有含 VP 的样品均需避免暴露于环境光。请使用棕色管或铝箔包裹。

4. 体外转染与基因敲除实验

  1. 在96孔板中接种HEK293-GFP细胞（或相应的报告细胞系），接种密度以处理时细胞融合度约为70%为宜。将细胞培养于完全培养基（DMEM + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素）中，置于37°C、5% CO₂条件下培养2.
  2. 向各孔中加入含抗GFP sgRNA/Cas9 RNP的VP脂质体，终浓度为50 μg/mL。用于荧光显微镜分析时，孵育2小时；用于流式细胞术分析时，孵育1小时。
  3. 更换为新鲜的完全培养基。使用690 nm LED光源以0.15 mW/cm²照射处理孔。进行荧光显微镜分析时，分别照射2、4或6分钟；进行流式细胞术分析时，照射4分钟。设置暗对照组（含脂质体但不照射）和光对照组（仅照射但不含脂质体）。
  4. 在处理后48小时，通过荧光显微镜或流式细胞术评估GFP敲除效果。
    注意：在使用前应验证向导RNA的有效性。在原始研究中，通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析筛选候选eGFP向导的切割效率，所选向导（sg_eGFP_06）的切割效率达到88.24%。通过在计算机中验证向导序列的独特性（使用Bowtie/Bowtie2对参考基因组进行BLASTN比对，且3’端前10个碱基不允许错配），以最小化脱靶风险。尚未开展全基因组范围的脱靶测序，但建议在治疗转化研究中增加该步骤。9.
  5. 为测定包封率，离心 在4 °C、15,000 rpm条件下离心脂质体样品1小时，随后将上清液通过20 nm的Whatman Anotop 10注射器滤器过滤。
  6. 通过BCA蛋白测定法定量滤液中的游离（未包封）Cas9。
  7. 将包封效率计算为 EE (%) = [(C总 − Csup) / C总计] × 100，其中 C总 是添加的总Cas9量和Csup 上清液中回收的为无包被的Cas9。参见 表1 代表性配方性能指标及预期包封效率。

5. 体内验证：斑马鱼视觉报告基因检测

  1. 按照原始方案指定的比例，将包裹靶向 eGFP 的 sgRNA 的 VP-脂质体与 Cas9 蛋白混合，制备注射用主混合液（MasterMix）9。最终 8 µL 主混合液包含 3.5 µL sgRNA（75 ng/µL）、1.0 µL Cas9 蛋白（500 ng/µL）、2.5 µL VP-脂质体和 1.0 µL 酚红。对照组主混合液中，用 2.5 µL 无核酸酶水替代脂质体。
  2. 使用校准的显微注射系统，将 2 nL 主混合液注射至受精后单细胞期斑马鱼胚胎的细胞质（而非卵黄）中9。
    注意：所有斑马鱼操作均须在批准的动物伦理协议下进行。注射过程中应轻柔操作胚胎，以尽量减少机械损伤。
  3. 受精后 2 小时（hpf），使用 690 nm LED 光源以 0.15 mW/cm2 的光强照射注射后的胚胎，持续特定时间（例如 0、1、2 和 5 分钟），以激活载体释放9。
  4. 在 72 hpf 时，用 Tricaine 麻醉胚胎，并将其置于 1% 低熔点琼脂糖中进行固定。利用 smyhc1:eGFP 转基因报告品系，通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜，以 eGFP 荧光的缺失来定量慢肌纤维的基因敲除效果。
  5. 获取多焦点叠加图像，并统计每枚胚胎中 eGFP 阴性（即被敲除）的慢肌纤维数量，通常每组分析 16 枚胚胎（例如使用 Imaris 软件）9。
    备注：该检测可提供基因敲除效率的定量可视化读数。在 smyhc1:eGFP 报告品系中，慢肌纤维通常呈 eGFP 阳性；成功敲除表现为这些纤维中 eGFP 荧光的丧失9。

第二部分：X射线触发的VP脂质体用于化疗药物递送（基于Deng等人的研究11）

6. 制备负载阿霉素的X射线触发型VP/AuNP-脂质体

  1. 在玻璃圆底烧瓶中加入 350 µL DOTAP（氯仿中 100 mg/mL）和 370 µL DOPC（氯仿中 100 mg/mL），再用氯仿定容至总体积 1.0 mL11。
    注意：B 部分使用 DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱），而非 DOPE。这两种配方的辅助脂质不同，这一区别对可重复性至关重要。
  2. 向脂质混合物中加入 50 µL VP（DMSO 中 2.3 mg/mL）和 40 µL 金纳米颗粒悬浮液（直径 3–5 nm）。根据 ICP-MS 定量，这将产生每个脂质体约 156 ± 24 个金纳米颗粒11。
    注意：金纳米颗粒的直径必须为 3–5 nm，才能嵌入脂双层中。较大的颗粒（例如 50 nm）无法整合到膜中，也无法介导 X 射线激活所需的俄歇电子能量转移11。
    注意：此处描述的基础配方为非靶向型。在原始研究中，通过后续插入 DSPE-PEG2000-叶酸实现了可选的主动靶向修饰，以引导脂质体靶向叶酸受体表达的肿瘤细胞；该步骤可在不改变核心 VP/AuNP 释放机制的前提下添加11。
  3. 按照步骤 1.2–1.3 所述，在氩气下蒸发氯仿，并在真空条件下过夜干燥。
  4. 用 1.0 mL 250 mM 硫酸铵缓冲液（pH 5.5）水化脂质膜。涡旋混匀，将水化后的悬浮液静置过夜，然后通过 200 nm 聚碳酸酯膜挤出 11 次11。
  5. 在 4 °C 条件下，用 PBS（pH 7.4）透析并更换缓冲液四次，以去除游离的硫酸铵，建立跨膜硫酸铵梯度。
  6. 通过将透析后的脂质体在药物与脂质质量比为 1:10 的条件下于 60 °C 孵育 1 小时，实现阿霉素（Dox）的载药11。硫酸铵梯度驱动 Dox 在脂质体内部富集。
  7. 在 4 °C 条件下，用 PBS 透析并更换缓冲液四次，以去除未包封的 Dox。
  8. 采用动态光散射（DLS）对载药脂质体进行表征（预期粒径：~100–150 nm），并通过加入 0.1% Triton X-100 裂解脂质体后测定 Dox 荧光强度（激发波长 485 nm，发射波长 590 nm）来计算包封效率 。
    注意：成功的 B 部分配方通常表现出约 100–150 nm 的流体动力学直径、PDI < 0.3，并且每个脂质体整合约 156 ± 24 个金纳米颗粒。代表性理化特性总结于表 1中11。

7. X射线触发的药物释放及体外细胞毒性

  1. 使用临床直线加速器（6 MeV 光子束）在设定剂量（1、2 和 4 Gy）下照射负载钙黄绿素的 VP/AuNP-脂质体11。通过测量钙黄绿素荧光（激发波长 485 nm，发射波长 510 nm）来定量货物释放，并在用 0.1% Triton X-100 破坏后获得总释放量。"
  2. 进行细胞毒性实验时，将 HCT116 人结直肠癌细胞接种于 96 孔板中（例如，10% FBS 中 2 × 104 个细胞/mL）。
  3. 用载药阿霉素的 VP/AuNP-脂质体处理细胞，并按上述方法进行 X 射线照射，同时设置仅脂质体阿霉素（LipoDox-only）、仅 X 射线照射（X-ray-only）及未处理对照组。在 4 Gy 照射后 0、2、4 和 24 小时，通过 MTS 法检测细胞活力11。

8. 体内验证：小鼠异种移植肿瘤模型

  1. 在6至7周龄的雌性BALB/c裸鼠的侧 flank 部位皮下接种100 µL无血清McCoy’s 5A培养基中的5 × 106 个HCT116细胞11。
  2. 当肿瘤体积达到约100 mm3时，在肿瘤内注射相当于10 mg/kg多柔比星（Dox）剂量的Dox负载VP/AuNP脂质体，注射体积为20 µL11。
  3. 注射后24小时，使用临床直线加速器对肿瘤进行4 Gy X射线照射（6 MeV），并对非靶组织采取适当的屏蔽保护。
  4. 每2天使用数显卡尺监测一次肿瘤体积。肿瘤体积计算公式为V = (π/6) × L × W2，其中L为最长径，W为垂直宽度11。
  5. 实验终点时，切除肿瘤组织，用10%中性缓冲甲醛固定，并制备6 µm厚的冷冻切片用于组织学分析（H&E染色）11。

9. 统计分析

  1. 定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示，除非另有说明。
  2. 斑马鱼基因敲除研究的统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），而两组之间的比较则采用双尾 Student t 检验，具体方法如原始研究所述。统计学显著性定义为 p < 0.05。
  3. 对于X射线触发脂质体研究，肿瘤生长、体重、载药释放及组织学数据集的分析均采用 Student t 检验，方法见原始出版物描述。
  4. 每个实验的 n 值定义均在相应图注中提供。
  5. 统计分析使用 GraphPad Prism 7.0 版本（GraphPad Software）完成。
    注意：本实验方案重现了先前已发表研究中的实验流程和代表性数据集。读者应在适用情况下参考原始出版物以获取完整的统计分析细节9,11。

结果

光触发基因编辑（A部分）：

按照A部分的实验方案，封装CRISPR-Cas9 RNP的VP脂质体表现出光依赖性的货物释放。在黑暗条件下释放极少，而在690 nm（0.15 mW/cm2）照射下则呈现剂量依赖性释放，且随着光照时间延长而增加（图1A）9。斑马鱼eGFP报告基因检测提供了基因敲除效率的定量可视化读数。光激活胚胎每胚胎平均敲除308.37 ± 40.21个eGFP阳性慢肌纤维，而黑暗对照组为53.15 ± 35.38个纤维（n = 80），经5分钟光照后增至326.12 ± 36.55个纤维（n = 60）（图1B、C）9。体外实验中，光激活的VP脂质体实现的GFP敲低效果与Lipofectamine 2000相当（约降低53%对比50%），同时独特地提供了光控时空调控能力（图1C）9。这些结果表明具有时空控制性，因为相同的纳米颗粒制剂在有无光照条件下产生了显著不同的基因敲除效率（图1A–C）。

光化学基因编辑方法；CRISPR-Cas9，LED诱导，荧光显微镜，实验结果，强度测量。
图1。光触发的CRISPR-Cas9递送及斑马鱼胚胎中的时空特异性基因敲除。（A）包裹Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物的维替泊芬（VP）脂质体（DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06）示意图。在690 nm光照下，VP产生活性氧，破坏脂质体膜稳定性，从而触发CRISPR-Cas9货物在细胞内的释放。（B）经VP脂质体处理并接受不同光照时间（0、1、2和5分钟；690 nm，0.15 mW/cm2）后，smyhc1:eGFP斑马鱼胚胎在受精后72小时（hpf）的代表性荧光图像。eGFP荧光的减弱表明慢肌纤维基因被敲除。插图为方框区域的放大视图。（C）荧光强度及每胚胎中被敲除的慢肌纤维数量的定量分析，显示CRISPR-Cas9的激活和基因敲除具有光依赖性。数据以均值±标准差表示。斑马鱼实验采用单因素方差分析（n = 80个胚胎用于荧光强度测量，n = 60个胚胎用于纤维计数分析；p < 0.0001）。HEK293-GFP验证实验采用双尾t检验（n = 4）。比例尺 = 500 µm（整体图像）和100 µm（放大图像）。经Aksoy等9许可改编。版权所有 © 2020 美国化学会。 请点击此处查看该图的放大版本。

斑马鱼实验中可能出现的非理想结果包括：(a) 每个胚胎中受损肌纤维少于50条，提示脂质体质量不佳、Cas9活性不足或光照剂量不理想；(b) 胚胎死亡率超过20%，提示显微注射过程中存在机械损伤或VP光毒性过强；(c) 未受照射的对照组中出现受损肌纤维，提示脂质体配方存在过早的载物泄漏。

X射线触发的药物递送（B部分）：

根据B部分方案制备的VP/AuNP-脂质体在1–4 Gy剂量范围内表现出剂量依赖性的钙黄绿素释放（图2A，B）11。在HCT116异种移植模型中，接受载药阿霉素（Dox）的VP/AuNP-脂质体并随后进行4 Gy X射线照射的小鼠，其肿瘤生长抑制效果显著优于游离Dox组、单独X射线照射组以及未照射的脂质体对照组（图2C）11。对肿瘤组织切片进行组织学分析，通过H&E染色评估发现，联合治疗组的坏死区域更大（图2D）。

X射线靶向脂质体治疗癌症；钙黄绿素释放、肿瘤大小、坏死分析图示。
图2．X射线触发的阿霉素释放及肿瘤生长抑制。（A）含阿霉素（Dox）并整合了维替泊芬（VP）/金纳米颗粒（AuNP）的脂质体示意图。X射线照射通过AuNP介导的能量转移激活VP，产生活性氧单线态氧，破坏脂质双分子层，从而触发药物释放。（B）脂质体在不同X射线剂量（0–4 Gy）照射下的钙黄绿素释放曲线，显示VP/AuNP脂质体具有剂量依赖性的药物释放行为。误差棒表示四次测量的标准差。（C）经PBS、LipoDox、单独X射线或X射线触发LipoDox处理的荷HCT116异种移植瘤小鼠的肿瘤体积（左）和体重（右）测量结果。数据以均值±标准差表示（n = 每组4只小鼠）。采用t检验评估统计学显著性（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）。（D）代表性苏木精-伊红（H&E）染色肿瘤切片及平均肿瘤坏死区域的形态计量分析。箭头指示典型的坏死区域。箱形图显示中位数和四分位距，须线延伸至1.5 × IQR。数据采用t检验分析（n = 5）。比例尺 = 50 µm。改编自Deng等11，遵循Creative Commons Attribution 4.0 International License条款。请点击此处查看此图的放大版本。

在异种移植模型中，结果不理想的情况可能包括：（a）经照射与未经照射的脂质体组之间肿瘤生长无差异，提示VP介导的释放不足或金纳米颗粒掺入不充分；或（b）全身毒性（体重减轻 > 15%），提示阿霉素在X射线激活前从脂质体中泄漏。

讨论

这些方案中的多个步骤对成功至关重要。在A部分中，脂质摩尔比（DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06）必须精确维持，因为VP浓度直接决定1O2的生成量，进而影响货物释放效率9。Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）应在水合步骤中加载，而非在囊泡形成后通过复合方式加入，这是实现水相核心包封的关键。通过200 nm聚碳酸酯膜进行11次挤出可获得均一的单层囊泡；不应以超声处理替代，因其可能导致Cas9蛋白变性。在B部分中，金纳米颗粒的尺寸（3–5 nm）至关重要，颗粒必须足够小，以便嵌入脂双层中，从而在X射线照射下实现有效的俄歇电子介导的能量转移至VP11。用于阿霉素（Dox）加载的硫酸铵梯度法要求在加药前彻底透析去除外部的硫酸铵；透析不完全将降低载药效率。

可在保持VP介导释放机制的同时，针对不同应用调整脂质组成。例如，将部分DOTAP替换为聚乙二醇化脂质（如5 mol%的DSPE-PEG2000）可能延长全身给药后的血液循环时间，但会降低表面正电荷，可能减少体外细胞摄取2。如果DLS测量结果显示PDI > 0.3，应增加挤出次数或验证膜完整性。尽管VP正确掺入但单线态氧生成量较低时，应使用校准过的功率计验证LED光源的波长和功率密度，因为VP的激活具有波长特异性（Soret带峰值激发波长为425 nm，Q带治疗激活波长为689–690 nm）9。在斑马鱼实验中，若处理组胚胎死亡率超过20%，应减少注射体积或脂质体浓度，以尽量降低VP相关的光毒性。基于表1中基准值的结构化故障排查框架如下：PDI > 0.3：增加挤出次数并验证膜完整性；尽管VP正确掺入但仍触发释放效果低或无释放：使用校准功率计确认690 nm输出，并核实VP摩尔比；每胚胎敲除的慢肌纤维少于约50根：重新制备脂质体，确认RNP活性，或延长照射时间；未照射对照组中eGFP信号丢失：检查储存条件，使用制备后48小时内并在4°C避光保存的脂质体，并确认膜稳定性。在异种移植模型中，若照射组与未照射脂质体组之间无差异，需确认3–5 nm金纳米颗粒是否成功嵌入，并核实所递送的X射线剂量。

光触发模式（A部分）的主要局限性在于690 nm光的穿透深度，这限制了其只能直接激活表层可及的组织或可通过光纤递送光的组织5。X射线触发模式（B部分）克服了这一深度限制，但需要使用临床直线加速器，并会使周围组织暴露于电离辐射，尽管剂量处于治疗水平11,12。目前两种制剂均依赖DOTAP，这是一种与剂量依赖性细胞毒性相关的阳离子脂质，可能限制系统给药的治疗窗口2。RNP介导的基因编辑具有瞬时性，这在安全性方面具有优势，但也意味着若靶细胞群体中的基因敲除不完全，则无法通过在同一部位重复给药来增强效果，除非重新给予纳米颗粒。此外，这些方案已在细胞系和小动物模型中得到验证；向更大动物模型乃至最终的人体临床应用转化，还需进行制剂优化、药代动力学研究以及符合GLP条件的正式毒理学评估。特别是，本方案未包含药代动力学、生物分布或视网膜穿透数据。尽管文献中已充分表征光在眼组织及其他组织中的穿透特性，其受波长、色素沉着和组织类型的影响（并可通过光学透明剂增强），但在得出具有转化意义的结论之前，定量的药代动力学、生物分布和视网膜递送研究仍是重要的下一步工作。

传统的脂质纳米颗粒（LNP）系统（包括mRNA疫苗中使用的系统）在细胞通过内体逃逸摄取后被动释放载荷，无法对递送的时间和空间进行控制1,2。病毒载体（如AAV）可实现高效的基因递送，但受限于包装容量（约4.7 kb）、重复给药时的免疫原性，以及给药后无法调节的持续性外源基因表达3。VP-脂质体平台通过提供一种不依赖载荷类型、可外部控制的释放机制，克服了上述局限，该平台适用于大分子载荷（如蛋白质、RNP复合物和小分子），且为非病毒载体，可能适用于重复给药，具体需依据重复给药的免疫原性和毒理学研究结果而定。 与光遗传学或热响应系统不同，基于VP的方法利用了一种已在临床上获批的光敏剂，具有明确的安全性数据，并可兼容现有的临床激光设备，尤其在眼科领域，689 nm的Visudyne激光器已是标准设备6。Sang等人进一步证明，含VP的脂质-聚合物杂化纳米颗粒可增强结直肠癌模型中的放射动力治疗效果，证实了VP介导的活性氧（ROS）生成在不同纳米颗粒结构中的可适配性12。

本文所述方法对三种眼科疾病具有特殊意义。在新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）中，抗VEGF注射治疗的负担仍是实现最佳疗效的关键障碍。真实世界登记数据显示，与临床试验方案相比，治疗明显不足（第一年平均注射7.3次，而临床试验为12次，38.8%的患者中断治疗，且视力改善极小）14，即使频繁给药，长期视力仍呈下降趋势23。目前正在开发的AAV基因疗法旨在减轻这一负担——如ixoberogene soroparvovec15、ABBV-RGX-31416以及获得RMAT认定的4D-150（注射次数减少83%）24——但这些疗法持续表达抗VEGF转基因，无法进行剂量调整或终止治疗。鉴于已有证据表明持续抑制VEGF与地图样萎缩相关（CATT研究17；一项纳入4,609只眼的荟萃分析18；八年随访中萎缩发生率升至78.3%25），这可能构成潜在风险。相比之下，采用光触发的VP脂质体系统递送靶向VEGF-A的CRISPR-Cas9，可实现空间限定的基因敲除，在保留基因编辑持久性的同时，由临床医生控制初始编辑事件的空间和时间开关。 临床前研究支持该策略的可行性。脂质纳米颗粒（LNP）共递送靶向VEGFA的Cas9 mRNA和sgRNA，可减少小鼠激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）26；PEG修饰的LNP变体可在视网膜色素上皮（RPE）中实现基因组编辑27；肽引导的LNP可在非人灵长类动物中将mRNA递送至光感受器细胞28。然而，截至2026年初，尚无基于LNP的视网膜基因疗法进入临床试验29，凸显了该领域的转化潜力。在Stargardt病中，约6.8 kb的ABCA4编码序列超出AAV的包装容量，需采用双载体策略，但转导效率降低19。目前的临床候选药物包括双AAV平台SB-007和VG80130，以及不依赖基因的调节疗法OCU410ST31。非病毒核酸递送可绕过AAV的包装限制。携带ABCA4质粒的PEG-ECO纳米颗粒可减少Abca4-/-小鼠中A2E的积累20，其他研究也已证实大尺寸视网膜DNA构建体的递送32以及LNP介导的mRNA在眼组织中的表达33。由于黄斑和中央凹的局部治疗足以维持中心视力，VP脂质体非常适合将高浓度的基因治疗载荷精确递送至这些区域。在葡萄膜黑色素瘤中，维替泊芬通过三种互补机制发挥作用：光动力疗法（PDT）介导的细胞毒性、YAP/TAZ通路抑制（YAP1表达与最强的转移标志物——3号染色体单体和BAP1缺失——密切相关）21，以及通过cGAS-STING通路激活诱导免疫原性细胞死亡。将VP介导的YAP抑制与PDT联合抗PD-L1治疗，可将免疫“冷”肿瘤转化为免疫“热”肿瘤，在原位模型中显著抑制肿瘤生长并延长生存期22。这些发现与既往报道的维替泊芬PDT作为脉络膜黑色素瘤一线治疗80%的应答率一致34。眼睛对689 nm光的光学可及性，加上大多数葡萄膜黑色素瘤位置明确，使VP脂质体成为递送局部治疗的有前景平台，同时可能降低当前近距离放疗和质子束治疗相关的并发症风险。

除了上述讨论的眼科和肿瘤学应用外，VP脂质体平台还可适用于任何需要外部控制、按需释放载荷的治疗场景。潜在应用包括通过经皮照射可及的皮肤疾病中的光触发基因编辑、与临床放射治疗分次时间表同步的X射线触发化疗药物释放，以及发育生物学研究中的空间模式化基因敲除。已有多种光可激活基因编辑系统在非视网膜组织中得到验证，包括Mag-ABE光可激活碱基编辑器，用于体内时空可控的基因组编辑35，以及近红外光激活的上转换纳米粒子系统，用于时空可控的CRISPR-Cas9编辑和光动力治疗36。在眼科学领域，人们对持久性VEGF抑制策略的兴趣日益增加，这进一步凸显了递送系统的需求——这类系统需兼具长期治疗效果与对外源性生物活性时间及空间位置的精确控制37。将这些制备方法与新兴的视网膜LNP递送技术及光可激活基因编辑系统相结合，代表了多个已验证组件的融合，其在眼部的联合应用仍是一个开放且可能具有高影响力的研究前沿。我们课题组目前的研究工作正致力于优化适用于视网膜下腔和玻璃体腔递送的制剂配方，评估其在大型动物眼科模型中的安全性，并将X射线触发模式调整为可与临床肿瘤学中的标准放射治疗方案同步使用。

披露

Y.A.A. 是 EosGene Therapeutics Pty Ltd 的董事兼联合创始人，该公司持有与本文所述光激活脂质纳米颗粒技术相关的专利。E.M.G. 和 W.D. 是 EosGene Therapeutics 的联合创始人。

致谢

作者感谢麦考瑞大学斑马鱼设施（斑马鱼实验）和麦考瑞大学动物伦理委员会提供的设施与技术支持。本工作部分得到了澳大利亚研究理事会纳米级生物光子学卓越中心（CE140100003）的资助。作者还感谢EosGene Therapeutics Pty Ltd提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20 nm 过滤膜（Anotop 10 或同等产品）Whatman (Cytiva)N/A用于包封效率测定过程中游离 Cas9 的分离
690 nm LED 光源ThorlabsM690L4触发 VP 介导的脂质体货物释放的光源；可调节功率密度
抗生素–抗真菌剂（100X）Thermo Fisher Scientific15240062细胞培养添加剂；终浓度为 1%
氩气钢瓶及减压阀N/AN/A用于脂膜制备过程中的溶剂蒸发
Avanti Mini 挤出仪Avanti Polar Lipids610000手动挤出系统，配合 200 nm 聚碳酸酯膜用于脂质体粒径均一化
BALB/c 裸鼠（雌性，5–6 周龄）Animal Resources CentreN/A免疫缺陷小鼠，用于 HCT116 异种移植肿瘤模型
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Fisher ScientificN/A用于游离 Cas9 定量及包封效率测定
Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统Bio-Rad Laboratories12003154凝胶与蛋白印迹成像系统
钙黄绿素（Calcein）Sigma-AldrichC0875释放实验用荧光染料；高浓度下具有自猝灭特性
Cary 5000 紫外-可见-近红外分光光度计Agilent TechnologiesN/A脂质体与维替泊芬的紫外-可见吸收光谱分析
CCD841 CoN 细胞（人正常结肠上皮细胞）ATCCCRL-1790正常结肠上皮细胞系；作为非癌对照
氯仿Sigma-Aldrich288306用于脂膜制备的有机溶剂
胆固醇Sigma-AldrichC8667光触发制剂中脂质体膜的组分
临床直线加速器（6 MeV 光子束）Varian Medical SystemsN/A用于辐照研究的临床 X 射线源
数显卡尺N/AN/A用于异种移植肿瘤体积测量
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich472301维替泊芬储备液配制用溶剂
DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）Avanti Polar Lipids850375PX 射线触发制剂中使用的脂质组分
DOPE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺）Sigma-AldrichP1223光触发制剂中使用的辅助脂质
DOTAP（1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷）Avanti Polar Lipids890890P两种制剂中均使用的阳离子脂质
盐酸多柔比星Sigma-AldrichD1515装载于 X 射线触发脂质体中的化疗药物
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PX 射线触发制剂中使用的聚乙二醇化脂质
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Thermo Fisher Scientific11965092HEK293 和 PC12 细胞的细胞培养基
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）Thermo Fisher Scientific14190144洗涤缓冲液
胎牛血清（FBS）Thermo Fisher Scientific10099141细胞培养添加剂；终浓度为 10%
Fluorolog-Tau3 荧光光谱仪HORIBA ScientificN/A用于维替泊芬表征的荧光光谱分析
焦点堆叠软件（例如 Zerene Stacker）N/AN/A用于斑马鱼成像中焦点堆叠图像的生成
冷冻干燥机（Alpha 1-4 LDplus）Martin Christ / John Morris ScientificN/A用于真空干燥和溶剂去除
GFP sgRNAThermo Fisher ScientificA35943靶向 eGFP 的单导向 RNA；用于基因敲除验证
金纳米颗粒（3–5 nm，柠檬酸盐稳定）NanoComposixN/AX 射线触发制剂中使用的放射增敏剂
GraphPad PrismGraphPad Software7.0统计分析与数据可视化
HCT116 细胞（人结直肠癌细胞）ATCCCCL-247用于体外和体内研究的结直肠癌细胞系
HEK293/GFP 细胞GenTargetSC001稳定表达 GFP 的细胞系，用于 CRISPR 基因敲除验证
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570细胞核染色剂；工作浓度为 5 µg/mL
图像分析软件（例如 Imaris）Bitplane (Oxford Instruments)N/A用于敲除慢肌纤维的定量分析
ImageJ/Fiji美国国立卫生研究院（NIH）开源图像分析软件
倒置荧光显微镜Leica MicrosystemsDMi3000用于斑马鱼报告基因成像和 GFP 荧光评估
IVIS SpectrumCT 活体成像系统PerkinElmer128201活体荧光成像系统
JEOL JEM-1400 透射电子显微镜JEOLJEM-1400脂质体的透射电镜成像
Leica SP2 共聚焦显微镜Leica MicrosystemsN/A细胞摄取的共聚焦成像
低熔点琼脂糖N/AN/A用于成像过程中斑马鱼胚胎的固定
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019作为阳性对照使用的转染试剂
Living Image 软件PerkinElmerN/A图像采集与分析软件
McCoy's 5A 培养基Thermo Fisher Scientific16600082HCT116 细胞的细胞培养基
显微注射系统N/AN/A用于单细胞期斑马鱼胚胎的显微注射
MTS 细胞增殖检测试剂盒PromegaG3582细胞活力检测
NanoDrop 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-2000RNA 纯度与浓度测定
无核酸酶水Thermo Fisher ScientificR0582用于 CRISPR-Cas9 RNP 的制备
Opti-MEM 减血清培养基Thermo Fisher Scientific31985070转染培养基
多聚甲醛（4%）Sigma-AldrichP6148组织学分析用固定剂
PC12 细胞（大鼠嗜铬细胞瘤细胞）ATCCCRL-1721用于摄取研究的类神经元细胞系
聚碳酸酯膜滤器（200 nm）Avanti Polar Lipids610006用于脂质体粒径控制的挤出膜
RNeasy Plus Mini 试剂盒QIAGEN74134RNA 提取试剂盒
单线态氧传感器绿色染料（SOSG）Thermo Fisher ScientificS36002用于单线态氧检测的荧光探针
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置（10 kDa 截留分子量）Thermo Fisher Scientific69570用于脂质体制备和药物装载的透析装置
SYBR Gold 核酸凝胶染色剂Thermo Fisher ScientificS11494核酸凝胶染色剂
Tg(ubi:EGFP) 斑马鱼斑马鱼国际资源中心ZDB-GENO-080606-2用于活体 CRISPR 验证的转基因斑马鱼
TNF-α（人重组）Life TechnologiesRTNFAI用于 TNFAIP3 诱导研究的细胞因子
TNFAIP3 sgRNAThermo Fisher ScientificN/A靶向 TNFAIP3 的 sgRNA
三卡因甲磺酸盐（MS-222）N/AN/A成像前用于斑马鱼的麻醉剂
曲拉通 X-100Sigma-AldrichT8787用于脂质体裂解和释放实验的去垢剂
TrueCut Cas9 蛋白 v2Thermo Fisher ScientificA36498用于 CRISPR-Cas9 RNP 制备的 Cas9 核酸酶
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Thermo Fisher Scientific25200056细胞解离试剂
醋酸铀（2%）Electron Microscopy Sciences22400透射电镜成像用负染剂
维替泊芬Sigma-AldrichSML0534-5MG掺入脂质体制剂中的光敏剂
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600动态光散射与 zeta 电位测量

参考文献

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